Génotypage de polymorphismes mononucléotidiques dans le génome mitochondrial par pyroséquençage

Résumé

Les tests de pyroséquençage permettent le génotypage robuste et rapide des polymorphismes mononucléotidiques de l’ADN mitochondrial dans des cellules ou des tissus hétéroplasmiques.

Résumé

Des mutations dans le génome mitochondrial (ADNmt) ont été associées à des maladies génétiques héréditaires de la mère. Cependant, l’intérêt pour les polymorphismes de l’ADNmt a augmenté ces dernières années en raison de la capacité récemment développée de produire des modèles par mutagénèse de l’ADNmt et d’une nouvelle appréciation de l’association entre les aberrations génétiques mitochondriales et les maladies courantes liées à l’âge telles que le cancer, le diabète et la démence. Le pyroséquençage est une technique de séquençage par synthèse largement utilisée dans le domaine mitochondrial pour les expériences de génotypage de routine. Son prix relativement abordable par rapport aux méthodes de séquençage parallèle massif et sa facilité de mise en œuvre en font une technique inestimable dans le domaine de la génétique mitochondriale, permettant la quantification rapide de l’hétéroplasmie avec une flexibilité accrue. Malgré l’aspect pratique de cette méthode, sa mise en œuvre en tant que moyen de génotypage de l’ADNmt nécessite le respect de certaines lignes directrices, notamment pour éviter certains biais d’origine biologique ou technique. Ce protocole décrit les étapes et les précautions nécessaires à la conception et à la mise en œuvre de tests de pyroséquençage à utiliser dans le contexte de la mesure de l’hétéroplasmie.

Introduction

Le génome mitochondrial existe sous la forme de petites molécules circulaires (16,5 kb) (ADNmt) présentes dans le compartiment le plus interne des mitochondries nommé matrice et code 13 sous-unités de la chaîne respiratoire mitochondriale, ainsi que les ARNt et les ARNr nécessaires à leur traduction in situ par le ribosome mitochondrial¹. Ce génome représente environ 1% de toutes les protéines nécessaires à la fonction mitochondriale, dont le reste est codé par l’ADN nucléaire (ADNn). Il est communément admis que les mitochondries sont dérivées d’un événement de fusion endosymbiotique entre un ancêtre alpha-protéobactérien et une cellu....

Protocole

Un consentement éclairé a été fourni pour l’utilisation des cellules cybrides humaines 3243A>G et des MEF m.5024C>T immortalisés utilisés dans cette étude. L’approbation éthique n’était pas requise dans ce cas, car les cellules des patients n’ont pas été collectées à l’Université de Cambridge. L’utilisation de fibroblastes humains peut toutefois nécessiter une approbation éthique. Il est fortement recommandé de suivre les meilleures pratiques pour la configuration de la PCR lors de la préparation de l’échantillon d’ADN pour le pyroséquençage. Une amplification fréquente à l’aide d’amorces identiques peut entraîner une contamination par amplicon et introduire un biais ....

Résultats

Cette section présente un exemple d’optimisation d’un test de pyroséquençage pour une mutation de l’ADNmt pathogène humain, ainsi que des données de séquençage provenant du génotypage de fibroblastes embryonnaires de souris hétéroplasmiques (m.5024C>T) traités avec des nucléases mitochondriales à doigts de zinc (mtZFN). L’optimisation du dosage pour les cellules humaines et la comparaison de deux tests différents montrent comment sélectionner le plus précis, tandis que le génotypage des cellules MEF génétiquement modi.......

Discussion

Un aspect essentiel pour le succès du protocole est d’éviter les contaminations, en particulier lors de l’utilisation de faibles quantités de matières premières. Il est recommandé d’utiliser une hotte UV et des pointes de pipettes filtrées lors de la préparation des échantillons dans la mesure du possible, ainsi que de séparer les zones de préamplification et de post-amplification. Des mesures à blanc et des échantillons d’hétéroplasmie connue (tels que l’ADN de type sauvage) doivent toujours être inclus pour être utilis.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
KOD Hot Start ADN polymérase	Sigma-Aldrich	71086
PyroMark Assay Design  ; 2.0	QIAGEN
Pyromark Q48 Bandes absorbantes  ;	QIAGEN	974912
PyroMark Q48 Advanced CpG Réactifs (4 x 48)	QIAGEN	974022
Pyromark Q48 Autoprep  ;	QIAGEN	9002470
PyroMark Q48 Cartouche	Set QIAGEN	9024321
Pyromark Q48 Disques	QIAGEN	974901
Pyromark Q48 Perles magnétiques  ;	QIAGEN	974203
PyroMark Q48 (1)	QIAGEN	9024325

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