Un modèle murin d’intubation orotrachéale et de chirurgie de reperfusion d’ischémie pulmonaire ventilée

Les lésions d’ischémie par reperfusion (IR) peuvent survenir lorsque le flux sanguin est rétabli dans un lit d’organe ou de tissu après une certaine période d’interruption. Dans les poumons, la RI peut survenir isolément ou en association avec d’autres processus nuisibles tels qu’une infection, une hypoxie, une atélectasie, un volutraumatisme (dû à des volumes courants élevés pendant la ventilation mécanique), un barotraumatisme (pression maximale élevée ou soutenue pendant la ventilation mécanique) ou une contusion pulmonaire contondante (non pénétrante) ^1,2,3 . Il subsiste plusieurs lacunes dans nos connaissances sur les mécanismes de l’IRLI et l’impact des processus concomitants (p. ex. infection) sur les résultats de l’IRLI, et les options de traitement de l’IRLI sont limitées. Un modèle in vivo de LIRI pur est nécessaire pour identifier la physiopathologie des lésions IR pulmonaires de manière isolée et pour étudier sa contribution à tout processus multi-hit dont la lésion pulmonaire est une composante.

Les modèles IR pulmonaires murins peuvent être utilisés pour étudier la physiopathologie spécifique aux poumons de plusieurs processus, y compris la transplantation pulmonaire³, l’embolie pulmonaire⁴ et les lésions pulmonaires à la suite d’un traumatisme hémorragique avec réanimation⁵. Les modèles actuellement utilisés comprennent la transplantation pulmonaire^{chirurgicale 6}, le clampage hilaire⁷, la perfusion pulmonaire ex vivo ⁸ et l’IR⁹ pulmonaire ventilé. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour un modèle IR pulmonaire ventilé murin de lésion pulmonaire stérile. Les avantages de cette approche (Figure 2) sont multiples, notamment le fait qu’elle induit une hypoxie minimale et une atélectasie minimale, et qu’il s’agit d’un modèle de chirurgie de survie qui permet des études à long terme.

Les raisons de choisir ce modèle de LIRI par rapport à d’autres modèles tels que le clampage hilarant et les modèles de perfusion ex vivo sont les suivantes: ce modèle minimise les contributions inflammatoires de l’atélectasie, de la ventilation mécanique et de l’hypoxie; il préserve la ventilation cyclique; il maintient un système immunitaire circulatoire in vivo intact qui peut répondre à la lésion IR; Enfin, en tant que procédure de survie, elle permet l’analyse à plus long terme des mécanismes de génération de blessures secondaires (modèles à 2 coups) et de résolution des blessures. Dans l’ensemble, nous pensons que ce modèle d’IR pulmonaire ventilé fournit la forme « la plus pure » de lésion IR qui puisse être étudiée expérimentalement.

D’autres publications ont décrit l’utilisation de l’intubation orotrachéale de souris pour effectuer des injections ou des installations informatiques^10,11, mais pas comme point de départ d’une chirurgie de survie comme c’est le cas dans ce modèle. La mise en place d’un tube orotrachéal permet la réalisation d’une chirurgie pulmonaire en permettant l’affaissement du poumon opératoire. Il permet également la réinflation du poumon à la fin de la procédure, ce qui est essentiel pour le pneumothorax et pour la capacité de la souris à revenir à la ventilation spontanée à la fin des procédures. Enfin, le retrait du tube orotrachéal sécurisé est une procédure simple qui, contrairement à une trachéotomie invasive, est compatible avec une chirurgie de survie. Cela permet de mener des études de recherche à plus long terme axées sur la compréhension de la progression et de la résolution de l’IRLI et des troubles associés, ainsi que sur la création de modèles de blessures chroniques.

Toutes les procédures et étapes décrites ci-dessous ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Californie à San Francisco. N’importe quelle souche de souris peut être utilisée, bien que certaines souches aient une réponse inflammatoire IR pulmonaire plus robuste que d’autres¹². Les souris âgées d’environ 12 à 15 semaines (30 à 40 g) ou plus tolèrent et survivent mieux à la chirurgie IR pulmonaire que les souris plus jeunes. Les souris mâles et femelles peuvent être utilisées pour ces chirurgies.

1. Protocole d’intubation de souris

1. Anesthésie et préparation à l’intubation
   1. Essuyez l’abdomen de la souris avec un tampon à l’éthanol. Anesthésiez la souris avec une injection intrapéritonéale de tribromoéthanol (250-400 mg / kg). Évaluer la profondeur appropriée de l’anesthésie par l’absence de réflexe de retrait de la pédale. Placez la pommade lubrifiante pour les yeux maintenant ou plus tard (étape 2.1.4).
      REMARQUE: Pour cette procédure, le tribromoéthanol (et l’étomidate comme option alternative) fournit un plan anesthésique stable sans affecter les conditions hémodynamiques requises pour cette chirurgie. Cet anesthésique n’est utilisé qu’une seule fois pour éviter le risque d’adhérences péritonéales. L’isoflurane pourrait également être utilisé, mais nous ne l’utilisons pas ici. Le praticien est libre d’utiliser la recette anesthésique qu’il juge appropriée.
   2. Placer la souris anesthésiée sur un support d’intubation ou un support en plastique en décubitus dorsal, suspendu par ses incisives supérieures sur des sutures 4-0 bouclées (soie ou autre) sur deux ancrages de support.
   3. Pour maintenir la souris immobilisée pendant la procédure d’intubation, collez lâchement la partie inférieure de la poitrine (ou les deux membres supérieurs) à la plate-forme.
   4. Placez doucement la lumière flexible à fibre optique sur la trachée de la souris, légèrement en dessous des cordes vocales. Ajustez le niveau d’éclairage de sorte que seul un champ sombre soit visible lorsque vous regardez dans l’oropharynx de la souris, à l’exception de la lumière rouge émanant de sous les cordes vocales, démontrant la cible pour le placement éventuel du tube endotrachéal. Notez que les mouvements des cordes vocales doivent être visibles à l’œil nu ou, si nécessaire, sous grossissement.
2. Procédure d’intubation
   1. Tenez la pince à épiler avec la main dominante et utilisez-les pour saisir doucement et tirer la langue hors de la cavité buccale.
   2. Ouvrez la mâchoire inférieure à l’aide d’une pince tenue par la main non dominante, puis poussez la pince dans le larynx pour soulever doucement l’épiglotte. À ce stade, libérez la langue de la pince à épiler.
   3. Recherchez les cordes vocales. Ils doivent s’ouvrir et se fermer en fonction de chaque respiration. En tenant la canule avec le fil guide préchargé, insérez la pointe du fil à travers les cordes vocales.
   4. En faisant très attention à ne pas déplacer le fil en tenant une partie de celui-ci qui se trouve à l’extérieur de la canule mais juste au-dessus des cordes vocales, retirez la canule, en laissant juste le fil en place avec son extrémité distale dans la trachée.
   5. À ce stade, effectuez une deuxième visualisation des cordes vocales pour confirmer que l’extrémité distale du fil reste passée à travers les cordes vocales éclairées et dans la trachée, et n’est pas dans l’œsophage non éclairé.
   6. Tenez le fil à l’extérieur de la bouche avec la pince incurvée dans la main gauche, stabilisée contre une surface dure, et avancez délicatement le cathéter 20G avec des ailes de ruban adhésif sur le fil.
   7. Une fois que l’extrémité distale du fil émerge de l’extrémité arrière du cathéter 20G ou du tube endotrachéal, maintenez cette extrémité avec la pince incurvée et avancez doucement le cathéter 20G dans la trachée.
   8. Retirez délicatement le fil de l’extrémité distale du cathéter 20G avec les pinces incurvées sans déloger l’emplacement du cathéter.
   9. Connectez brièvement le cathéter au ventilateur avant de le fixer pour confirmer le placement approprié dans la trachée et non dans l’œsophage. Confirmer la mise en place trachéale par l’observation des mouvements bilatéraux de la paroi thoracique dépendants de la ventilation mécanique et de l’absence de gonflage de l’estomac.
3. Post-intubation
   1. Débranchez le cathéter du ventilateur. Fixez les ailes du ruban adhésif (attachées au cathéter) à travers la lèvre inférieure de la souris à l’aide d’une suture en vicryle 4-0 pour fixer fermement le tube endotrachéal (ETT) à la souris pendant toutes les procédures / manipulations ultérieures.
      REMARQUE: Alternativement, du ruban de soie ou un autre ruban peut être utilisé pour fixer l’ETT, mais il faut prendre soin d’éviter le déplacement de l’ETT pendant le déplacement de l’animal du traîneau d’intubation à la surface chirurgicale.
   2. Retirez délicatement la souris du traîneau d’intubation. Connectez brièvement le cathéter au ventilateur réglé à un volume courant de 0,2 à 0,225 mL et à une fréquence respiratoire de 120 à 150 respirations par minute pour confirmer le placement trachéal correct du tube orotrachéal, puis déconnectez-vous de la souris qui respire spontanément par le tube orotrachéal.
   3. Ne laissez pas l’animal sans surveillance à partir de ce moment jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment conscience pour maintenir une position couchée sternale à la fin de la procédure.

2. Protocole chirurgical d’ischémie pulmonaire et de reperfusion (IR)

1. Analgésie et préparation du site chirurgical
   1. Essuyez l’abdomen de la souris avec un tampon d’éthanol et injectez de la buprénorphine (0,05-0,1 mg / kg) par voie intrapéritonéale.
   2. Rasez les cheveux sur la région du thorax gauche jusqu’à l’omoplate gauche. Enlevez l’excès de poils rasés à l’aide de tampons imbibés d’alcool.
      NOTE: Les étapes 2.1.1 et 2.1.2 peuvent également être effectuées avant l’intubation s’il y a un risque de déplacement de l’ETT lorsqu’il est fixé avec du ruban de soie.
   3. Placez la souris sur un coussin chauffant en position latérale gauche ou tournée 3/4 et connectez le tube trachéal sur le ventilateur avec un volume courant de 0,2-0,225 mL (~ 8 mg / kg) et une fréquence respiratoire de 120-150 respirations par minute. N’utilisez pas d’oxygène supplémentaire pour cette procédure.
   4. Appliquez un lubrifiant pour les yeux avec un écouvillon stérile à pointe de coton. Tournez la souris sur le côté gauche 3/4 vers le haut et immobilisez les quatre membres et la queue avec du ruban de laboratoire.
   5. Désinfectez la zone de peau rasée et la fourrure environnante avec de la povidone iodée et attendez que la solution sèche. Ensuite, couvrez le champ chirurgical avec un champ stérile ou un film plastique transparent et créez une ouverture rectangulaire dans le champ ou le film plastique pour le champ chirurgical.
2. Intervention chirurgicale
   1. Confirmer le niveau approprié d’anesthésie (fourni par l’administration de tribromoéthanol et de buprénorphine tel que décrit précédemment) en testant la réponse au pincement des orteils.
   2. À l’aide d’une paire de ciseaux tranchants et d’une paire de pinces plus grandes (pinces à motif étroit ou similaires), faites une incision cutanée transversale de 2 cm sous l’angle inférieur de l’omoplate dans le thorax latéral gauche. Utilisez les ciseaux et une paire de pinces plus fines (pinces graefe extra fines ou similaires) pour couper dans la couche musculaire et disséquer jusqu’aux côtes.
   3. Identifiez le deuxième espace intercostal et tenez la deuxième côte avec la pince extra fine. En tirant la côte vers le haut, utilisez une lame de scalpel #11 ou #12 (incurvée) stérile (aucune poignée nécessaire) pour entrer dans l’espace pleural en séparant et en coupant les muscles intercostaux du 2^{ème espace.} Envisagez de suspendre la ventilation pour réduire les blessures à l’apex du poumon gauche.
   4. Insérez trois rétracteurs stérilisés. Utilisez le céphalade rétracteur le plus petit/le plus étroit le long de l’orientation des nervures, le rétracteur de taille moyenne à gauche le long de la 2e côte et le plus grand rétracteur à droite le long de la surface de la 3e^côte.
   5. Ouvrez la poitrine avec une rétraction lente et progressive à l’aide des cordons élastiques. Exposer et identifier l’artère pulmonaire gauche (AP) en éloignant l’apex du poumon gauche à l’aide d’un écouvillon stérile à pointe de coton.
   6. Utilisez les micro-pinces, les pinces ultrafines dans la main droite et les pinces PA ou dilatatrices vasculaires dans la main gauche, pour exposer doucement et créer le champ dans lequel le PA gauche et la bronche sont tous deux visibles.
   7. À l’aide de la pince PA, prenez la sonde gauche et tirez doucement mais fermement vers le haut et céphalade pour visualiser la bronche transparente ci-dessous. Augmenter le grossissement du microscope à dissection (voir la liste des équipements pour plus de détails) à ce stade au maximum (2x).
      REMARQUE : Stérilisez tout l’équipement avant utilisation. De plus, pour maintenir la stérilité, seules les pointes des instruments chirurgicaux doivent entrer dans le champ chirurgical stérile.
   8. Tout en rétractant le PA loin de la bronche, passez soigneusement la pince ultrafine fermée à travers l’espace entre le PA gauche et la bronche. Ensuite, utilisez ces forceps pour tenir et tirer un 7-0 ou 8-0 suture proléne à travers l’espace entre l’artère pulmonaire gauche (ci-dessus) et la bronche (ci-dessous).
   9. Encerclez le PA gauche en attachant un slipknot pour créer une occlusion dans le PA. L’interruption du flux sanguin est facilement visualisée au microscope. Cela marque le début de la période ischémique.
   10. Externalisez l’extrémité libre du nœud à travers un point d’entrée différent dans le thorax gauche antérieur à l’aide d’une aiguille 24G-28G et fixez l’extrémité de la suture avec un petit morceau de ruban adhésif pour une identification plus facile plus tard.
   11. Regonflez le poumon pour expulser autant d’air que possible de la cavité thoracique à l’aide d’une valve / tubulure PEEP sur le ventilateur pour rongeurs. Ensuite, fermez la cage thoracique avec deux sutures en nylon interrompues 4-0.
   12. Fermez la couche musculaire et sous-cutanée avec une suture en nylon 4-0. Ensuite, appliquez deux ou trois gouttes de bupivacaïne topique (0,5%) sur l’incision. Utilisez une suture en nylon 4-0 pour fermer la couche de peau avec une suture courante.
3. Soins postopératoires
   1. Lorsque la ventilation spontanée a repris, débranchez le tube endotrachéal du ventilateur et extuberez la souris.
   2. Placez la souris sur le coussin chauffant pour maintenir la température corporelle pendant la récupération post-anesthésique précoce.
   3. Surveillez attentivement la souris pendant qu’elle se remet d’une anesthésie générale. Tirez doucement le nœud sillon extériorisé à la fin de la période ischémique (30 min ou 1 h).
   4. Déplacez la souris du coussin chauffant vers une cage une fois qu’elle a montré des signes de récupération : auto-redressement et/ou mouvement.
   5. Après la période de reperfusion (1 h ou 3 h), euthanasier l’animal et prélever du sang par ponction cardiaque et du tissu pulmonaire pour une analyse plus approfondie. Pour 1 h de reperfusion, prélever du plasma pour l’ELISA, du tissu pour l’ARN et l’analyse des protéines; Pour 3 h de reperfusion, prélever en outre du tissu pour l’histologie.

Inflammation générée par une lésion unilatérale de reperfusion pulmonaire stérile (IR) : Après 1 h d’ischémie, nous avons observé une augmentation des taux de cytokines dans le sérum et dans le tissu pulmonaire par ELISA et qRT-PCR qui ont culminé à 1 h après la reperfusion et sont rapidement revenus à la ligne de base dans les 12-24 heures après la reperfusion13. Pour les échantillons prélevés 3 h après la reperfusion, nous avons observé une infiltration intense de neutrophiles dans le tissu pulmonaire gauche et noté que l’intensité de l’inflammation dépendait de la souche de souris utilisée (Figure 1). Notamment, l’inflammation qui est générée en l’absence d’un processus infectieux coexistant ou ultérieur disparaît progressivement et les poumons reviennent à leur architecture pulmonaire normale (par histopathologie) avec efférocytose ou sortie des neutrophiles des poumons blessés dans les 12-24 heures après la reperfusion13. Il convient de noter que nous avons observé une inflammation légère mais détectable, qui était en grande partie neutrophile et a également été observée dans le poumon droit non opératoire, ce qui, selon nous, est dû à une lésion d’hyperperfusion14.

Le prélèvement d’échantillons de tissus pour ce modèle d’IR pulmonaire n’est pas différent de celui des autres modèles d’IR pulmonaire : le sang peut être prélevé pour la préparation du plasma par ponction cardiaque ou canulation IVC ; Le tissu pulmonaire peut être prélevé pour la préparation de protéines ou d’ARN, puis pour une analyse plus approfondie par transfert Western, ELISA ou qPCR.

Figure 1 : Histologie des coupes pulmonaires chez des souris de type sauvage de deux souches différentes. (A) souris C3H et (B) C57BL/6. Les deux souches de souris ont reçu une ischémie de 1 h et une reperfusion de 3 h, et le tissu est montré à un grossissement de 10x. Le grossissement 40x est indiqué dans l’encart. Une infiltration neutrophile a été observée dans les deux souches, la souche C3H présentant des niveaux d’inflammation nettement plus élevés que C57BL/6, comme indiqué précédemment12. La barre d’échelle est de 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Comparaison des avantages (texte bleu) et des inconvénients (texte rouge) des trois modèles expérimentaux de lésions IR pulmonaires (LIRI) chez la souris les plus couramment utilisés. Cette comparaison met en évidence le choix de l’IR pulmonaire ventilée (décrite dans ce manuscrit) comme modèle idéal pour étudier l’IR pulmonaire pure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.