Résolution de problèmes pratiques liés à la micro-indentation basée sur la microscopie à force atomique sur des explants de cartilage articulaire humain

Summary

Nous présentons une approche étape par étape pour identifier et résoudre les problèmes les plus courants associés aux micro-indentations de la microscopie à force atomique. Nous illustrons les problèmes émergents sur les explants de cartilage articulaire humain natif caractérisés par divers degrés de dégénérescence induite par l’arthrose.

Abstract

Sans aucun doute, la microscopie à force atomique (AFM) est actuellement l’une des techniques les plus puissantes et les plus utiles pour évaluer les micro et même nano-signaux dans le domaine biologique. Cependant, comme pour toute autre approche microscopique, des défis méthodologiques peuvent survenir. En particulier, les caractéristiques de l’échantillon, la préparation de l’échantillon, le type d’instrument et la sonde d’indentation peuvent entraîner des artefacts indésirables. Dans ce protocole, nous illustrons ces problèmes émergents sur des explants de cartilage articulaire sains et arthrosiques. À cette fin, nous montrons d’abord par une approche étape par étape comment générer, classer et classer visuellement des disques cartilagineux articulaires ex vivo selon différents stades de dégénérescence au moyen d’une grande imagerie par fluorescence en mosaïque 2D des explants de tissus entiers. La principale force du modèle ex vivo est qu’il comprend du cartilage humain natif et âgé qui permet d’étudier les changements liés à l’arthrose, de l’apparition précoce à la progression. En outre, les pièges courants dans la préparation des tissus, ainsi que la procédure AFM proprement dite ainsi que l’analyse des données ultérieure, sont également présentés. Nous montrons comment des étapes basiques mais cruciales telles que la préparation et le traitement des échantillons, les caractéristiques topographiques des échantillons causées par une dégénérescence avancée et l’interaction entre l’échantillon et la pointe de l’échantillon peuvent avoir un impact sur l’acquisition des données. Nous soumettons également à un examen minutieux les problèmes les plus courants de l’AFM et décrivons, dans la mesure du possible, comment les surmonter. La connaissance de ces limites est de la plus haute importance pour l’acquisition et l’interprétation correctes des données et, en fin de compte, l’intégration des résultats dans un contexte scientifique plus large.

Introduction

En raison de la taille toujours plus petite des appareils et des systèmes électroniques, le développement rapide de la technologie et des équipements micro et nano a pris de l’ampleur. L’un de ces dispositifs est la microscopie à force atomique (AFM), qui peut balayer des surfaces biologiques et récupérer des informations topographiques ou biomécaniques à l’échelle nanométrique et micrométrique ^1,2. Parmi ses nombreuses fonctionnalités, cet outil peut être utilisé comme un micro- ainsi qu’un nano-pénétrateur pour obtenir des informations sur les propriétés mécaniques de divers systèmes ....

Protocol

Des condyles fémoraux prélevés sur des patients subissant une arthroplastie totale du genou à l’hôpital universitaire de Tübingen, en Allemagne, ont été utilisés. Seuls des échantillons de cartilage articulaire provenant de patients atteints de pathologies articulaires dégénératives et post-traumatiques ont été inclus dans cette étude. L’approbation des comités d’éthique départementaux, institutionnels et locaux a été obtenue avant le début de l’étude (projet n° 674/2016BO2). Le consentement éclairé écrit de tous les patients a été reçu avant la participation.

NOTE : La figure 1 présente un organigramme des éta....

Results

À l’aide d’un dispositif de coupe fabriqué par nos soins, nous avons pu explanter et générer de petits disques cartilagineux (4 mm x 1 mm) à partir de condyles humains frais contenant un seul motif spatial cellulaire³⁰ de cordes simples (SS, Figure 2A), de cordes doubles (DS), de petits amas (SC), de grands amas (BC ; Figure 2A) et diffuse (Figure 2B). Un explant de cartilage représentatif est représenté à

Discussion

En tant que maladie progressive et multifactorielle, l’arthrose déclenche des changements structurels et fonctionnels dans le cartilage articulaire. Tout au long de l’arthrose, les altérations des caractéristiques mécaniques s’accompagnent de modifications structurelles et biochimiques à la surface du cartilage articulaire^27,31. Les premiers événements pathologiques survenant dans l’arthrose sont l’épuisement des protéoglycanes associée à une perturbation du rése.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotéricine B	Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne	1397-89-3
Tête de microscopique à force atomique (AFM)  ;	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Allemagne	JPK00518
Colle d’échantillon biocompatible  ;	Bruker Nano GmbH, Berlin, Allemagne	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, États-Unis	14948	Coloration perméable à la membrane cellulaire, utilisée pour le tri des disques cartilagineux - imagerie en vue de dessus
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Allemagne	SAA-SPH-5UM	Nom de fréquence : 30KHz, k : 0,2N/m, nom de longueur : 115&mu ; m, largeur nom : 40&mu ; m,  ; Géométrie : Rectangulaire, pointe cylindrique avec un 5&mu ; m rayon d’extrémité Dispositif
traitement du cartilage  ;	Fait maison  ;	n/a	Dispositif de découpe en plastique contenant des ensembles prédéfinis de caméra CDD 4mmx1mm
intégrée dans l’AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Brême, Allemagne	DFK 31BF03
Caméra CDD intégrée dans le microscope à fluorescence	Leica Biosystems, Wetzlar, Allemagne	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Allemagne	CM3050S  ;
Le logiciel de traitement des données pour l’AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Allemagne	n/a	Version 5.0.86, peut être téléchargé gratuitement à partir du site Web suivant https://customers.jpk.com
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)  ;	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Allemagne	41966052
Microscope à fluorescence (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Allemagne	11889113
Support de cantiliver en bloc de verre	Bruker Nano GmbH, Berlin, Allemagne	SP-90-05	Bloc de verre extra long avec faces inclinées, spécialement conçu pour être utilisé avec le JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Microscope à contraste de phase inversé (intégré dans l’AFM)	AxioObserver D1, microscopie Carl Zeiss, Iéna, Allemagne	L201306_03
milieu L-15 de Leibovitz sans L-glutamine  ;	Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne	F1315
Lames de microscope en verre	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis	CLS294775X50
Milieu de montage Avec DAPI	ibidi GmbH, Grä ; felfing, Allemagne	50011	Média de montage avec contre-coloration nucléaire DAPI (4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole) utilisée pour les disques cartilagineux  ; imagerie en vue latérale
Pénicilline-Streptomycine	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Chauffage de boîte de Pétri associé à AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Allemagne	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japon	2023-01
Jupe en silicone	Bruker Nano GmbH, Berlin, Allemagne	n/a	Membrane de protection en silicone (D55x0.25) qui est placée sur la base de la base du bloc de verre pour éviter la condensation moyenne dans la tête AFM.
Programme statistique - SPSS	IBM, Armonk, New York, États-Unis	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Boîtes de culture tissulaire  ;	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Suisse	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Pays-Bas	SA6255012	Milieu d’enrobage soluble dans l’eau  ;