Method Article

Résolution de problèmes pratiques liés à la micro-indentation basée sur la microscopie à force atomique sur des explants de cartilage articulaire humain

DOI:

10.3791/64371

⸱

October 28th, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons une approche étape par étape pour identifier et résoudre les problèmes les plus courants associés aux micro-indentations de la microscopie à force atomique. Nous illustrons les problèmes émergents sur les explants de cartilage articulaire humain natif caractérisés par divers degrés de dégénérescence induite par l’arthrose.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sans aucun doute, la microscopie à force atomique (AFM) est actuellement l’une des techniques les plus puissantes et les plus utiles pour évaluer les micro et même nano-signaux dans le domaine biologique. Cependant, comme pour toute autre approche microscopique, des défis méthodologiques peuvent survenir. En particulier, les caractéristiques de l’échantillon, la préparation de l’échantillon, le type d’instrument et la sonde d’indentation peuvent entraîner des artefacts indésirables. Dans ce protocole, nous illustrons ces problèmes émergents sur des explants de cartilage articulaire sains et arthrosiques. À cette fin, nous montrons d’abord par une approche étape par étape comment générer, classer et classer visuellement des disques cartilagineux articulaires ex vivo selon différents stades de dégénérescence au moyen d’une grande imagerie par fluorescence en mosaïque 2D des explants de tissus entiers. La principale force du modèle ex vivo est qu’il comprend du cartilage humain natif et âgé qui permet d’étudier les changements liés à l’arthrose, de l’apparition précoce à la progression. En outre, les pièges courants dans la préparation des tissus, ainsi que la procédure AFM proprement dite ainsi que l’analyse des données ultérieure, sont également présentés. Nous montrons comment des étapes basiques mais cruciales telles que la préparation et le traitement des échantillons, les caractéristiques topographiques des échantillons causées par une dégénérescence avancée et l’interaction entre l’échantillon et la pointe de l’échantillon peuvent avoir un impact sur l’acquisition des données. Nous soumettons également à un examen minutieux les problèmes les plus courants de l’AFM et décrivons, dans la mesure du possible, comment les surmonter. La connaissance de ces limites est de la plus haute importance pour l’acquisition et l’interprétation correctes des données et, en fin de compte, l’intégration des résultats dans un contexte scientifique plus large.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En raison de la taille toujours plus petite des appareils et des systèmes électroniques, le développement rapide de la technologie et des équipements micro et nano a pris de l’ampleur. L’un de ces dispositifs est la microscopie à force atomique (AFM), qui peut balayer des surfaces biologiques et récupérer des informations topographiques ou biomécaniques à l’échelle nanométrique et micrométrique 1,2. Parmi ses nombreuses fonctionnalités, cet outil peut être utilisé comme un micro- ainsi qu’un nano-pénétrateur pour obtenir des informations sur les propriétés mécaniques de divers systèmes biologiques 3,4,5,6. Les données sont collectées par contact physique avec la surface à travers une sonde mécanique, qui peut être aussi petite qu’environ 1 nm à son extrémité7. La déformation résultante de l’échantillon est alors affichée en fonction de la profondeur d’indentation de la pointe en porte-à-faux et de la force appliquée sur l’échantillon8.

L’arthrose est une maladie chronique dégénérative à long terme caractérisée par une détérioration du cartilage articulaire des articulations et des tissus environnants, ce qui peut entraîner une exposition complète des surfaces osseuses. Le fardeau de l’arthrose est considérable ; À l’heure actuelle, la moitié des femmes et un tiers des hommes âgés de 65 ans et plus souffrent d’arthrose9. Les traumatismes, l’obésité et l’altération de la biomécanique de l’articulation10 qui en résulte déterminent la dégénérescence du cartilage articulaire, qui est considérée comme un résultat final commun. L’étude pionnière de Ganz et al. a postulé que les premières étapes du processus d’arthrose peuvent impliquer les propriétés biomécaniques du cartilage11, et depuis lors, les chercheurs ont confirmé cette hypothèse12. De même, il est généralement admis que les propriétés biomécaniques du tissu sont fonctionnellement orchestrées par l’organisation ultrastructurale ainsi que par la diaphonie cellule-cellule et cellule-matrice. Toute altération peut avoir un impact considérable sur le fonctionnement biomécanique global des tissus13. À ce jour, le diagnostic d’arthrose est clinique et repose sur une radiographie sur film simple14. Cette approche est à double face : d’une part, l’absence d’un seuil dégénératif défini pour formuler le diagnostic d’arthrose rend la maladie difficile à quantifier et, d’autre part, les méthodes d’imagerie manquent de sensibilité et de standardisation et ne peuvent pas détecter les lésions cartilagineuses localisées15,16,17. À cette fin, l’évaluation des propriétés mécaniques du cartilage présente l’avantage décisif de décrire un paramètre qui change au cours de l’arthrose quelle que soit l’étiologie de la maladie et qui a une influence directe sur la fonctionnalité tissulaire à un stade très précoce. Les instruments d’indentation mesurent la force par laquelle le tissu résiste à l’indentation. En fait, il ne s’agit pas d’un concept nouveau ; Les premières études remontent aux années 1980 et 1990. Au cours de cette période, de nombreuses études ont suggéré que les instruments d’indentation conçus pour les mesures arthroscopiques du cartilage articulaire pourraient être bien adaptés pour détecter les changements dégénératifs dans le cartilage. Il y a encore 30 ans, certaines études ont pu démontrer que les instruments d’indentation étaient capables de détecter in vivo des changements à la surface du cartilage pendant la dégénérescence tissulaire en effectuant des mesures de rigidité compressive lors de l’arthroscopie18,19,20.

L’indentation AFM (AFM-IT) du cartilage articulaire fournit des informations sur une propriété mécanique essentielle du tissu, à savoir la rigidité. Il s’agit d’un paramètre mécanique qui décrit la relation entre une charge non destructive appliquée et la déformation résultante de la zone tissulaire dentelée21. L’AFM-IT s’est avérée capable de quantifier les modifications de la rigidité en fonction de l’âge dans les réseaux de collagène macroscopiquement non affectés, différenciant ainsi les changements pathologiques associés à l’apparition de l’arthrose (grade 0 sur l’échelle d’Outerbridge dans le cartilage articulaire)22. Nous avons précédemment montré que les AFM-ITs, sur la base de l’organisation spatiale des chondrocytes en tant que biomarqueur basé sur l’image pour la dégénérescence précoce du cartilage, permettent non seulement de quantifier mais aussi d’identifier les premiers changements mécaniques dégénératifs. Ces résultats ont déjà été confirmés par d’autres23,24. Par conséquent, l’AFM-IT agit comme un outil intéressant pour diagnostiquer et identifier les changements dégénératifs précoces. Ces changements peuvent déjà être mesurés au niveau cellulaire, ce qui redéfinit la compréhension du processus physiopathologique de l’arthrose.

Dans ce protocole, nous démontrons une procédure complète de classification histologique et biomécanique des explants de cartilage articulaire, de la préparation des explants de cartilage natif à l’acquisition et au traitement des données AFM. À travers une approche étape par étape, nous montrons comment générer, classer et classer visuellement le tissu cartilagineux articulaire selon différents stades de dégénérescence au moyen d’une imagerie 2D en grande mosaïque, suivie d’indentations micro-AFM.

Même si, à l’heure actuelle, l’AFM-IT est l’un des outils les plus sensibles pour mesurer les modifications biomécaniques du cartilage7, comme toute autre technique instrumentale, elle présente des limites et des particularités pratiques25 qui peuvent conduire à une acquisition erronée des données. À cette fin, nous soumettons à un examen minutieux les problèmes les plus courants qui surviennent lors des mesures AFM des explants de cartilage et décrivons, dans la mesure du possible, comment les minimiser ou les surmonter. Il s’agit notamment des aspects topographiques des échantillons et des difficultés à les stabiliser dans un environnement compatible avec l’AFM, des particularités physiques de la surface du tissu et des difficultés qui en résultent pour effectuer des mesures AFM sur de telles surfaces. Des exemples de courbes force-distance erronées sont également présentés, en mettant l’accent sur les conditions qui peuvent les provoquer. D’autres limitations inhérentes à la géométrie de la pointe en porte-à-faux et à l’utilisation du modèle Hertz pour l’analyse des données sont également discutées.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des condyles fémoraux prélevés sur des patients subissant une arthroplastie totale du genou à l’hôpital universitaire de Tübingen, en Allemagne, ont été utilisés. Seuls des échantillons de cartilage articulaire provenant de patients atteints de pathologies articulaires dégénératives et post-traumatiques ont été inclus dans cette étude. L’approbation des comités d’éthique départementaux, institutionnels et locaux a été obtenue avant le début de l’étude (projet n° 674/2016BO2). Le consentement éclairé écrit de tous les patients a été reçu avant la participation.

NOTE : La figure 1 présente un organigramme des étapes de l’expérience dans leur ordre chronologique.

1. Traitement tissulaire et génération de disques cartilagineux

  1. Préparation des tissus
    1. Après la résection postopératoire, placer les échantillons de cartilage dans un récipient rempli de milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 5 % (v/v) de pénicilline-streptomycine. Assurez-vous que les échantillons sont complètement immergés dans le milieu. La durée entre la résection chirurgicale et le traitement ultérieur du cartilage ne doit pas dépasser 24 h. S’assurer que, tout au long du traitement, les échantillons sont complètement immergés dans le milieu pour éviter le dessèchement des échantillons.
    2. Coupez le cartilage de l’os à l’aide d’un scalpel.
  2. Génération de disques cartilagineux
    1. Générer des disques cartilagineux de 4 mm de diamètre à l’aide d’un poinçon de biopsie.
      REMARQUE : Il est important de sélectionner et de réséquer les zones du condyle où l’épaisseur de la couche de cartilage dépasse 1 mm. Cela peut être problématique, en particulier autour des zones porteuses, où la couche de cartilage perd généralement de son épaisseur en raison des processus d’usure ou de dégénérescence.
    2. Placez les disques cartilagineux de 4 mm précédemment générés sur un dispositif de coupe sur mesure et fixez et maintenez les disques cartilagineux stables à l’aide d’une spatule. Lors de la mise en place des disques cartilagineux sur le dispositif de coupe, des précautions doivent être prises. Positionnez les échantillons de manière à ce que la couche supérieure du cartilage (la zone superficielle du cartilage articulaire) ne fasse pas face à la lame
    3. Coupez les disques cartilagineux à l’aide d’une lame de rasoir. Des échantillons de cartilage en forme de disque de 4 mm x 1 mm sont ainsi générés. Pour éviter le dessèchement de l’échantillon, effectuez une coupe de tissu le plus rapidement possible.
    4. Prélever chaque disque à l’aide d’une spatule et placer les disques cartilagineux générés dans des tubes de 1,5 mL contenant 1 mL de DMEM complété par 5 % (v/v) de pénicilline-streptomycine. Placez environ 15 disques dans un tube.
  3. Cryotome sectionnant les disques cartilagineux (pour les coupes perpendiculaires)
    REMARQUE : Cette étape est facultative et peut être utilisée si une visualisation en vue latérale de la distribution du motif cellulaire dans les disques cartilagineux est souhaitée. Il peut être utilisé comme méthode de vérification car la distribution du motif cellulaire est une caractéristique 3D du cartilage articulaire26. Il est également possible d’utiliser des coupes optiques et des reconstructions 3D de l’ensemble des disques cartilagineux à l’aide d’un microscope confocal, ce qui élimine la nécessité de sectionner les échantillons comme décrit dans le protocole.
    1. Recouvrez le disque cartilagineux d’un milieu d’enrobage soluble dans l’eau et placez-le sur son bord sur le bouton du cryotome (avec la surface du disque perpendiculaire à la surface du bouton). Dans le dispositif cryotome, le milieu d’enrobage gèle à basse température.
    2. À l’aide d’un cryotome standard, sectionnez le tissu latéralement à une épaisseur de 60 μm jusqu’à ce que le milieu du disque soit atteint (c’est-à-dire lorsque les cryosections atteignent une longueur de 4 mm) et prélevez les tranches. En sectionnant l’explant discale perpendiculairement, toutes les zones du cartilage (superficielles, moyennes et profondes) peuvent être visualisées.
    3. Recueillir les sections sur une lame de verre et retirer le milieu d’enrobage soluble dans l’eau en lavant trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).

2. Tri des disques cartilagineux en fonction du modèle spatial cellulaire

  1. Coloration des échantillons de cartilage en forme de disque
    1. Placer un disque cartilagineux (section 1.2) dans chaque puits d’une plaque à 96 puits et ajouter 130 μL de colorant de fluorescence perméable aux cellules à une dilution de 1 :1 000 dans chaque puits.
    2. Inspectez visuellement l’ensemble de la plaque et assurez-vous qu’un seul disque est placé dans chaque puits. Incuber la plaque pendant 30 min dans l’incubateur de culture cellulaire standard à 37 °C.
  2. Coloration des tranches de cartilage de 60 μm
    1. Placez délicatement les sections du disque cartilagineux (section 1.3) sur des lames de microscope en verre à l’aide d’une pince.
    2. Recouvrez les sections de cartilage d’un milieu de montage contenant une contre-coloration nucléaire DAPI et placez délicatement des lamelles adaptées à la microscopie à fluorescence.
    3. Scellez les bords de chaque lamelle avec du vernis à ongles transparent ordinaire et laissez sécher pendant 3 min.
  3. Tri et imagerie du cartilage de haut en bas et de côté
    REMARQUE : Chaque disque doit être examiné au microscope à fluorescence. L’objectif de cette étape est de trier les disques en fonction de leur motif cellulaire prédominant (cordes simples, cordes doubles, petits amas, gros amas ou diffus).
    1. Placez la plaque à 96 puits sur le support de plaque du microscope à fluorescence.
    2. Choisir le filtre de fluorescence approprié de Em 495 nm/Ex 515 nm (pour l’imagerie descendante des disques cartilagineux préparés à la section 2.1.) ou Em 358 nm/Ex 461 nm (pour l’imagerie en vue latérale des coupes de cartilage préparées à la section 2.2) et l’objectif 10x.
      REMARQUE : L’utilisation de l’objectif 10x permet d’inspecter toute la circonférence du disque et d’exclure les échantillons présentant une coloration inhomogène ou incorrecte. Cependant, l’utilisation uniquement de la vue descendante peut entraîner la perception de changements dans l’organisation cellulaire à la suite de l’analyse des couches tissulaires plus profondes rendues visibles à l’observation descendante par érosion superficielle. À titre d’exemple, une corde ascendante suivant les arcades de collagène pourrait être perçue comme une cellule unique ou des cellules dispersées (motif diffus)26. Par conséquent, les deux côtés des disques doivent être inspectés pour s’assurer que le motif cellulaire est correctement sélectionné.
    3. Déterminer visuellement le motif cellulaire affiché dans chaque disque cartilagineux. Il est peu probable qu’un disque n’ait qu’un seul type de motif cellulaire. Pour la partie du disque où la disposition des chondrocytes ne correspond pas au motif d’intérêt, n’accepter les échantillons que si le motif indésirable se trouve à la périphérie même, là où les mesures AFM n’ont pas lieu (c’est-à-dire jusqu’à 0,5 mm du bord du disque), et s’assurer que cela ne dépasse pas 10 % de la surface totale du disque27, Chapitre 28.
  4. Acquisition d’images de l’ensemble des disques cartilagineux
    1. Sélectionnez l’objectif 10x du microscope et placez-le sous le puits présélectionné contenant un disque cartilagineux individuel. Concentrez-vous sur le disque pour voir le motif cellulaire.
    2. Sélectionnez la fonction Navigateur pour obtenir une vue d’ensemble de l’ensemble du puits. Utilisez le bouton gauche de la souris et faites-le glisser pour naviguer vers une autre position de scène. À l’aide de la molette de la souris, effectuez un zoom avant et arrière.
      REMARQUE : À ce stade, un aperçu du puits avec l’échantillon entier peut être vu en double-cliquant sur chaque zone d’intérêt de manière séquentielle.
    3. Sélectionnez un carré qui englobe la zone d’intérêt à numériser ; À ce stade, toutes les tuiles individuelles qui composent la mosaïque deviennent visibles.
    4. Ajustez l’exposition/l’intensité lumineuse de manière à ce que les cellules puissent être clairement visualisées à partir de l’arrière-plan. À ce stade, la luminosité/le contraste de l’image a été ajusté pour toutes les tuiles et ne peut plus être personnalisé individuellement pour chaque tuile.
      REMARQUE : Comme les cellules proches du bord du disque émettent souvent un signal de fluorescence plus élevé que les cellules au centre, les paramètres d’exposition/intensité lumineuse doivent être adaptés.
      1. Pour évaluer si le temps d’exposition est approprié pour un canal particulier, examinez la distribution du signal dans l’histogramme. En utilisant le mécanisme d’exposition automatique inclus dans le logiciel d’imagerie du microscope, visualisez toutes les cellules résidant dans le disque.
    5. Sélectionnez l’option Point de mise au point de la carte du logiciel, puis sélectionnez chaque tuile individuelle en cliquant avec le bouton gauche de la souris au centre de celle-ci.
    6. Sélectionnez l’option Carte de mise au point. Une fenêtre s’affiche avec toutes les tuiles précédemment sélectionnées. Double-cliquez sur une vignette de la liste pour l’afficher et la mettre au point.
    7. Cliquez sur Définir Z pour enregistrer le plan focal et passer à la vignette suivante. Après avoir ajusté le plan focal pour chaque mosaïque, commencez l’acquisition de l’image en appuyant sur Démarrer la numérisation.
      1. Si la numérisation affiche des barres horizontales et/ou verticales plus sombres, cela peut être dû à un éclairage inadéquat et inégal des images individuelles. Résolvez ce problème en utilisant l’option Linked Shading intégrée au logiciel avant l’analyse proprement dite.
    8. Enregistrez, exportez et annotez correctement les images.

3. Approche biomécanique des explants cartilagineux

  1. Préparation de l’échantillon pour les mesures AFM
    1. Fixez chaque disque cartilagineux présélectionné contenant un motif cellulaire (section 2) dans des boîtes de Pétri à l’aide d’une colle biocompatible. Ajoutez suffisamment d’échantillon de colle sur les côtés supérieur, inférieur, gauche et droit du disque.
    2. Recouvrez les disques de 2,5 mL de milieu L-15 de Leibovitz sans L-glutamine. Ajouter délicatement le milieu Leibowitz sur les échantillons pour éviter que l’échantillon ne se détache de la surface en raison des ondes créées par le milieu.
  2. Chargement des échantillons dans l’AFM
    1. Placez la boîte de Pétri dans le porte-échantillon de l’appareil AFM et allumez le chauffage de la boîte de Pétri réglé sur 37 °C. Laissez la boîte de culture tissulaire atteindre la température souhaitée. Ceci est fait pour exclure d’éventuels artefacts causés par la variation de température.
  3. Calibrage en porte-à-faux AFM
    1. Initialisez la configuration du logiciel comme décrit précédemment par Danalache et al.29.
    2. Sélectionnez un support en porte-à-faux en brique de verre approprié pour les mesures de liquide et placez-le soigneusement sur la tête AFM. Un mécanisme de verrouillage sécurise la brique de verre dans la tête de l’AFM. Assurez-vous que la surface réfléchissante de la brique de verre est droite et parallèle au support AFM.
    3. Placez le porte-à-faux sur la surface du support en porte-à-faux en brique de verre avec soin. Le porte-à-faux lui-même doit reposer sur le plan optique poli, au centre de la brique de verre.
    4. Placez soigneusement une jupe en silicone (membrane en silicone) sur la base du support en porte-à-faux afin d’éviter la condensation moyenne dans la tête de l’AFM.
    5. Abaissez le porte-à-faux par pas de 100 μm à l’aide de la fonction moteur pas à pas jusqu’à ce qu’il soit complètement immergé dans le fluide.
    6. Exécutez une approche de scanner avec les paramètres d’approche décrits par Danalache et al.29. Rétractez le porte-à-faux de 100 μm une fois que le fond de la boîte de Pétri est atteint.
    7. Calibrez le porte-à-faux en suivant les étapes exactes et exécutez les paramètres décrits par Danalache et al.29. À la fin de l’étalonnage, la déviation verticale est enregistrée et affichée en newtons (N) unités de force plutôt qu’en volts (V), l’unité de l’enregistrement d’origine par le détecteur à photodiode. Dans les expériences ici, un point de consigne de 4,47 nN a résulté après l’étalonnage.
    8. À l’aide de la fonction de moteur pas à pas, rétractez le porte-à-faux à 1 000 μm.
  4. Identification du site de mesure du cartilage souhaité sous l’AFM
    REMARQUE : En raison de l’épaisseur de 1 mm des disques cartilagineux, le porte-à-faux n’est pas visible dans le champ de vision lors de la navigation sur l’échantillon.
    1. Utilisez la caméra CCD du microscope pour identifier le porte-à-faux. Le porte-à-faux AFM doit être positionné dans une zone sans échantillon de la boîte de Pétri.
    2. Commencer une approche par scanner avec le porte-à-faux sur une zone propre et sans échantillon de la boîte de Pétri, en utilisant les mêmes paramètres que ceux décrits par Danalache et al.29.
    3. Rétractez davantage le porte-à-faux à 1,5 mm du bas de la plaque à l’aide de la commande du moteur pas à pas. Cette étape est cruciale afin d’éviter une collision directe entre le porte-à-faux et l’échantillon.
    4. Passez de la vue fond clair à la vue fluorescence et identifiez visuellement le haut du disque.
    5. Déplacez le porte-échantillon AFM d’exactement 2 mm vers le milieu du disque. Ce point est considéré comme le centre du disque cartilagineux.
    6. Effectuez une approche par scanner et, une fois que la surface du disque cartilagineux est atteinte, rétractez le porte-à-faux de 100 μm.
  5. Mesures de la courbe force-distance
    1. Concentrez-vous sur les cellules positionnées sur le site de mesure souhaité. Cliquez sur le bouton Exécuter pour lancer les mesures et la génération des courbes force-distance dans la position ciblée.
    2. Acquérir cinq courbes force-distance sur chaque site de mesure. Rétractez le porte-à-faux de 500 μm et déplacez-le vers le site de mesure suivant.
      REMARQUE : La rétraction du porte-à-faux est une étape cruciale, car la surface du disque cartilagineux n’est pas homogène et présente des irrégularités. Une butte élevée à la surface de l’échantillon peut entraîner une collision dramatique, entraînant des dommages indésirables à la pointe du porte-à-faux ou à l’échantillon. Nous recommandons de sélectionner un minimum de cinq sites de mesure différents dispersés sur la surface du disque et d’acquérir un minimum de cinq courbes force-distance à chaque site.
    3. Inspectez les courbes force-distance et enregistrez-les.
  6. Estimation des modules de Young à l’aide du modèle d’ajustement de Hertz
    1. Ouvrez les courbes force-distance générées à analyser (fichier .jpk) dans le logiciel d’analyse de données à l’aide de l’option Ouvrir un lot de courbes de spectroscopie .
    2. Sélectionnez le modèle d’ajustement Hertz , puis sélectionnez l’option d’ajustement de l’élasticité .
      1. L’option d’ajustement de l’élasticité effectue automatiquement les calculs suivants sur la courbe force-distance sélectionnée : calcule la ligne de base et soustrait de l’ensemble de la courbe pour supprimer le décalage de la ligne de base (la ligne de base est ramenée à zéro sur l’axe des y) ; détermine le point de contact en détectant le point où la courbe force-distance croise la ligne de force nulle (le point de contact est mis à zéro sur l’axe des abscisses) ; calcule la séparation pointe-échantillon (le signal de hauteur du piézoélectrique tenant compte de la flexion du porte-à-faux est soustrait) ; et ajuste automatiquement la courbe force-distance avec le modèle sélectionné. Si vous le souhaitez, chacune de ces étapes peut également être effectuée indépendamment.
    3. Adaptez-le à l’aide des paramètres d’ajustement suivants : un coefficient de Poisson de 0,5 et le rayon de pointe en porte-à-faux approprié.
      REMARQUE : Lors de l’utilisation d’un porte-à-faux avec une pointe sphérique en porte-à-faux, le modèle Hertz fit doit être utilisé. Le porte-à-faux utilisé dans cette étude avait une pointe sphérique d’un rayon de 5 μm. Nous recommandons d’ajuster la courbe force-distance jusqu’à ce que la force maximale appliquée soit atteinte (point de consigne).
    4. Vérifiez visuellement l’ajustement de la courbe force-distance pour vous assurer de son exactitude. Cette étape doit être effectuée pour chacune des courbes force-distance analysées.
  7. Détermination de la profondeur d’indentation
    REMARQUE : Selon l’outil d’analyse de données utilisé, ce processus peut différer. L’expérimentateur peut facilement lire la profondeur d’indentation en suivant une série d’étapes incluses dans le programme d’analyse des données.
    1. Ouvrez chacune des courbes force-distance générées dans le logiciel d’analyse de données et sélectionnez le modèle d’ajustement de Hertz comme processus d’analyse.
    2. Appliquez l’option Soustraire le décalage de la ligne de base à la mise à zéro de l’axe de déviation verticale (axe y) et sélectionnez la fonction Décalage + Inclinaison .
    3. Utilisez la fonction Rechercher un point de contact pour identifier automatiquement le point de contact , qui est automatiquement ramené à une coordonnée x de zéro.
    4. Soustrayez la distance en tenant compte uniquement de la déflexion en porte-à-faux de la hauteur piézoélectrique brute pendant l’indentation à l’aide de la fonction Position verticale de la pointe .
    5. Sélectionnez l’option Ajustement de l’élasticité pour afficher la courbe force-distance traitée et sélectionnez la zone du graphique de manière à ce qu’elle s’aligne avec la valeur la plus négative sur l’axe vertical de position de la pointe (axe des abscisses).
    6. Lisez et documentez l’indentation à partir de la zone X Min dans l’onglet des paramètres. Enregistrez et documentez les résultats.

4. Analyse statistique

  1. Ouvrez le logiciel de statistiques. Sélectionnez Nouveau jeu de données dans le menu déroulant.
  2. Ouvrez l’onglet Vue des variables après avoir sélectionné le fichier DataSet . Définissez les variables numériques pour chaque catégorie de motifs cellulaires : chaînes simples = SS, chaînes doubles = DS, petits clusters = SC, grands clusters = BC, diffus et modules de Young.
  3. Dans l’onglet de la vue des données, entrez les données des modules de Young mesurés pour chacune des catégories de modèles cellulaires correspondantes. Analysez la distribution des données en sélectionnant Analyser dans la barre de menus, puis Analyse exploratoire des données.
  4. Sélectionnez Modules de Young comme variable dépendante et Modèle cellulaire comme liste de facteurs. Une boîte à moustaches utilisée pour la section des résultats s’affiche parmi les résultats dans le fichier de sortie.
  5. Pour effectuer une analyse statistique, choisissez Échantillons dépendants dans la section de test non paramétrique de l’onglet de la barre de menus d’analyse. Sélectionnez Modules de Young en tant que champs de test et Modèle cellulaire en tant que groupes sous l’onglet Champs. Appuyez sur Exécuter.
    REMARQUE : Les résultats sont affichés dans le fichier de sortie. Pour l’analyse statistique, un test de Friedman est effectué.
  6. Incorporez les valeurs p du test non paramétrique dans la boîte à moustaches créée à l’étape 4.4. Enregistrez les résultats en cliquant sur Fichier dans la barre de menus et en sélectionnant Enregistrer.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

À l’aide d’un dispositif de coupe fabriqué par nos soins, nous avons pu explanter et générer de petits disques cartilagineux (4 mm x 1 mm) à partir de condyles humains frais contenant un seul motif spatial cellulaire30 de cordes simples (SS, Figure 2A), de cordes doubles (DS), de petits amas (SC), de grands amas (BC ; Figure 2A) et diffuse (Figure 2B). Un explant de cartilage représentatif est représenté à

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En tant que maladie progressive et multifactorielle, l’arthrose déclenche des changements structurels et fonctionnels dans le cartilage articulaire. Tout au long de l’arthrose, les altérations des caractéristiques mécaniques s’accompagnent de modifications structurelles et biochimiques à la surface du cartilage articulaire27,31. Les premiers événements pathologiques survenant dans l’arthrose sont l’épuisement des protéoglycanes associée à une perturbation du rése...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions les chirurgiens orthopédistes du service de chirurgie orthopédique de l’hôpital universitaire de Tübingen pour avoir fourni les échantillons de tissus.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotéricine BMerck KGaA, Darmstadt, Allemagne1397-89-3
Tête de microscopique à force atomique (AFM)  ;CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, AllemagneJPK00518
Colle d’échantillon biocompatible  ;Bruker Nano GmbH, Berlin, AllemagneH000033
Calcein AMCayman, Ann Arbor, Michigan, États-Unis14948Coloration perméable à la membrane cellulaire, utilisée pour le tri des disques cartilagineux - imagerie en vue de dessus
CantileverBruker Nano GmbH, Berlin, AllemagneSAA-SPH-5UMNom de fréquence : 30KHz, k : 0,2N/m, nom de longueur : 115&mu ; m, largeur nom : 40&mu ; m,  ; Géométrie : Rectangulaire, pointe cylindrique avec un 5&mu ; m rayon d’extrémité Dispositif
traitement du cartilage  ;Fait maison  ;n/aDispositif de découpe en plastique contenant des ensembles prédéfinis de caméra CDD 4mmx1mm
intégrée dans l’AFMThe Imaging Source Europe GmbH, Brême, AllemagneDFK 31BF03
Caméra CDD intégrée dans le microscope à fluorescenceLeica Biosystems, Wetzlar, AllemagneDFC3000G
CryotomeLeica Biosystems, Wetzlar, AllemagneCM3050S  ;
Le logiciel de traitement des données pour l’AFMBruker Nano GmbH, Berlin, Allemagnen/aVersion 5.0.86, peut être téléchargé gratuitement à partir du site Web suivant https://customers.jpk.com
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)  ;Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Allemagne41966052
Microscope à fluorescence (Leica DMi8)Leica Biosystems, Wetzlar, Allemagne11889113
Support de cantiliver en bloc de verreBruker Nano GmbH, Berlin, AllemagneSP-90-05Bloc de verre extra long avec faces inclinées, spécialement conçu pour être utilisé avec le JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Microscope à contraste de phase inversé (intégré dans l’AFM)AxioObserver D1, microscopie Carl Zeiss, Iéna, AllemagneL201306_03
milieu L-15 de Leibovitz sans L-glutamine  ;Merck KGaA, Darmstadt, AllemagneF1315
Lames de microscope en verreSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-UnisCLS294775X50
Milieu de montage Avec DAPIibidi GmbH, Grä ; felfing, Allemagne50011Média de montage avec contre-coloration nucléaire DAPI (4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole) utilisée pour les disques cartilagineux  ; imagerie en vue latérale
Pénicilline-StreptomycineSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAP4333
Chauffage de boîte de Pétri associé à AFM (Petri Dish Heater)Bruker Nano GmbH, Berlin, AllemagneT-05-0117
ScalpelFeather Medical Products, Osaka, Japon2023-01
Jupe en siliconeBruker Nano GmbH, Berlin, Allemagnen/aMembrane de protection en silicone (D55x0.25) qui est placée sur la base de la base du bloc de verre pour éviter la condensation moyenne dans la tête AFM.
Programme statistique - SPSSIBM, Armonk, New York, États-UnisSPSS Statistics 22Vesion 280.0.0.0 (190)
Boîtes de culture tissulaire  ;TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, SuisseTPP93040
Tissue-tek O.C.T. CompoundSakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Pays-BasSA6255012Milieu d’enrobage soluble dans l’eau  ;
de

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