Optimisation des paramètres de tri cytométrique en flux pour l’isolation et la purification à haut débit de petites vésicules extracellulaires

Summary

Ce protocole fournit une méthode d’isolation rapide et spécifique à la taille pour les petites vésicules extracellulaires en optimisant la taille de la buse de pulvérisation d’air, la pression du fluide de gaine, la pression d’écoulement de l’échantillon, la tension, le gain et les paramètres de seuil de déclenchement.

Abstract

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) peuvent être libérées de tous les types de cellules et transporter des protéines, de l’ADN et de l’ARN. Les molécules de signalisation servent d’indicateurs de l’état physiologique et pathologique d’une cellule. Cependant, il n’existe pas de méthode standard pour l’isolement des EV, ce qui empêche l’identification des biomarqueurs en aval et les études d’intervention médicamenteuse. Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolation et la purification de 50-200 nm sEV par un trieur de cellules d’écoulement. Pour cela, une buse de 50 μm et une pression de fluide de gaine de 80 psi ont été sélectionnées pour obtenir un bon taux de tri et un flux latéral stable. Des microsphères de polystyrène de taille standard ont été utilisées pour localiser des populations de particules de 100, 200 et 300 nm. Avec une optimisation supplémentaire du seuil de déclenchement de la tension, du gain et de la diffusion directe (FSC), le signal sEV pourrait être séparé du bruit de fond. Ces optimisations fournissent un panel de paramètres de tri critiques qui permet d’obtenir une population représentative de sEV en utilisant uniquement FSC vs diffusion latérale (SSC). La méthode d’isolation basée sur la cytométrie en flux permet non seulement une analyse à haut débit, mais permet également une classification synchrone ou une analyse protéome de sEV basée sur l’expression du biomarqueur, ouvrant de nombreuses applications de recherche en aval.

Introduction

Une cellule libère des vésicules extracellulaires (VE) de différentes tailles qui entraînent des molécules de signalisation et des inclusions membranaires, ce qui est important pour la communication intercellulaire¹. Les VE de différentes tailles jouent également différents rôles biologiques, avec 50-200 nm sEV pouvant distribuer avec précision l’ARN, l’ADN et les protéines au bon emplacement extracellulaire. Le sEV aide également à déterminer leurs mécanismes de sécrétion, impliquant non seulement la régulation des processus physiologiques normaux tels que la surveillance immunitaire, le maintien des cellules souches, la coagulation sanguine e....

Protocol

1. Culture cellulaire

1. Préparer un milieu de culture de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS). Culture de la cellule cancéreuse du pancréas humain, PANC-1, dans une fiole de culture de 75 cm² à une densité de 1 x 10⁶ cellules/mL. Incuber la culture à 37 °C avec 5% de CO₂.
2. Sous-culture des cellules lorsque la densité cellulaire atteint 75%-80% sous observation microscopique. Retirer le milieu et rincer 2x avec 3-5 mL de solution saline tampon phosphate (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4).
3. Jeter la solution, ajouter 1-2 mL de solution trypsine-EDTA et lais....

Results

L’organigramme du protocole expérimental est illustré à la figure 1. Dans cette méthode, des microsphères de polystyrène de taille standard ont été utilisées comme étalons de référence pour la distribution granulométrique. Dans la condition spécifique du paramètre instrumental, le signal de particules a pu être clairement distingué du bruit de fond dans le diagramme FSC vs SSC en utilisant la forme logarithmique. Les stratégies d’établissement de points de contrôle sont illustrées à

Discussion

Ce protocole décrit une méthode optimisée pour isoler et purifier le sEV avec la taille de particules spécifiée de 50 à 200 nm à l’aide d’un trieur de cellules d’écoulement, qui a été validé par NTA. La méthode a résolu le problème du goulot d’étranglement consistant à obtenir du sEV avec une taille de particules uniforme et une grande pureté, évitant ainsi les interférences de molécules biologiques non apparentées enveloppées dans des VE de grande taille²². Des analyses rapides et à haut débit so.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube à centrifuger	Beckman Coulter	344058
Fioles de culture	Corning  ;
Dulbecco' s aigle modifié Corning	Cellgro	10-013-CV
Sérum fœtal bovin	SUER	SUER050QY
Trieur de cellules Flow	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Cellule cancéreuse du pancréas humain, PANC-1	NA NA		Les cellules panc-1 ont été données par le professeur Weijun Yang, Collège des sciences de la vie, Université du Zhejiang
Taille des particules laser et potentiel zêta analyseur  ;	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Tampon phosphate salin	Gibco	C20012500BT
Microsphères fluorescentes en polystyrène	Beckman Coulter	6602336
Microscopie électronique à transmission	JEOL	JEM-1200EX
Solution trypsine-EDTA	Gibco	1713949
Ultra rainbow	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifugeuse	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Rotor d’ultracentrifugeuse	Beckman Coulter	SW32TI