Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Diyet Lipid Emiliminin ve Şilomikron Sekresyonunun İn Vivo Kinetiğini Ölçmek için Farelerde Akan Mezenterik Lenflerin İzolasyonu

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64338
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, School of Medicine, University of Pittsburgh

Summary

Bu protokol, farelerde intraduodenal besin infüzyonlarına yanıt olarak akan bağırsak lenfini izole etmek için ayrıntılı bir cerrahi protokolü tanımlamaktadır. Bu, çeşitli deneysel besinlere yanıt olarak toplam bağırsak lipit emiliminin ve şilomikron sentezinin ve sekresyonunun fizyolojik olarak belirlenmesini sağlar.

Abstract

Bağırsak lipoproteinleri, özellikle trigliserit bakımından zengin şilomikronlar, metabolizma, inflamasyon ve kardiyovasküler hastalıkların önemli bir itici gücüdür. Bununla birlikte, bağırsak lipoproteinlerinin izole edilmesi in vivo olarak çok zordur, çünkü ilk önce ince bağırsaktan mezenterik lenfatiklere salgılanırlar. Şilomikron içeren lenf daha sonra yemeğin bileşenlerini kalbe, akciğerlere ve nihayetinde tüm vücut dolaşımına iletmek için torasik kanaldan subklaviyen damara boşalır. Naif şilomikronları izole etmek kandan imkansızdır, çünkü şilomikron trigliserit, dolaşımdaki lipoprotein lipaz ve diğer lipoprotein reseptörleri ile etkileşime girdikten hemen sonra hidrolize uğrar. Bu nedenle, sıçanlarda Bollman ve ark. tarafından tanımlanan orijinal 2 günlük lenf fistül prosedürü, tarihsel olarak torasik ven içine girmeden önce taze mezenterik lenfleri izole etmek için kullanılmıştır. Bu protokol, son 45 yıldır Patrick Tso'nun laboratuvarı tarafından geliştirilmiş ve profesyonelleştirilmiştir ve bu kritik lipoproteinlerin ve bağırsaktan salgıların analizine izin verilmiştir. Tso lenf fistül prosedürü güncellendi ve ilk kez görsel olarak burada sunuldu. Bu revize edilmiş prosedür, bir duodenal besleme tüpü takmak, mezenterik lenf kanalını kanüle etmek ve bilinçli farelerde bir yemekten sonra lenf toplamak için tek günlük bir cerrahi tekniktir. Bu yeni tekniklerin başlıca faydaları arasında farelerden lenf reproducibly toplama yeteneği (genetik fare modellerinin gücünden yararlanır); duodenal infüzyon tüpünün ve lenf kanülünün implantasyonu sırasında fareler için azaltılmış anestezi süresi; beslenme ve post-prandial dönem boyunca lenfleri sürekli örnekleme yeteneği; kandaki seyreltme ve enzimatik hidrolizden önce hormonları ve sitokinleri nicel olarak ölçme yeteneği; ve bağırsak lipoproteinlerini izole etmek için büyük miktarlarda lenf toplama yeteneği. Bu teknik, diyet besin emilimini, bağırsak lipoprotein sentezini ve şilomikron sekresyonunu doğrudan ve nicel olarak ölçmek için güçlü bir araçtır.

Introduction

Mezenterik lenfatik sistemin fizyolojik önemi
Mezenterik lenfatikler, Herophilos'un hepatik portal sistemi ve tüm "bağırsaklardaki emici damarları" tanımladığı ~ M.Ö. 300'den beri bir şekilde tanımlanmıştır1,2,3,4,5. Bu ilk tanımlamadan sonra 1.700 yıldan fazla bir süredir, bağırsak lenfatiklerinin tanımlayıcı bir özelliği, bir yemekten kısa bir süre sonra mezenterik lenfte sütlü sıvının varlığıydı3. Artık sütlü, şilomikron içeren lenflerin ("şilous" lenf) portal ven ve karaciğere boşalmadığı, bunun yerine sarnıç şilisinden torasik kanala geçtiği ve nihayetinde sol subklaviyen ven6'daki kana katıldığı bilinmektedir. Bu anatomik düzenleme nedeniyle, şilokus lenf vücudun geri kalanında dolaşmadan önce önce kalp ve akciğerlerden geçer. Bu, kalbin ve akciğerlerin salgılarında mezenterik lenf7'ye "ilk geçiş" yaptığı anlamına gelir.

Mezenterik lenfatiklerin önemli bir rolü, diyet lipitlerinin ince bağırsaktan taşınmasıdır 8,9,10. Anatomik olarak, şilomikronlar, bağırsak bağışıklık hücreleri 11,12,13,14, bağırsak hormonları 15,16,17,18, antijenler 19,20,21, şilomikron olmayan lipofilik bileşikler22,23 ve fazla sıvı enterosit bazal membranının altında yatan lakteallere girer ve daha sonra lenfatik kılcal damarlardan mezenterik lenf nodlarına konsantre edilir. Muhtemelen metabolitler, antijenler, çevresel kirleticiler, besinler ve sinyal molekülleri dahil olmak üzere bilinmeyen birçok mezenterik lenfatik bileşen vardır.

Mezenterik lenf bileşenleri, büyük ölçüde mezenterik lenflerin izole edilmesinin zorluğu nedeniyle sistematik olarak tanımlanmamıştır. Mezenterik lenflere erişmek her zaman ciddi bir zorluk olmuştur, çünkü lenf kanalları renksizdir ve şilokus ve sütlü hale geldiklerinde yağlı bir yemekten sonra hariç, mezenterik lenfatikler renksiz lenfatik sıvı içerir 6,8,9,10.

Bağırsak lenfini izole etmek için güncel ve yaygın yöntemler
İnsanlarda mezenterik lenfe erişilemez (ciddi GI travmasının meydana geldiği nadir ve aşırı durumlar hariç)24. İn vivo lenf toplanması cerrahi olarak karmaşık ve zordur. Orijinal 2 günlük lenf fistül prosedürü Bollman ve ark.25 tarafından tanımlanmıştır ve son 45 yıldır Patrick Tso'nun laboratuvarı tarafından geliştirilmiş ve profesyonelleştirilmiştir26,27. Lenf fistülü prosedürü, araştırmacıların 6 saatlik duodenal lipid infüzyon süresi boyunca bilinçli hayvanlardan akan lenfleri toplamasına izin verir.

Lenf fistül modeli esas olarak sıçanlarda lenf akış hızını, trigliserit ve kolesterolün (veya diğer duodenal infüzyonlu bileşiklerin), şilomikron bileşiminin ve bağırsak hormonu konsantrasyonlarının çıkışını ölçmek için kullanılmıştır. Daha az ölçüde, bu teknik farelerde de kullanılabilir, ancak cerrahi sağkalım ve lenf hacmi acı çeker. Mezenterik lenf kanallarını görmedeki zorluklar nedeniyle, tarihsel yöntemler mini domuzlar28, koyun 29, domuz30, köpekler31 ve sıçanlar17 gibi daha büyük hayvanlarda mezenterik lenflerin kanüle edilmesini içermektedir. Bu daha büyük modellerle çalışmak kaynak yoğundur ve nakavt veya nakavt modellerinde çalışmalara izin vermez.

Alternatif yaklaşımlar da kullanılmıştır. Şilomikronlar post-prandial durumda kandan izole edilebilir (ancak bunlar plazma lipoprotein lipaz tarafından kısmen hidrolize edilecektir)32,33,34,35. Torasik kanal da kanüle edilebilir, ancak burada toplanan lenf mezenterik lenf ve ekstraintestinal lenf drenajının bir karışımını içerir26,36. In vitro, Caco-2 hücreleri, yağ asidi tedavisine yanıt olarak şilomikron benzeri bir parçacık salgılar ve bu hücreler ilgili lenfatik endotel veya vasküler hücrelerle birlikte kültürlenebilir37,38. İnsan ve fare bağırsak organoid kültürlerinin apikal lipitleri işlediği ve şilomikronları salgıladığı gösterilmiştir 39,40,41,42. Bu modeller oldukça avantajlıdır ve ince bağırsak fizyolojisine mekanik bakış açısı sağlar, ancak in situ mezenterik lenfatiklerin karmaşıklığını, fizyo-kimyasal gradyanlarını veya dinamik lenf akışını kopyalayamazlar.

Burada sunulan 1 günlük fare lenf fistül modelinin avantajları
Bağırsak lipoproteinlerini izole etmenin bu diğer yöntemleriyle ilgili olarak, Tso Lab lenf fistül tekniği geleneksel olarak diyet besinlerinin mezenterik lenf içine emilimini ölçmek için altın standart teknik olarak kabul edilmiştir. Bu in vivo teknik, diyet lipit emiliminin temel fizyolojik yönlerini yakalama avantajına sahiptir - emilim süresi boyunca bileşiklerin dinamik görünümü, bu da duodenal besinlerle canlı hayvanlarda akan mezenterik lenflerin tekrarlanan örneklemesini gerektirir. Bu cerrahi teknik aynı zamanda bağırsak hormonlarını ve sitokinleri, seyreltildikleri ve enzimatik olarak parçalandıkları kandan ziyade doğrudan fizyolojik bölmelerinde ölçer17,43.

Deneysel soru, lipid sekresyon dinamiklerinin veya herhangi bir hidrofobik GI bileşiğinin veya ilacının dinamik emilimini ve metabolizmasını anlamayı gerektiriyorsa, bu teknik sadece uygun değil, aynı zamanda luminal içeriğin proksimalden distal bağırsağa (mideden kolona) ve apikalden bazolateral yüzeye (luminal içerikler enterosit yoluyla lakteallere ve portal dolaşıma) hareketini interpolasyona tabi tutan tek yaklaşımdır. Bu teknik, besinlerin intraduodenal kateter yoluyla luminal olarak verilmesini kullandığından ve akan mezenterik lenf yönlendirildiğinden ve toplandığından, tüm absorpsiyon aparatı deneysel kontrol altındadır ve ince bağırsak emilim profillerini kalitatif olarak değerlendirmek için kullanılabilir.

Burada ilk kez görsel olarak sunulan, Tso Lab lenf fistül modelinde, (1) deneysel süreyi 1 günlük cerrahi implantasyon ve deneysel toplama süresine indirgeyen önemli bir güncellemedir; (2) fare hayatta kalma ve hayvan refahı hususlarını iyileştirir; ve (3) fare genetik modellerinin gücünden yararlanmak için farelerde yaklaşımın tekrarlanabilirliğini arttırır. Bu teknik, bağırsak sekresyonları, lipoproteinler veya diyet lipit emilimi ile ilgili tüm deneysel sorular için altın bir standart olarak düşünülmelidir ve lipit emilim kinetiğinin ve şilomikronların yüksek doğrulukta belirlenmesi için en iyi tekniktir.

Protocol

Tüm cerrahi prosedürler Pittsburgh Üniversitesi Dahili Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi [Protokol # 20047008] tarafından onaylanmıştır ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygundur. Bu çalışmada 8-14 haftalık C57BL6/J erkek fareler kullanıldı. Fareler ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Tüm fareler, standart chow ve suya ad libitum erişimi olan 12 saatlik bir ışık / karanlık döngüsüne yerleştirildi.

1. Hayvan hazırlama

  1. Deneysel tasarıma bağlı olarak, fareleri besleyin veya oruç tutmalarına izin verin.
    NOT: Mide boşalma hızındaki farklılıklarla ilgili endişeler olmadıkça bir gece oruç tutmak gereksizdir.
  2. % 5 izofluran gazı ile anesteziyi indükleyin ve kuyruk ve ayak parmağı sıkışması ile uygun anestezi sağlayın. Anestezi uygulandıktan sonra, fareleri% 2 -% 3 izofluran gazı ile uygun bir anestezik düzlemde tutun ve cerrahi platformda bantla konumlandırın.
  3. Fareleri, dolaşımdaki ılık suyu kullanan ısıtılmış bir cerrahi platformda sıcak tutun ( bkz.

2. Cerrahi ve deneysel tasarım

  1. Ameliyata gözlere veteriner merhemi uygulayarak, karnı tıraş ederek ve cerrahi bölgeye antiseptik cerrahi ovma uygulayarak (bkz. Bu, insizyonu sterilize eder ve orta hat insizyonu sırasında havadaki kürk oluşumunu azaltır.
  2. Steril aletler, perdeler ve ihtiyaç duyulan diğer ekipman ve malzemeleri kullanarak steril bir çalışma alanı sağlayın.
  3. Ağrı kesici (i.p.) için ilk karprofen dozunu (bakınız Malzeme Tablosu) 5 mg / kg'lık bir dozda enjekte edin.
  4. Cildi cımbızla kavrayın ve küçük makasla orta hat karın kesisi yapın. Sternuma doğru kesin (asla yukarıda değil) ve kasık yağına kadar kesin. Ardından, makası kullanarak kas tabakasını ayrı ayrı kesin.
    NOT: Kullanmadan önce tüm ekipmanları sterilize edin.
  5. Retraktörü kullanarak, lenf kanalı görünene kadar periton iç organlarını yoldan uzaklaştırın.
  6. Tuzlu suya batırılmış bir Q-ucu kullanarak ( bakınız Malzeme Tablosu), karaciğeri vücudun sağ üst tarafına ve bağırsakları ve mideyi hayvanın soluna doğru hareket ettirin.
  7. Superior mezenterik arteri ve bağırsak lenf kanalını ortaya çıkarmak için duodenumu sola doğru enine olarak gerin.
  8. Kanül tüpüne künt bir iğne sokarak 30-40 cm uzunluğunda bir kanül tüpü hazırlayın (bakınız Malzeme Tablosu) ve 1 mL'lik bir şırınga kullanarak tüpün içinden az miktarda heparin (1.000 U / L) yıkayın.
    NOT: Lenf akışı, buz üzerindeki mikrosantrifüj toplama tüplerine aşağı ve içine akması için yerçekimi tarafından desteklenir. Toplama buz kovasının cerrahi kuruluma bitişik olarak bulunduğu yere bağlı olarak, kanül borusunun uzunluğunun ayarlanması gerekebilir.
  9. Kanül borusunun ucundaki bir eğimi kesmek için makas kullanın.
  10. İnce bağırsaktaki görünümünden yaklaşık 5 mm uzakta lenf kanalında iris makası ile sığ bir kesi yapın (bkz.
  11. Kanül tüpünü bir çift ince forseps ile tutun ve ucu yavaşça kanala yerleştirin.
    NOT: Kanülü kanalın içine çok fazla itmemek önemlidir, çünkü geri çekilen organlar orijinal konumlarına geri döndüğünde lenf akışını önleyebilir.
  12. Lenf kanalı, kateterin bir dikişle bağlanmasıyla ilişkili manipülasyonlar için çok kırılgandır. Bunun yerine, lenf kanülünü mezenterik lenf kanalına yapıştırmak için bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın.
  13. Lenf fistül kanülünden hemen akmaya başlayan sütlü, beyaz lenf (ameliyat öncesi zeytinyağı gavage kullanılmışsa) veya berrak lenf (fareler ameliyat öncesi oruç tutmuşsa) olup olmadığını kontrol edin.
    NOT: Lenf kanülünün başarıyla yerleştirildiğini ve lenfin aktığını kontrol edin; İntraduodenal kanül yerleşimi ile devam edin.
  14. 18 G'lik bir iğne kullanarak, midenin pilorik bölgesinden pilor sfinkterine doğru bir delik açın.
  15. Duodenal infüzyon tüpünü (bakınız Malzeme Tablosu) midedeki bu delikten pilor sfinkterinin yaklaşık 1-2 mm ötesine duodenuma yerleştirin.
  16. İpek 5-0 sütür kullanarak bir çanta ipi bağı ile sabitleyin (bakınız Malzeme Tablosu) mideye bir iğne ile sabitleyin ve sızıntıyı önlemek için bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı ile kapatın.
  17. 0.3 mL / s'de% 5 glikoz-% 0.9 salin intraduodenal infüzyonuna başlayın.
    NOT: Vücut ağırlığında küçük farklılıklar olan ve kabaca 25 g (~ 8 haftalık) olan fareler kullanıldığında, 0.3 mL / s glikoz / salin infüzyonu uygundur. Fareler önemli ölçüde daha büyükse, infüzyon hızı vücut ağırlığındaki ve kan hacmindeki değişikliği hesaba katmak için yukarı doğru ayarlanmalıdır.
  18. Vücut boşluğundaki organları değiştirin ve kas ve cilt dokularını ayrı ayrı dikin (5-0).
    NOT: Lenf kanülü ve intraduodenal beslenme tüpü aynı insizyondan dışarı çıkarılır. Tüplerin bir dikişle ayrılması için bir öncelik yoktur ve tüplerin dışsallaşma açısı için bir tercih yoktur.
  19. Ameliyattan sonra ancak anestezinin geri çekilmesinden önce, hareketliliği sınırlamak için fareleri yavaşça Snuggle kısıtlamalarına (bakınız Malzeme Tablosu) yerleştirin.
    NOT: Sarılma kısıtlamaları, farelerin dikişleri ve boruları çiğnemek için kafayı kavramasını veya döndürmesini önler.
  20. Daha sonra, fareleri yumuşak sallanan bir rotatör üzerinde şeffaf bir pleksiglas kutuya yerleştirin ve muhafaza kutusunun yanına yapıştırılmış sıcaklık kontrollü ticari olarak temin edilebilen bir amfibi / sürüngen ısıtma yastığı kullanarak ısıtın. Muhafaza kutusunun köşelerinde steril deiyonize su kapları şeklinde de nemlendirme sağlayın (bkz.
  21. İzofluran çekilmeden 30 dakika önce, farelere ikinci ağrı kesici dozlarını uygulayın (Buprenex, 0.1 mg / kg, i.p.).
  22. Deneye bağlı olarak, farelere 1 saat boyunca 0.3 mL / s oranında% 5 glikoz-% 0.9 salin sürekli intraduodenal infüzyon sağlayın.
    NOT:% 5 glikoz-% 0.9 salin çözeltisi, eczaneden steril bir tuzlu su torbası (insan kullanımı için, pH 7.4) ve% 50 dekstrozun insan kullanımı için steril bir şişe kullanılarak, sterilite için katı kurallara uygun olarak hazırlanır. Çözelti taze yapılmalı ve tuzlu su torbasında veya dekstroz şişesinde verilen son kullanma tarihlerini geçmişse atılmalıdır.
  23. Fareleri Tablo 1'de listelenen lipitlerden biri ile intraduodenal kanül yoluyla deneysel bir lipit olarak uygulayın (bkz.
    NOT: Şekil 1'de gösterilen tüm veriler için, SMOFlipid (% 20 lipid enjekte edilebilir emülsiyon, USP, bakınız Malzeme Tablosu) intraduodenal olarak infüze edildi. Bu infüzyon, intraduodenal lipid bolusu öncesi ve sonrası, lenf kanalından boşalan kayıp sıvının yerini alır ve mutlak bir gerekliliktir. Fareler şimdi deneysel bir lipit dozu ile aşılanmaya hazırdır.
  24. İntra-duodenal infüzyon tüpü aracılığıyla 0.3 mL lipid emülsiyon bolusunun (SMOFlipid% 20 lipid enjekte edilebilir emülsiyonu, USP) klasik lipid infüzyonunu gerçekleştirin (bkz.
  25. İntraduodenal lipitlerin bolus infüzyonunu takiben, infüzyonu deneyin sonuna kadar sürekli olarak 0.3 mL / s'de% 5 glikoz-% 0.9 saline geri döndürün.
  26. Lenf örneklerini önceden tartılmış mikrosantrifüj tüplerinde 60 dakika boyunca toplayın ve lenfleri buz üzerinde tutun. Her 60 dakikalık periyotta salgılanan lenf ağırlığını belirlemek için tüpleri ikinci kez tartın.
    NOT: 0.3 mL lipid bolusundan sonra ~ 6 saat içinde fare başına saatte yaklaşık 50-300 μL lenf toplamayı bekleyin.
  27. Lenf, lipit infüzyonundan sonra 6 saate kadar akabilir. 6 saatlik zaman noktasında, fareleri izofluran ve servikal çıkık yoluyla ötenazi yapın.
    NOT: Deney boyunca hayvanları izlemek için bir cerrah ve / veya laboratuvar teknisyeni bulunmalıdır. Gözlem sırasında, lenfatik drenajdaki pıhtılara ve ağrı / sıkıntıya işaret eden hayvan davranışlarındaki değişikliklere dikkat edin. Lenf kanalı deney sırasında herhangi bir noktada tıkanırsa, deney sonlandırılır ve hayvan ötenazi yapılır. Hayvan teknik olarak ameliyattan sonra 24 saate kadar canlı tutulabilir (IACUC hayatta kalma cerrahisi kurallarına göre). Bununla birlikte, hayatta kalma oranları zamanla azalır ve 6 saat, lipit emiliminin hala in vivo fizyolojiyi taklit ettiği ve hayvanın hayatta kalma ile mücadele etmediği tekrarlanabilir bir hayatta kalma süresidir.
  28. Ötanazi sonrası terminal doku toplama işlemini gerçekleştirin (adım 3.1).
    NOT: Ameliyat sonrası 6 saat veya 24 saat boyunca tutulan farelerde diyet lipit emilim profillerindeki fark yakın zamanda test edilmiştir44. 24 saatlik prosedürün hayvan hayatta kalma oranlarını ve diyet lipitlerinin lenf içine girmesini azalttığını bulduk. Bu nedenlerden dolayı, 6-h yaklaşımını şiddetle tavsiye ediyoruz. Bu güncellenmiş cerrahi tasarım, gereksiz hayvan ölümünü ve ameliyat sonrası dönemde hayvan sıkıntısı potansiyelini azaltır. Bu, Amerikan Laboratuvar Hayvanları Bakımı Akreditasyon Derneği'nin hayvan "Değiştirme, İndirgeme, İyileştirme" [ref PMID: 21595115] olan ana hedefini desteklemektedir.

3. Luminal içeriğin ve mukozal dokunun toplanması

  1. 6 saatlik lipid infüzyon periyodunun sonunda, fareleri izofluran ve servikal çıkık yoluyla kurban edin. Luminal içeriğin sızmasını önlemek için midenin, ince bağırsağın ve çekumun her iki ucunu 5-0 dikişle bağlayın.
  2. Mide, çekum ve kolonu toplayın ve her birini 15 mL'lik bir cam tüpe yerleştirin. İnce bağırsağı üç veya dört bölüme ayırın ve uzunlamasına kestikten sonra dokuyu 2-3 mL soğuk PBS'de durulayarak luminal içeriği toplayın.
  3. Epitel hücreleri ve ilişkili lamina propriadan oluşan bağırsak mukozasını kas tabakasından 2-3 mL soğuk PBS'de her bir bölümü kavisli bir cımbız ile kazıyarak çıkarın.
  4. Tüm dokuları, luminal ve mukozal izolatları ve kas tabakasını cam tüplere yerleştirin ve her tüpe 8 mL 2: 1 hacim / hacim CHCl3: MeOH ekleyin.
  5. Folch ekstraksiyonu45'ten sonra radyoaktivite ve / veya lipit konsantrasyonlarını sıvı sintilasyon sayımı ve / veya bir trigliserit tahlil kiti (bakınız Malzeme Tablosu) ile belirleyin.

4. İnce tabaka kromatografisi (TLC)

  1. Luminal ve mukozal izolatların toplam lipitlerini modifiye Folch ekstraksiyonu 45 ile ekstrakte edin.
  2. Ekstrakte edilen lipitleri bir azot evaporatörü altında çözücü içinde kurutun ve daha sonra bir TLC silika jel plakasına yüklemeden önce 2: 1 hacim / hacim CHCl3: MeOH içinde tekrar askıya alın (bkz.
  3. Petrol eteri, etil eter ve buzul asetik asitten oluşan bir çözücü sistemi kullanarak lipitleri ayırın (25:5:1 vol/vol/vol). Standartlar da dahil olmak üzere farklı lipitlerin görselleştirilmesi için iyot buharı kullanın.
  4. Sintilasyon sayımı için 4 mL sintilasyon sıvısı ilavesinden önce monogliserit/fosfolipit, digliseritler, yağ asitleri, trigliserit ve kolesterol esterine karşılık gelen TLC plakasındaki lekeleri tek tek sintilasyon şişelerine kazıyın (bkz.
  5. Verileri toplam bolus lipid dozunun bir yüzdesi veya her örnek için tespit edilen toplam lipitin bir kısmı olarak ifade edin.

5. Şilomikron izolasyonu ve karakterizasyonu

  1. Kombine lenf örneklerini 6 saatlik post-lipid bolusundan (adım 2.29) ultrasantrifüj tüplerine,% 0.9 NaCl (300-500 μL) ile karıştırılmış olarak aktarın ve daha sonra% 0.87 NaCl (300-500 μL) uygun bir hacimle dikkatlice kaplayın.
    1. Ultra santrifüj (bakınız Malzeme Tablosu) numuneleri 110.000 x g'de 4 °C'de 16 saat boyunca kullanın. İzole şilomikronlar içeren üst fraksiyonu toplayın ve bunları yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek şilomikron trigliserit, kolesterol ve apoB konsantrasyonlarını belirleyin.
    1. Bir trigliserit ve kolesterol tahlil kiti kullanarak trigliserit ve kolesterol konsantrasyonlarını belirleyin (bkz.
    2. Kısaca, numunelerin 2 μL'sini 37 ° C'de 200 μL enzim reaktifi ile 96 delikli bir plakada 5 dakika boyunca inkübe edin. Trigliserit için 500 nm ve kolesterol için 600 nm'de bir plaka okuyucu kullanarak plakayı okuyun.
      NOT: Konsantrasyonların hesaplanmasında standartlar ve boşluklar kullanılmıştır. ApoB konsantrasyonları Fare ApoB ELISA Kiti kullanılarak belirlendi (bkz.
  3. Şilomikron parçacık boyutunu belirleyin.
    1. TEM görüntüleme için yaklaşık 40 mg / dL'lik trigliserit konsantrasyonlarında taze şilomikron örnekleri kullanın. Kısaca, her numuneden 5-10 μL'sini bir TEM ızgarasına yerleştirin ve kurutun.
    2. Izgarayı bir transmisyon elektron mikroskobu ile inceleyin ve görüntüleri yakalayın. Lipoprotein parçacık boyutlarını ölçün ve ImageJ yazılımını kullanarak analiz edin (bkz.

Representative Results

Şekil 2 , mezenterik lenflerde trigliserit sekresyonunu ve burada tarif edilen tek günlük lenf fistül prosedürünü geçiren en son n = 17 vahşi tip (WT) farede ortalama lenf akış hızlarını göstermektedir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, lenflerdeki trigliserit konsantrasyonu, 300 μL SMOFLipid'in intraduodenal bolusuna yanıt olarak artar. Pik trigliserit konsantrasyonuna bolus sonrası ~ 2-3 saatte ulaşılır ve 6 saatlik süre boyunca (ötenaziden hemen önce) istikrarlı bir şekilde azalır. Trigliserit sekresyonuna paralel olarak, lenf akış hızı Time 0 bolus infüzyonundan deneyin sonuna kadar artar (Şekil 2B).

Bu sonuçlar, hem mezenterik lenf kanalının hem de intraduodenal kanülün cerrahi implantasyonunun gerçekleştiğini ve diğer lenfatik içeriklerin (hormonlar, peptitler, besinler) karşılaştırılabileceği pozitif bir kontrolü temsil ettiğini göstermektedir. Bolus intraduodenal lipitlerine yanıt olarak lenflerdeki trigliserit konsantrasyonunda bir değişiklik yoksa, bu, ameliyatın ince bağırsakta önemli hasara neden olduğunu, böylece lipit emme kapasitesinin bulunmadığını veya daha önce fenotipli olmayan genetik modellerde, farenin lipit emiliminde fizyolojik olarak anlamlı bir kusura sahip olduğunu gösterir.

Figure 1
Şekil 1: Lenf fistül fare modeli için önerilen zaman çizelgesi. T-4, T-3, T-2: Çift kanülasyon yaklaşık 2-4 saat sürer, ardından farelerin iyileşme odalarına yerleştirilmesi gerekir. T-1: Fareler iyileşme periyoduna girdikten sonra,% 5 glikoz-% 0.9 salin sürekli bir duodenum infüzyonu alırlar. T0: Sürekli intraduodenal infüzyon% 5 glikoz-% 0.9 salinden deneysel besin infüzyonuna geçirilir. T0-T6: Fareler, salin veya alternatif olarak sürekli besinler içinde sürekli intraduodenal% 5 glikoz alırlar. Bu dönemde lenf saatlik olarak toplanır. Son nokta: Fareler ötenazi yapılır ve dokular toplanabilir. Figür BioRender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Mezenterik lenf trigliserit konsantrasyonu ve akış hızı. Vahşi tip farelere intraduodenal beslenme tüpü ve mezenterik lenf kanülü takıldı. Fareler 300 μL lipitlik bir bolus infüzyonu aldı. Lenf 6 saat boyunca saatlik alikotlarda toplandı ve buz üzerinde tutuldu. (A) Lenf trigliserit içeriği, her saatlik lenf alikotunda kimyasal bir tahlil ile belirlendi. (B) Bolus infüzyonundan sonraki 6 saat içinde, lenf akışı saatte salgılanan lenf gramı olarak çizilir. Puanlar SEM'± araçlardır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Lipid Dağıtım Yöntemleri Öneriler/Talimatlar
Karışık lipid emülsiyon bolusu İntra-duodenal infüzyon tüpü yoluyla ( A ) Liposyn III% 20 lipid enjekte edilebilir veya (B) SMOFlipid% 20 lipid enjekte edilebilir emülsiyon, USP'nin 0.3 mL'lik bir dozu kullanılabilir. Bu emülsifiye lipitler yararlıdır çünkü önceden hazırlanmaları gerekmez, oda sıcaklığında sıvıdırlar, sterildirler ve serbest yağ asitleri, trigliserit, fosfolipitler ve sodyum taurokolatın "kolayca sindirilebilir" bir karışımını içerirler. Bu, pankreas veya safra yetmezliği olabilecek fareler için iyi bir başlangıç infüzyonudur.
Trigliserit bolus Doymamış yağ, domuz yağı (yüksek doymuş yağ içeriğine sahip bir diyetin yansıtıcısı) veya hindistancevizi yağı (yüksek orta zincirli trigliserit içeriğine sahip bir diyetin yansıtıcısı) bakımından zengin bir diyeti yansıtan nötr bir lipit olarak 0.3 mL hafifçe ısıtılmış zeytinyağı (veya saflaştırılmış triolein), hepsi intra-duodenal infüzyon tüpü veya oral gavaj ile verilebilir. Deneysel trigliserit doymuş ise, oda sıcaklığında sıvı olması için ısıtılmalıdır.
Karışık yemek bolusu 0.3 mL 0.075 g yağ (% 21.6), 0.5 g karbonhidrat (% 64.0) ve 0.1125 g protein (% 14.4) içeren ve az yağlı karışık bir yemeği yansıtan formülasyon ile sağlayın, intra-duodenal infüzyon yoluyla uygulanabilir.
Radyoaktif işaretli lipid bolus 5.0 μCi3H etiketli gliserol trioleat ve / veya 0.3 mL zeytinyağında 1.0 μCi 14C-kolesterol, duodenal infüzyon yoluyla verilebilir. 14 C-kolesterol: Kolesterol-[4-14C] 55Ci / mmol spesifik aktivitesi ve 0.1mCi / mL konsantrasyonu ile. 3 H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG), spesifik aktivitesi 60Ci/mmol ve konsantrasyonu 1mCi/mL olan
Sürekli doz Yukarıdaki deneysel besin formülasyonlarından herhangi birinin 0.3 mL / s oranında (0.3 mL toplam bolus yerine) infüzyonu, lenf içine sabit bir trigliserit çıkışı ile sonuçlanacaktır. Bu, lenflerdeki trigliserit konsantrasyonunun ~ 2-3 saatte zirveye ulaştığı ve daha sonra ~ 6-8 saatte başlangıç konsantrasyonlarına geri döndüğü bir bolus infüzyonundan farklıdır.

Tablo 1: Lipid infüzyonları tablosu.

Discussion

Orijinal 2 günlük lenf fistül prosedürü Bollman ve ark.25 tarafından tanımlanmış ve Patrick Tso'nun laboratuvarı tarafından son 45 yıldır uygulanmıştır26,27. Burada sunulan protokol, ince bağırsağın benzersiz şilokus sekresyonlarının yanı sıra diyet besin emilimi ve metabolizmasının, bağırsak hormonlarının ve bağırsak bağışıklığının in vivo dinamiklerini tanımlamak, ölçmek ve anlamak için bu klasik, altın standart yönteme güçlü bir ektir.

Bu modelin avantajları arasında (1) emilim, sindirim veya sekresyon sırasında bir zaman noktasında statik örnekleme yerine, beslenme ve post-prandial dönem boyunca mezenterik lenfleri sürekli olarak örnekleme yeteneği; (2) bağırsak hormonlarının ve sitokinlerin, seyreltildikleri ve enzimatik olarak parçalandıkları kandan ziyade doğrudan fizyolojik bölmelerinde ölçülmesi17,44; (3) Bir lipid öğününün yutulmasını takiben ince bağırsak tarafından salgılanan lipoproteinleri izole etme, nicelleştirme ve karakterize etme yeteneği ve mezenterik lenflerde endotel lipazlarının yokluğu, şilomikron trigliserit konsantrasyonlarını ve doğal şilomikron yapısını koruyan46,47; (4) lenf akış hızını, trigliserit ve kolesterolün (veya diğer duodenal infüzyonlu bileşiklerin) çıktısını, şilomikron bileşimini ve bağırsak hormonu konsantrasyonlarını doğrudan ölçme yeteneği. Son olarak, bu protokol 6 saatlik bir süre boyunca her saat >50 μL lenf nispeten büyük miktarlarda toplanmasına izin verir. Sıvı intra-duodenal salin ve glukoz infüzyonu ile doldurulduğundan, lenf fistül modeli diğer lenf örnekleme tekniklerine göre önemli ölçüde iyileştirilir ve mezenterik lenflerin statik havuzlarından ziyade akmaya neden olur. Hacim, lipidomik, proteomik ve metabolomik yaklaşımlar için büyük bir engel olduğundan, bu büyük bir güçtür.

Burada tarif edilen 1 günlük fare lenf fistül protokolü, orijinal lenf fistül protokolüne göre, ameliyattan sonra daha yüksek sağkalım oranı nedeniyle daha önce tarif edilen 2 günlük lenf fistül protokollerinden26,27 toplam deney hayvanı sayısında bir azalma da dahil olmak üzere çeşitli avantajlara sahiptir; genel deney süresinde 2 günden tek bir güne azalma; ve son olarak, fareler için iyileşme süresinde, çığır açan ağrının veya kötü ameliyat sonrası sonuçların ortaya çıkabileceği bir gecede (>18 saat), ameliyat sonrası daha yönetilebilir bir ~ 6 saatlik bir döneme kadar bir azalma.

Bu 1 günlük protokolün bir özelliği, insani düşüncelere ve son noktalara odaklanmaktır. Bunlar en yüksek önceliğe sahip olmalıdır: (1) hayvanlar intraduodenal veya IV replasman sıvıları almalıdır; (2) sıcak ve mümkün olduğunca ağrısız tutulmalıdırlar (deneysel tasarıma ve anti-enflamatuar etkilerden kaçınma ihtiyacına bağlı olarak ameliyat sonrası Buprenex ve / veya carprofen ile); (3) kanama, titreme, ishal veya sıkıntı belirtileri, insancıl bir son nokta için zorlayıcı nedenlerdir. Katı IACUC kurallarına göre, izofluran ve ardından servikal çıkık iyi bir son noktadır. Cerrahi sağkalım oranları tek bir gün için ~% 70'tir (orijinal 2 günlük ameliyat için ~% 40 ile karşılaştırıldığında), ancak araştırmacılar deneyi bir sıkıntı belirtisiyle sonlandırmakta tereddüt etmemelidir. Hayvan sayıları planlanırken bu dikkate alınmalıdır.

Bu tekniğin giderilmesi açısından lenf kanülünün başarılı bir şekilde yerleştirilmesi bu cerrahi işlemdeki en büyük darboğazdır. Ameliyatı uygularken, ameliyattan yaklaşık 2 saat önce fareyi 0.3 mL zeytinyağı ile gavage etmeye yardımcı olur. Bu, şilomikronların mezenterik lenf kanalına salgılanmasına neden olacak ve "sütlü" ve daha görünür görünmesini sağlayacaktır. Metilen mavisi de kullanılabilir, ancak genellikle sütlü lenf kanalından daha az belirgindir. Lenf kanülünün yerleştirilmesinden ve yapıştırıcı ile yerleştirilmesinden sonra, mezenterik lenf kanülden bir toplama kabına başarıyla akıyorsa, o zaman bir duodenal infüzyon tüpünün yerleştirilmesine devam edilebilir. Bazen, lenf sürekli akmayabilir, ancak hayvan dönen tablaya yerleştirildiğinde tekrar akmaya başlayabilir. Kritik olarak, lenf tüpü içindeki pıhtılara dikkat edin. Bunlar, lenf kanalındaki geri akış basıncını önlemek için tüplerden masaj yapılmalıdır.

Trigliserit sekresyonuna ve lenf akış hızına ek olarak, bu teknik aşağıdaki lipit absorpsiyon kinetiği ve şilomikron özelliklerini belirlemek için kullanılabilir:

Şilomikron sekresyonu45,48,49
Yağ içeren bir yemeğin hemen ardından, dolaşımdaki plazma trigliseritinde geçici bir artış olur. Trigliseritler doğası gereği hidrofobik olduğundan, önce kanda çözünür olmaları için emülsifiye edilmeleri gerekir50. İnce bağırsak enterositleri bu rolü yerine getirir ve diyet trigliseritini şilomikron emülsiyon parçacıklarına paketler51. Şilomikronlar, çekirdeklerinde kolesterol ve diyet trigliserit içerir, apoB-48, apoA-I, apoA-IV ve apoC-III52,53,54,55 dahil olmak üzere fosfolipitler ve apolipoproteinlerle çevrilidir. ApoB-48 temel yapısal proteindir ve diğer apolipoproteinler şilomikron metabolizması ve kandan temizlenmesi için gerekli çeşitli fonksiyonlara sahiptir. Trigliserit ve apolipoprotein içeriği de dahil olmak üzere şilomikronların temel özelliklerini belirlemek için, burada gösterilen 1 günlük lenf fistül tekniği kullanılmalıdır. Şilomikron sekresyon hızı, lenf içine salgılanan ve saatlik lenf örnekleri sayılarak sintilasyon ile ölçülen infüze edilen 3H-trigliseritin yüzdesidir. Bu, ayrıntılı şilomikron karakterizasyonu 48,49,56,57,58 ile birleştirilebilir. Saatlik lenf örnekleri birleştirilebilir veya ayrı tutulabilir. Lenf ultrasantrifüj tüplerine aktarılır,% 0.9 NaCl ile karıştırılır ve daha sonra% 0.87 NaCl'lik 300-500 μL ile dikkatlice kaplanır. Numuneler daha sonra 16 saat boyunca 4 ° C'de 110.000 x g'de ultra santrifüj edilir. İzole şilomikronlar içeren üst fraksiyonlar, trigliserit tahlil kiti kullanılarak trigliserit konsantrasyonları için toplanır ve test edilir. Kısaca, 2 μL şilomikron (1:10 seyreltme), 96 delikli bir plakada 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 200 μL enzim reaktifi ile inkübe edilir. Plaka, 500 nm'de bir plaka okuyucu tarafından okunur ve trigliserit konsantrasyonlarının hesaplanması için standartlar ve boşluklar kullanılır. Şilomikron boyutu daha sonra negatif boyama ve iletim elektron mikroskobu (TEM) 14,29 ile belirlenebilir. Trigliserit ve kolesterol, ELISA Kitleri veya Western blot ile kimyasal tahlil ve apolipoprotein içeriği (apoB-48, A-I, C-II, C-III) ile ölçülebilir.

Primer lipid absorpsiyon yerinin belirlenmesi 48,59
3H-trigliserit veya radyo etiketli karışık bir yemeğin infüzyonundan 6 saat sonra duodenum, jejunum ve ileumun luminal ve epitel hücre bölmelerini izole ederek, 3H-trigliseritin ne kadarının epitel hücre zarı boyunca emildiğini (normal) veya ince bağırsağın uzunluğu boyunca lümende (anormal) tutulduğunu belirlemek için içerikler Folch ekstrakte edilir48 . Bu çalışmalar, GI motilitesinde potansiyel farklılıklar varsa 60,61,62, safra asitleri ile ilgili bir hipotez varsa (lipit emilimi boyunca oldukça aktiftir ve kendileri ileumda yeniden emilir)63,64,65,66 veya besinlerin yanlış anatomik yerde (ileum veya hatta kolon) emildiğine dair bir endişe varsa67 özellikle etkilidir. ,68,69,70.

3H-trigliseritin absorpsiyon epitel hücrelerine kaçakçılığının mekanizmalarının belirlenmesi 48
Bu, bağırsak lümeninde 3 H-serbest yağ asidine hidrolize edilmiş, mukozaya emilmiş, ve şilomikron olarak salgılanmadan önce hücre içi 3H-trigliserit içine yeniden esterleştirilmiş 3 H-trigliserit yüzdesinin hesaplanmasıyla gerçekleştirilir. Bu, emilim / sekresyon kusurlarının güçlü bir belirtecidir, çünkü diyet trigliseritinin parçalanma ürünlerine hareketini ve ardından şilomikronlara ambalajını göstermek için izlenebilir. Yağ asidi absorpsiyon makinelerinin mRNA ekspresyonu (CD36, FABP'ler, ACSL'ler), yeniden esterifikasyon yolu (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) ve apolipoproteinler (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) RT-PCR ile daha da ölçülebilir.

Bu tekniğin gelecekteki uygulamaları sadece bağırsak-organ çapraz iletişimi, metabolizma, bağışıklık, besin emilimi, çevresel diyet kirleticileri veya GI sisteminde rolü olan diğer hastalıklara olan ilgiyle sınırlıdır. Kritik mezenterik lenf sistemine erişimdeki zorluk nedeniyle birçok zorlayıcı deney ve hipotezin durmuş olması muhtemeldir ve bu görselleştirilmiş protokolün amacı bu tekniği daha kolay erişilebilir hale getirmektir. Şilomikronları ve başlangıçta bulundukları mezenterik lenfleri izole etmek, tüm vücut metabolizmasını anlamanın kritik bir parçasıdır; 1 günlük fare lenf fistül modeli, bu olayları incelemek için güçlü bir fizyolojik modeldir.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Kistik Fibrozis Vakfı'na (Pilot ve Fizibilite Ödülü 1810, ABK'ya), Rainin Vakfı'na (Sinerji Ödülü, PI GJ Randolph ve Co-I ABK'ya) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'ne (R01DK118239, R03DK116011'den ABK'ya) bu çalışmalara verdikleri destek için son derece minnettarız.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC 0409-4888-06
1.7 mL Eppendorf tubes Fisher Scientific, Waltham, MA, US 7200184
14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ARC 0857
18 G needle Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 305199
2 Dumont micro-dissecting forceps Fine Science Tools, Foster City, CA, US 11251-35
2 Forceps ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5130
3H-TAG:  Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ART0199
3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC-0409-6648-16
Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK Fisher Scientific, Waltham, MA, US 11-101-0007
BD CareFusion ChloraPrep Swabstick Fisher Scientific, Waltham, MA, US 14-910-501
Betadine surgical scrub Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US 1201
Bevel-cut cannula Braintree Scientific.,  Braintree , MA, US MRE025
Buprenorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex) HenrySchein, Warrendale, PA, US 1278184
C57BL6/J male mice Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine
ChloraPrep Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 260100
Cholesterol Assay Kit FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US 99902601
Cholesterol-[4-14C] American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
Clear plexiglass box L43cm X W26 X H 21 with temperature-controlled heating pad and humidification our own design and modifications
commercially available  amphibian/reptile heating pad ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China XHC-F035D
Cotton tip applicators Fisher Scientific, Waltham, MA, US 22363156
Duodenal infusion tube - canuala Braintree Scientific, Braintree , MA, US MRE037
Ensure Abbott Nutrition, Columbus, OH
Heating pad surgical platform with circulating warm water pump combination Patterson Scientific, Waukesha, WI, US Gaymar T/Pump Classic
Hetarin Sodium Injection, USP 1,000 units/mL sterile Mylan, Morgantown, WV, US NDC-67457-384-31
Image J Software National Institute of Health, Bethesda, Maryland,
Iris scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Isoflurane Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US NDC 66794-017-25
Isoflurane induction apparatus and Anesthesia Apparatus Patterson Scientific, Waukesha, WI, US mouse induction chamber
Krazy glue Elmer's products Inc., Columbus, OH, US KG484
Liposyn III 20% lipid injectable Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA
LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter Beckman Coulter, Brea, CA
Micro-dissecting Spring Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Mouse apoB ELISA Kit ABCAM Inc., Waltham, MA, US ab230932-1
Needle Holder Fine Science Tools, Foster City, CA, US 12002-12
Retractors Kent Scientific Co., Torrington, CT, US SURGI-5001
Rimadyl (Carprofen) Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US 4019449
Rotating table Barnstead Thermolyne Labquake, Zürich, Switzerland Barnstead Thermolyne
SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US NDC-63323-820-01
Snuggle Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Île-Perrot, QC J7V 7M4, Canada MS 02.5PM
Surgical Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5912SC
Suture (5-0 silk with needle) DemeTECH, Miami Lakes, FL, US DT-719
Transmission Electron Microscope (JEOL 1400-FLASH 120KV ) JEOL, Peabody, MA
Triglyceride Assay Kit Randox Laboratories, Crumlin, United Kingdom TR210
ULTIMA GOLD XR Scintillation Fluid Perkin Elmer, Hebron, KY, US 6013119
Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497 SORVALL RC M120 GX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Natale, G., Bocci, G., Ribatti, D. Scholars and Scientists in the History of the Lymphatic System. Journal of Anatomy. 231 (3), 417-429 (2017).
  2. Loukas, M., et al. The lymphatic system: A historical perspective. Clinical Anatomy. 24 (7), 807-816 (2011).
  3. Suy, R., Thomis, S., Fourneau, I. The discovery of the lymphatic system in the seventeenth century. Part II: The discovery of Chyle vessels. Acta Chirurgica Belgica. 116 (5), 325-331 (2016).
  4. Azzali, G. Historical notes on the lymphatic vascular system. Acta Bio-medica de L'Ateneo Parmense. 61 (3-4), 113-125 (1990).
  5. Irschick, R., Siemon, C., Brenner, E. The history of anatomical research of lymphatics - From the ancient times to the end of the European Renaissance. Annals of Anatomy. 223, 49-69 (2019).
  6. Swartz, M. A. The physiology of the lymphatic system. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 3-20 (2001).
  7. Deitch, E. A. Gut lymph and lymphatics: A source of factors leading to organ injury and dysfunction. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, 103-111 (2010).
  8. Tso, P., Gollamudi, S. R. Pluronic L-81: A potent inhibitor of the transport of intestinal chylomicrons. American Journal of Physiology. 247, 32-36 (1984).
  9. Tso, P., Karlstad, M. D., Bistrian, B. R., DeMichele, S. J. Intestinal digestion, absorption, and transport of structured triglycerides and cholesterol in rats. American Journal of Physiology. 268, 568-577 (1995).
  10. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. American Journal of Physiology. 261, 530-538 (1991).
  11. Bogunovic, M., et al. Origin of the lamina propria dendritic cell network. Immunity. 31 (3), 513-525 (2009).
  12. Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Science Translational Medicine. 6 (237), (2014).
  13. Ji, Y., Sakata, Y., Tso, P. Nutrient-induced inflammation in the intestine. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (4), 315-321 (2011).
  14. Ji, Y., Sakata, Y., Yang, Q., Tso, P. Intestinal mucosal mast cells is activated by fat absorption. Gastroenterology. 140 (5), (2011).
  15. Wang, F., et al. Chronic high-fat feeding increases mixed meal-induced incretin secretion in Sprague-Dawley rats. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (10), 807-815 (2015).
  16. Kindel, T. L., Yoder, S. M., D'Alessio, D. A., Tso, P. The effect of duodenal-jejunal bypass on glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in Wistar rats. Obesity Surgery. 20 (6), 768-775 (2010).
  17. Kohan, A. B., Yoder, S. M., Tso, P. Using the lymphatics to study nutrient absorption and the secretion of gastrointestinal hormones. Physiology & Behavior. 105 (1), 82-88 (2011).
  18. Yoder, S. M., Yang, Q., Kindel, T. L., Tso, P. Stimulation of incretin secretion by dietary lipid: Is it dose dependent. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (2), 299-305 (2009).
  19. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PLoS One. 4 (12), 8442 (2009).
  20. Vors, C., et al. Postprandial endotoxemia linked with chylomicrons and lipopolysaccharides handling in obese versus lean men: A lipid dose-effect trial. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (9), 3427-3435 (2015).
  21. Ghoshal, S., Witta, J., Zhong, J., de Villiers, W., Eckhardt, E. Chylomicrons promote intestinal absorption of lipopolysaccharides. Journal of Lipid Research. 50 (1), 90-97 (2009).
  22. Jandacek, R. J., Rider, T., Keller, E. R., Tso, P. The effect of olestra on the absorption, excretion and storage of 2,2',5,5' tetrachlorobiphenyl; 3,3',4,4' tetrachlorobiphenyl; and perfluorooctanoic acid. Environment International. 36 (8), 880-883 (2010).
  23. Jandacek, R. J., Tso, P. Organochlorine compounds are absorbed via lymph and portal circulation. The FASEB Journal. 22, (2008).
  24. Utermann, G., Beisiegel, U. Apolipoprotein A-IV: A protein occurring in human mesenteric lymph chylomicrons and free in plasma. Isolation and quantification. European Journal of Biochemistry. 99 (2), 333-344 (1979).
  25. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 33 (10), 1349-1352 (1948).
  26. Tso, P., Balint, J. A., Rodgers, J. B. Effect of hydrophobic surfactant (pluronic L-81) on lymphatic lipid transport in the rat. American Journal of Physiology. 239 (5), 348-353 (1980).
  27. Liu, M., et al. Sexual dimorphism in intestinal absorption and lymphatic transport of dietary lipids. Journal of Physiology. 599 (22), 5015-5030 (2021).
  28. Manolas, K. J., et al. Lymph, pancreatic and gastrointestinal hormones in response to feeding in the conscious pig. European Surgical Research. 17 (5), 324-332 (1985).
  29. Lascelles, A. K., Morris, B. Surgical techniques for the collection of lymph from unanaesthetized sheep. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 46, 199-205 (1961).
  30. Jensen, L. T., Olesen, H. P., Risteli, J., Lorenzen, I. External thoracic duct-venous shunt in conscious pigs for long term studies of connective tissue metabolites in lymph. Laboratory Animal Science. 40 (6), 620-624 (1990).
  31. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 45-60 (2001).
  32. Yasunaga, K., Saito, S., Zhang, Y. -L., Hernandez-Ono, A., Ginsberg, H. N. Effects of triacylglycerol and diacylglycerol oils on blood clearance, tissue uptake, and hepatic apolipoprotein B secretion in mice. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1108-1121 (2007).
  33. Curtin, A., et al. Elevated triglyceride-rich lipoproteins in diabetes. A study of apolipoprotein B-48. Acta Diabetologica. 33 (3), 205-210 (1996).
  34. Gordts, P. L. S. M., et al. ApoC-III inhibits clearance of triglyceride-rich lipoproteins through LDL family receptors. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2855-2866 (2016).
  35. Ginsberg, H. N., et al. Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 78 (5), 1287-1295 (1986).
  36. Ormai, S., Palkovits, M. Size distribution of lymphocytes in the thoracic duct lymph in rat after lymphocyte mobilization induced by polymethacrylic acid. Blut Zeitschrift für die Gesamte Blutforschung. 24 (3), 161-165 (1972).
  37. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19565-19572 (1999).
  38. Nollevaux, G., et al. Development of a serum-free co-culture of human intestinal epithelium cell-lines (Caco-2/HT29-5M21). BMC Cell Biology. 7 (1), 20 (2006).
  39. Li, D., Dong, H., Kohan, A. B. The Isolation, Culture, and Propagation of Murine Intestinal Enteroids for the Study of Dietary Lipid Metabolism. Organoids. Methods in Molecular Biology. 1576, Humana. New York, NY. 195-204 (2019).
  40. Jattan, J. J., et al. Using murine-derived primary intestinal enteroids for studies of dietary triglyceride absorption and lipoprotein synthesis, and to determine the role of intestine-specific ApoC-III in the intestine. Journal of Lipid Research. 58 (5), 853-865 (2017).
  41. Haring, E., et al. Bile acids regulate intestinal antigen presentation and reduce graft-versus-host disease without impairing the graft-versus-leukemia effect. Haematologica. 106 (8), 2131-2146 (2021).
  42. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: Reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 269-289 (2015).
  43. Deacon, C. F. Circulation and degradation of GIP and GLP-1. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 761-765 (2004).
  44. Dedousis, N., Teng, L., Kanshana, J. S., Kohan, A. B. A single-day mouse mesenteric lymph surgery in mice: an updated approach to study dietary lipid absorption, chylomicron secretion, and lymphocyte dynamics. J Lipid Res. 63 (11), 100284 (2022).
  45. Li, D., et al. Intestinal basolateral lipid substrate transport is linked to chylomicron secretion and is regulated by ApoC-III. Journal of Lipid Research. 60 (9), 1503-1515 (2019).
  46. Glatzle, J., et al. Chylomicron components mediate intestinal lipid-induced inhibition of gastric motor function. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 282 (1), 86-91 (2002).
  47. Huang, J., Sloop, C. H., Roheim, P. S., Wong, L. Lipoprotein lipase and hepatic triacylglycerol lipase activities in peripheral and skeletal muscle lymph. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 10 (5), 720-726 (1990).
  48. Wang, F., et al. Overexpression of apolipoprotein C-III decreases secretion of dietary triglyceride into lymph. Physiological Reports. 2 (3), 00247 (2014).
  49. Kohan, A. B., et al. Apolipoprotein A-IV regulates chylomicron metabolism-Mechanism and function. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (6), 628-636 (2012).
  50. Hayashi, H., et al. Fat feeding increases size, but not number, of chylomicrons produced by small intestine. American Journal of Physiology. 259 (5), 709-719 (1990).
  51. Tso, P., Balint, J. A. Formation and transport of chylomicrons by enterocytes to the lymphatics. American Journal of Physiology. 250 (6), 715-726 (1986).
  52. Bhattacharya, S., Redgrave, T. G. The content of apolipoprotein B in chylomicron particles. Journal of Lipid Research. 22 (5), 820-828 (1981).
  53. Björkegren, J., Karpe, F., Milne, R. W., Hamsten, A. Differences in apolipoprotein and lipid composition between human chylomicron remnants and very low density lipoproteins isolated from fasting and postprandial plasma. Journal of Lipid Research. 39 (7), 1412-1420 (1998).
  54. Martins, I. J., Sainsbury, A. J., Mamo, J. C., Redgrave, T. G. Lipid and apolipoprotein B48 transport in mesenteric lymph and the effect of hyperphagia on the clearance of chylomicron-like emulsions in insulin-deficient rats. Diabetologia. 37 (3), 238-246 (1994).
  55. Mar, R., et al. Association of the APOLIPOPROTEIN A1/C3/A4/A5 gene cluster with triglyceride levels and LDL particle size in familial combined hyperlipidemia. Circulation Research. 94 (7), 993-999 (2004).
  56. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 086005 (2012).
  57. Nauli, A. M., et al. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiological Reports. 2 (6), 192-196 (2014).
  58. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1290-1297 (2005).
  59. Kohan, A. B., et al. Is apolipoprotein A-IV rate limiting in the intestinal transport and absorption of triglyceride. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (12), 1128-1135 (2013).
  60. De Lisle, R. C. Altered transit and bacterial overgrowth in the cystic fibrosis mouse small intestine. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (1), 104-111 (2007).
  61. Debas, H. T., Farooq, O., Grossman, M. I. Inhibition of gastric emptying is a physiological action of cholecystokinin. Gastroenterology. 68 (5), 1211-1217 (1975).
  62. Spiller, R. C., et al. Further characterisation of the 'ileal brake' reflex in man--Effect of ileal infusion of partial digests of fat, protein, and starch on jejunal motility and release of neurotensin, enteroglucagon, and peptide YY. Gut. 29 (8), 1042-1051 (1988).
  63. Battle, M. A., et al. GATA4 is essential for jejunal function in mice. Gastroenterology. 135 (5), 1676-1686 (2008).
  64. Morgan, R. G., Borgström, B. The mechanism of fat absorption in the bile fistula rat. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 228-243 (1969).
  65. Davidson, N. O., Kollmer, M. E., Glickman, R. M. Apolipoprotein B synthesis in rat small intestine: Regulation by dietary triglyceride and biliary lipid. Journal of Lipid Research. 27 (1), 30-39 (1986).
  66. Bouchi, R., et al. FOXO1 inhibition yields functional insulin-producing cells in human gut organoid cultures. Nature Communications. 5, 4242 (2014).
  67. Bijvelds, M. J. C., et al. Fat absorption in cystic fibrosis mice is impeded by defective lipolysis and post-lipolytic events. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 288 (4), 646-653 (2005).
  68. Struyvenberg, M. R., Martin, C. R., Freedman, S. D. Practical guide to exocrine pancreatic insufficiency - Breaking the myths. BMC Medicine. 15 (1), 29 (2017).
  69. Tickell, K. D., Atlas, H. E., Walson, J. L. Environmental enteric dysfunction: A review of potential mechanisms, consequences and management strategies. BMC Medicine. 17 (1), 181 (2019).
  70. Lo, C. M., et al. Cholecystokinin knockout mice are resistant to high-fat diet-induced obesity. Gastroenterology. 138 (5), 1997-2005 (2010).

Tags

Biyoloji Sayı 189
Diyet Lipid Emiliminin ve Şilomikron Sekresyonunun <em>İn Vivo</em> Kinetiğini Ölçmek için Farelerde Akan Mezenterik Lenflerin İzolasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dedousis, N. L., Teng, L., Kohan, A. … More

Dedousis, N. L., Teng, L., Kohan, A. B. The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion. J. Vis. Exp. (189), e64338, doi:10.3791/64338 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter