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Article de méthode

Modèle animal de poisson zèbre pour l’étude des réactions allergiques en réponse aux biomolécules de salive des tiques

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DOI :

10.3791/64378

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16 septembre 2022

 ,  , 
1SaBio. Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos IREC (CSIC-UCLM-JCCM), 2Department of Veterinary Pathobiology, College of Veterinary Medicine, Oklahoma State University

Dans cet article

Résumé

Ici, le poisson zèbre (Danio rerio) est utilisé comme modèle pour étudier les réactions allergiques et les réponses immunitaires liées au syndrome alpha-Gal (AGS) en évaluant les réactions allergiques à la salive des tiques et à la consommation de viande de mammifère.

Résumé

Les tiques sont des arthropodes vecteurs qui causent des maladies par transmission d’agents pathogènes et dont les piqûres pourraient être liées à des réactions allergiques ayant un impact sur la santé humaine dans le monde entier. Chez certaines personnes, des taux élevés d’anticorps anti-immunoglobuline E dirigés contre le glycane Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) ont été induits par des piqûres de tiques. Les réactions anaphylactiques médiées par les glycoprotéines et les glycolipides contenant le glycane α-Gal, présent dans la salive des tiques, sont liées au syndrome alpha-Gal (AGS) ou à l’allergie à la viande chez les mammifères. Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un modèle vertébré largement utilisé pour l’étude de différentes pathologies. Dans cette étude, le poisson zèbre a été utilisé comme modèle pour l’étude des réactions allergiques en réponse à la consommation de viande de α-Gal et de mammifères car, comme les humains, ils ne synthétisent pas ce glycane. À cette fin, les modèles comportementaux et les réactions allergiques hémorragiques de type anaphylactique en réponse à la salive de tiques Ixodes ricinus et à la consommation de viande de mammifère ont été évalués. Cette approche expérimentale permet d’obtenir des données valides qui soutiennent le modèle animal du poisson zèbre pour l’étude des allergies transmises par les tiques, y compris l’AGS.

Introduction

Les tiques sont des vecteurs d’agents pathogènes qui causent des maladies et sont également la cause de réactions allergiques, affectant la santé des humains et des animaux dans le mondeentier 1,2. Lors de l’alimentation des tiques, les biomolécules contenues dans la salive des tiques, en particulier les protéines et les lipides, facilitent l’alimentation de ces ectoparasites, évitant ainsi les défenses de l’hôte3. Certaines biomolécules salivaires avec des modifications du glycane Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) entraînent la production d’anticorps IgE anti-α-Gal élevés après la piqûre de tique, seulement chez certains individus, connu sous le nom de syndrome de α-Gal (AGS)4. Il s’agit d’une maladie associée à une allergie médiée par les IgE qui peut entraîner une anaphylaxie aux piqûres de tiques, à la consommation de viande de mammifères non primates et à certains médicaments tels que le cétuximab5. Les réactions au α-Gal sont souvent graves et peuvent parfois être fatales 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Le α-Gal se trouve chez tous les mammifères, à l’exception des singes de l’Ancien Monde, des singes et des humains qui n’ont pas la capacité de synthétiser α-Gal13. Cependant, les agents pathogènes tels que les bactéries et les protozoaires expriment ce glycane à leur surface, ce qui peut induire la production de grandes quantités d’anticorps IgM/IgG anti-α-Gal et peut constituer un mécanisme de protection contre ces agents pathogènes16,17. Cependant, la production d’anticorps anti-α-Gal augmente le risque de développer des allergies aux anti-α-Gal médiées par les IgE 7,13. Les anticorps naturels anti-α-Gal produits chez l’homme, principalement des sous-types IgM/IgG, pourraient être associés à cette modification présente dans les bactéries du microbiote intestinal16. L’AGS peut être un diagnostic clinique difficile, car la principale méthode de diagnostic à l’heure actuelle est basée sur des antécédents cliniques de réactions allergiques retardées, en particulier associées à des allergies alimentaires (c.-à-d. prurit, urticaire localisé ou œdème de Quincke récurrent à l’anaphylaxie, à l’urticaire et aux symptômes gastro-intestinaux) et la mesure des taux d’anticorps IgE anti-α-Gal9. Les résultats actuels suggèrent que les piqûres de tiques constituent l’un des principaux risques liés à l’apparition d’AGS 18,19, à une augmentation de 20 fois ou plus des taux d’IgE à α-Gal après une piqûre de tique 19, à des antécédents de piqûres de tiques chez les patients atteints d’AGS20,21,22, à l’existence d’anticorps réactifs aux antigènes à tiques chez les patients atteints d’AGS 19, et que les IgE anti-α-Gal sont fortement liées aux taux d’IgE anti-tiques19,23, mais que d’autres études sont nécessaires pour évaluer quelles biomolécules sont réellement impliquées.

En outre, un autre scénario possible est celui des patients qui présentent de fortes réactions allergiques aux piqûres de tiques et des taux élevés d’anticorps anti-α-Gal IgE, mais qui sont tolérants à la consommation de viande de mammifères12. Par conséquent, l’allergie à la viande chez les mammifères pourrait être un type particulier d’allergie liée aux piqûres de tiques. Les principales espèces de tiques associées à l’AGS sont Amblyomma americanum (États-Unis), Amblyomma sculptum (Brésil), Amblyomma testudinarium et Haemaphysalis longicornis (Japon), Ixodes holocyclus (Australie) et Ixodes ricinus (principal vecteur de la borréliose de Lyme en Europe )11,24.

Le seul modèle qui a été utilisé pour évaluer la production d’IgE liée aux piqûres de tiques est le modèle murin génétiquement modifié avec le gène de la α-1,3-galactosyltransférase assommée (α-Gal KO)25,26 parce que, comme d’autres mammifères, les souris expriment également α-Gal sur les protéines et les lipides et ne produisent pas d’IgE à α-Gal. Cependant, le poisson zèbre (Danio rerio) est un modèle utile pour la recherche biomédicale appliquée aux mammifères car il partage de nombreuses similitudes anatomiques avec les mammifères et, comme les humains, est également incapable de synthétiser α-Gal. Étant donné que le α-Gal n’est pas produit naturellement chez le poisson zèbre, il s’agit d’un modèle abordable, facile à manipuler et permettant une taille d’échantillon élevée pour l’étude des réactions allergiques liées au α-Gal.

Dans cette étude, le poisson zèbre est utilisé comme organisme modèle pour caractériser et décrire les réactions allergiques locales, les modèles comportementaux et les mécanismes moléculaires associés à la réponse à la sensibilisation percutanée à la salive des tiques26,27 et à la consommation subséquente de viande de mammifère. À cette fin, les poissons sont exposés à la salive des tiques par injection intradermique, puis sont nourris avec des aliments pour chiens, qui contiennent des produits dérivés de viande de mammifères adaptés à l’usage animal qui contiennent α-Gal27, puis les réactions allergiques connexes possibles sont évaluées. Cette méthode peut être appliquée à l’étude d’autres biomolécules liées aux processus allergiques, en particulier ceux liés à l’AGS.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de Castille-La Manche dans le cadre de l’étude « Évaluation de la réponse immunitaire au vaccin inactivé contre M. bovis et provocation avec M. marinum dans le numéro de modèle du poisson zèbre PR-2017-05-12 ».

Les tiques ont été obtenues à partir de la colonie de laboratoire, où des échantillons représentatifs de tiques de la colonie ont été testés par PCR pour les agents pathogènes communs des tiques afin de confirmer l’absence d’agents pathogènes, et conservés à l’Institut de parasitologie, Centre de biologie de l’Académie tchèque des sciences (IP BC CAS), République tchèque.Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément à la loi sur la protection des animaux de la République tchèque n ° 246/1992 Sb (approbation éthique n ° 34/2018).

1. Traitement du poisson zèbre

NOTE: L’essai est conçu pour évaluer les réactions allergiques et la réponse immunitaire chez le poisson zèbre traité avec de la salive de tique en réponse à la consommation de viande de mammifère.

  1. Traiter le poisson (comme expliqué à la rubrique 4) avec de la salive de tique, Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) commerciale (voir le tableau des matières), utilisée comme témoin positif, avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) comme témoin négatif. Le poisson-zèbre adulte est réparti au hasard en trois groupes équilibrés entre les sexes (figure 1).
    REMARQUE : Tout autre composé souhaité lié à l’AGS peut être évalué à l’aide de ce modèle.

2. Extraction de la salive des tiques Ixodes ricinus

  1. Utilisez des tiques femelles semi-engorgées exemptes d’agents pathogènes nourries pendant 6-7 jours sur des cobayes.
  2. Traiter la tique avec 5 μL d’une solution à 2 % (poids/vol) de chlorhydrate de pilocarpine dans du PBS (voir le tableau des matières) à pH 7,4 dans l’hémocèle à l’aide d’une seringue de 50 μL avec une aiguille de 0,33 mm, comme décrit précédemment28 , pour induire la production de salive de tiques.
    REMARQUE: Les tiques sont manipulées à l’aide de forceps; Faites attention à ne pas appliquer trop de force lorsque vous les saisissez.
  3. Recueillir la salive à l’aide d’un embout de 10 μL monté sur une micropipette.
    1. Introduisez soigneusement l’embout à l’intérieur de l’hypostome de la tique.
    2. Conservez la salive dans un tube de 1,5 ml sur de la glace, mettez-la en piscine et conservez-la à -80 °C comme décrit précédemment27.
  4. Déterminer la concentration en protéines salivaires, pour établir la quantité de protéines à injecter dans le poisson comme dans les études précédentes27 à l’aide d’une trousse de dosage des protéines BCA (voir le tableau des matériaux) en suivant les recommandations du fabricant.

3. Entretien du poisson zèbre

  1. Maintenir le poisson zèbre dans un système d’eau à écoulement continu à 27 °C avec un cycle lumière/obscurité de 14 h/10 h (figure 2).
  2. Nourrissez les poissons deux fois par jour à 9 h 30 et à 13 h 30 avec des aliments secs pour poissons (50 à 70 μg/poisson) jusqu’au jour 2.
  3. Nourrir les poissons deux fois par jour à 9 h 30 et 13 h 30 avec des aliments secs pour chiens (50-70 μg/poisson) du jour 2 après l’injection de traitement jusqu’à la fin de l’expérience

4. Injection de poisson zèbre

  1. Sélectionnez 10 poissons par groupe avec un ratio femelles/mâles similaire et un poids similaire.
    REMARQUE : Le groupe 1 contient les poissons injectés avec du PBS, le groupe 2 contient les poissons injectés avec de la salive de tique et le groupe 3 contient les poissons injectés avec du α-Gal.
  2. Anesthésier brièvement le poisson par immersion dans du méthanesulfonate de tricaïne à 0,02 % (MS-222) (film 1).
    REMARQUE: Les poissons correctement anesthésiés montrent une respiration normale et aucune baignade, alors qu’ils pourraient être placés au fond du réservoir d’eau ou flottants. Chaque poisson doit être anesthésié individuellement pour éviter d’éventuels dommages physiologiques.
  3. Capturez les poissons anesthésiés à l’aide d’un filet de pêche.
  4. Placez le poisson sur sa moitié latérale à l’aide d’une pince ou des mains avec précaution, sur une éponge humide, avec la nageoire caudale du côté droit pour injecter les composés dans le même sens afin de contrôler les lésions.
  5. Injecter des groupes de poissons par voie intradermique, comme dans les études précédentes26, dans le muscle à 5 mm de la nageoire caudale et à un angle de 45° par rapport au corps du poisson (Film 2). Utiliser le traitement approprié aux jours 0, 3 et 8 tel que décrit précédemment 27 avec une seringue de 100 μL munie d’une aiguille de 1 cm, 29 G contenant 1 μL (avec 9 μg/μL de protéines) de salive d’I. ricinus dans 10 μL de PBS (salive de tiques), 5 μg de α-Gal dans 10 μL de PBS (α-Gal)27,  et 10 μL de PBS (figure 3).
    REMARQUE : La manipulation doit être effectuée rapidement et avec soin afin d’éviter tout dommage physique à l’animal.
    D’autres biomolécules dans la salive des tiques peuvent être évaluées en suivant ce protocole.
  6. Replacez le poisson traité dans un réservoir d’eau douce sans anesthésie pour la récupération.
    NOTE: Tous les poissons du même groupe peuvent être placés dans le même réservoir d’eau pour récupération.

5. Alimentation du poisson zèbre

  1. Écrasez la nourriture pour chiens avec un mortier et un pilon.
  2. Nourrir 50 à 70 μg/poisson deux fois par jour à 9 h 30 et à 13 h 30 avec des aliments secs pour poissons jusqu’au jour 2.
  3. Nourrir 50 à 70 μg/poisson deux fois par jour à 9 h 30 et à 13 h 30 avec de la purée pour chiens du jour 2 après l’injection de traitement jusqu’à la fin de l’expérience le jour 8.
    REMARQUE : Si les marqueurs d’immunité ou les titres d’anticorps dirigés contre les anticorps α-Gal ou IgE en réponse aux traitements ou à l’alimentation tout au long des différentes inoculations doivent être évalués, l’alimentation serait nécessaire jusqu’à la fin de l’expérience.

6. Évaluation des réactions allergiques, des lésions et du comportement chez le poisson zèbre

  1. Examiner les réactions allergiques de type hémorragique (rougeur de la peau, décoloration et hémorragie) à l’aide d’une loupe ou d’un stéréomicroscope pour en vérifier l’exactitude et indiquer l’emplacement de leur apparence sur le poisson en suivant la catégorisation incluse dans le tableau 1 (figure 4A).
    REMARQUE : Les réactions allergiques présentées à la figure 4 sont apparues après l’injection de salive de tique et la consommation d’aliments contenant de la viande rouge. Par conséquent, les réactions décrites sont le type de réactions associées à l’AGS, car des réactions similaires apparaissent dans le contexte clinique.
    1. Observez si une réaction apparaît après les traitements et lors de l’administration de nourriture deux fois par jour pendant que les poissons sont dans le réservoir d’eau.
  2. Examiner le comportement des poissons en évaluant les changements27 dans les habitudes de nage (mobilité, vitesse, immobile au fond du réservoir d’eau et nage en zigzag) en suivant la catégorisation incluse dans le tableau 1.
  3. Évaluer la mortalité accumulée, en indiquant le nombre de poissons morts, y compris l’heure et le jour de la mort (figure 4B).
    REMARQUE : Tous les paramètres sont évalués juste après le traitement ou après le changement d’aliment et suivis quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérience, le jour 8, catégorisant les variables qualitatives (tableau 1). À titre de recommandation, cette évaluation devrait être menée par un professionnel ayant des connaissances sur le poisson zèbre pour envisager des changements de comportement en fonction de ses antécédents et de son expérience de travail avec ce modèle animal.
  4. Calculez le nombre de poissons-zèbres par jour avec les réactions allergiques signalées, les comportements anormaux et les changements d’alimentation dans chaque groupe et comparez les groupes par un test ANOVA unidirectionnel.

7. Prélèvement d’échantillons

  1. Euthanasier le poisson par immersion dans du MS-222 à 0,04 % le jour 8.
    REMARQUE: Prélevez également les échantillons des poissons qui meurent de réactions allergiques pendant l’essai.
  2. Fixez le poisson sur une assiette de paraffine avec des épingles.
  3. Prélever le sérum des vaisseaux de sang branchial29 des poissons immédiatement après l’euthanasie, lorsque les branchies sont encore irriguées avec du sang, à l’aide d’une seringue de 0,5 mL munie d’une aiguille de 1 cm de29 G. Conservez-le dans un tube de 1,5 mL à -20 °C jusqu’à utilisation (Film 3).
  4. Couper le poisson sagittalement avec une lame de scalpel et évaluer les lésions internes (lésions hémorragiques ou granulomes)27,30 si elles apparaissent.
    REMARQUE: Les lésions n’apparaissent pas nécessairement, mais doivent être enregistrées si elles le font.
  5. Prélever l’intestin (film 4) et le rein (film 5) de chaque poisson dans des tubes vides séparés de 1,5 mL, comme décrit précédemment31, et les conserver à -80 °C (figure 4C).
  6. Extraire l’ARN total des échantillons d’intestin et de rein du poisson zèbre à l’aide d’une trousse de purification de l’ARN (voir le tableau des matériaux).
  7. Analyser l’expression des gènes liés à la réponse immunitaire telle que décrite précédemment30,32 (voir le tableau 2 pour les séquences d’amorce) chez le poisson zèbre, en effectuant une réaction en chaîne quantitative de transcription inverse-polymérase (RT-qPCR) en utilisant un mélange de transcription inverse pour RT-qPCR (voir le tableau des matériaux), conformément aux instructions du fabricant. Normaliser les valeurs cT de l’ARNm par rapport à D. rerio GAPDH et comparer entre les groupes (poissons traités avec de la salive, α-Gal et les groupes traités par PBS) à l’aide d’un test t de Student avec une variance inégale.
  8. Déterminer les titres d’anticorps IgM qui reconnaissent le α-Gal chez le poisson zèbre dans les échantillons de sérum par ELISA, comme décrit précédemment27,30. Enregistrer les titres d’anticorps sous forme de valeurs O.D.450 nm, à l’aide d’un lecteur de plaque, et comparer entre les groupes (poissons traités avec de la salive, α-Gal et les groupes traités PBS) à l’aide d’un test t de Student avec une variance inégale.
    REMARQUE : La détermination des titres d’anticorps IgM et l’analyse des gènes d’expression sont facultatives et ne sont effectuées que si des informations immunologiques sont requises. Le mélange RT-qPCR est un kit de synthèse d’ADNc premier brin pour l’analyse de l’expression génique à l’aide de la qPCR en temps réel.

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Résultats

Le protocole présenté ici est basé sur plusieurs aspects d’expériences précédemment publiées27,30 et de résultats réalisés dans notre laboratoire où le modèle de poisson zèbre est établi et validé pour l’étude de l’AGS et de la réponse immunitaire au α-Gal car les humains et les poissons-zèbres ne synthétisent pas cette molécule13. Ce modèle permet la caractérisation et l’évaluation d’une variété de réactions allergiques résultant de la ré...

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Discussion

Le poisson zèbre est un modèle rentable et facile à manipuler qui a également été un outil très pratique pour l’étude des mécanismes moléculaires de la réponse immunitaire, des maladies pathogènes, des tests de nouveaux médicaments, de la vaccination et de la protection contre les infections33,34,35. L’étude sur le comportement du poisson zèbre est utile car des études antérieures ont montré que certaines espèces de poissons res...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier les membres du groupe SaBio pour leur collaboration dans la conception expérimentale et l’assistance technique avec l’installation expérimentale sur les poissons et Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, Espagne) pour avoir fourni le poisson zèbre. Ce travail a été soutenu par Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Espagne et EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras est financée par le Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Espagne, subvention IJC2020-042710-I.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de 1,5 mLVWR525-0990
All Prep DNA/RNAQiagen80284
Installations
Kit de dosage des protéines BCA  ;Thermo Fisher Scientific23225
Kit de disectionVWR631-1279
Nourriture pour chiens - Rouge ClassicAcana
Plaques ELISA-96 puitsThermo Fisher Scientific10547781
Gala1-3Gal-BSA 3 (&alpha ;-Gal)  ;DextraNGP0203
iScript Reverse Transcription SupermixSupermix 1708840
Seringues d’un microlitreHamilton7638-01
Lecteur de plaquestout
Phosphate saline tamponnéeSigmaP4417-50TAB
chlorhydrate de pilocarpine  ;SigmaP6503
Pointe de pipette P10  ;VWR613-0364
Pointe de pipette P1000VWR613-0359
Poisson tropical alimentaire de qualité supérieureDAPC
Sponge Animal Holder  ;Fabriqué à partir de mousse de rebut,
Stéréomicroscopen’importe quel
thermocycleur, PCR en temps réel, n’importe quel
méthanesulfonate de tricaïne (MS-222)SigmaE10521
aquatiques,

Références

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