Article de méthode

Dispositif de thérapie photodynamique construit en interne et à base de diodes électroluminescentes pour améliorer la cytotoxicité des vertéporfines dans un modèle de culture cellulaire 2D

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DOI :

10.3791/64391

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13 janvier 2023

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1Graduate Program in Pharmaceutical Sciences, Laboratory of Cancer Drug Resistance, Federal University of Parana, 2Graduate Program in Pharmaceutical Sciences, Federal University of Parana, 3Federal Institute of Parana

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons un dispositif nouveau, simple et peu coûteux pour effectuer avec succès des tests de thérapie photodynamique in vitro (PDT) en utilisant une culture cellulaire HeLa bidimensionnelle et une vertéporfine comme photosensibilisant.

Résumé

Cet article décrit un dispositif nouveau, simple et peu coûteux pour effectuer des tests de thérapie photodynamique in vitro (PDT), appelé PhotoACT. Le dispositif a été construit à l’aide d’un ensemble de diodes électroluminescentes programmables (LED) conventionnelles, d’un module d’affichage à cristaux liquides (LCD) et d’un capteur de lumière connecté à une carte de microcontrôleur commerciale. La structure à base de boîte du prototype a été réalisée avec des panneaux de fibres de densité moyenne (MDF). Le compartiment interne peut attribuer simultanément quatre microplaques multipuits de culture cellulaire.

Comme preuve de concept, nous avons étudié l’effet cytotoxique de la vertéporfine photosensibilisante (PS) contre la lignée cellulaire HeLa en culture bidimensionnelle (2D). Les cellules HeLa ont été traitées avec des concentrations croissantes de vertéporfine pendant 24 heures. Le milieu surnageant contenant du médicament a été jeté, les cellules adhérentes ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et un milieu sans médicament a été ajouté. Dans cette étude, l’effet de la vertéporfine sur les cellules a été examiné soit sans exposition à la lumière, soit après une exposition de 1 h à la lumière en utilisant des valeurs rouge-vert-bleu (RVB) de 255, 255 et 255 (fluence moyenne de 49,1 ± 0,6 J / cm2). Après 24 h, la viabilité cellulaire a été évaluée par le dosage du bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT).

Les résultats expérimentaux ont montré que l’exposition des cellules traitées à la vertéporfine à la lumière du dispositif renforce l’effet cytotoxique du médicament via un mécanisme médié par les espèces réactives de l’oxygène (ROS). De plus, l’utilisation du prototype décrit dans ce travail a été validée en comparant les résultats avec un dispositif PDT commercial. Ainsi, ce prototype de thérapie photodynamique à base de LED représente une bonne alternative pour les études in vitro de la PDT.

Introduction

Parmi les maladies non transmissibles les plus mortelles, le cancer est l’une des principales causes mondiales de décès prématuré. Il a représenté près de 10 millions de décès en 2020, soit environ un décès sur six dans le monde1. De plus, le phénomène de multirésistance (MDR) représente une menace considérable pour la santé publique, car les protocoles chimiothérapeutiques approuvés n’atteignent pas les stades de rémission pour cette condition clinique2. Les cellules cancéreuses peuvent développer une résistance à la chimiothérapie par plusieurs mécanismes; cependant, la surexpression de certains transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP (ABC) - les pompes à efflux dépendantes de l’ATP - est considérée comme la principale cause du développement de MDR dans un microenvironnement tumoral3. En plus de la MDR, d’autres complications du cancer, telles que la récidive et les métastases, renforcent la demande urgente de développer et d’améliorer des approches thérapeutiques pour surmonter ce défi oncologique.

L’utilisation curative de la lumière est pratiquée depuis des siècles4, et la thérapie photodynamique (PDT) représente une approche thérapeutique cliniquement approuvée pour les tumeurs solides. La PDT combine l’administration d’un photosensibilisateur (PS) suivie d’une irradiation lumineuse pour générer des espèces réactives de l’oxygène (ROS) afin d’exercer une cytotoxicité sélective dans les cellules tumorales. Cette approche thérapeutique est supérieure aux méthodes conventionnelles, y compris la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie5; Il s’agit d’une technique mini-invasive montrant une cytotoxicité plus faible dans les tissus conjonctifs6. L’application de lumière et l’accumulation de PS directement dans la tumeur ou son microenvironnement assurent un ciblage précis et, par conséquent, des effets secondaires systémiques mineurs et indésirables7 et la possibilité de traitements répétés sur le même site. De plus, le coût est inférieur à celui des autres approches. En raison de ses caractéristiques prometteuses, la PDT peut être considérée comme une option appropriée à la fois pour les tumeurs uniques, en particulier dans le cas de tumeurs inopérables, ou pour le traitement adjuvant du cancer7, et représente une alternative à la MDR liée à la chimiothérapie 8,9.

Le premier rapport montrant un taux de réponse objective élevé à l’aide de la PDT a été décrit en 1975 dans un modèle10 de souris et de rats. Depuis lors, des études ont été menées en utilisant la PDT avec des résultats positifs7 à la fois in vivo et in vitro avec des lignées cellulaires tumorales humaines en culture cellulaire2D 11,12. Compte tenu de la large applicabilité de la PS cliniquement approuvée, quelles que soient leurs voies d’accumulation spécifiques et leurs gammes de longueurs d’onde des pics d’absorption, le processus général est le suivant: (i) absorption du PS, (ii) pic de concentration de PS à la tumeur ou à son microenvironnement, (iii) application de lumière, (iv) interaction PS-lumière, (v) transfert de l’énergie PS excitée à l’état d’excitation PS au substrat tissulaire ou aux molécules d’oxygène environnantes, (vi) la production de ROS impliquant de l’oxygène singulet ou de l’anion superoxyde, (vii) la mort des cellules tumorales via, essentiellement, la nécrose ou l’apoptose (mort directe), l’autophagie (mécanisme cytoprotecteur), l’ischémie tissulaire (lésions vasculaires), la modulation immunitaire ou un chevauchement de ces mécanismes7. Dans cette dernière étape, l’activation d’une voie de mort cellulaire spécifique dépend de nombreux facteurs, tels que les caractéristiques cellulaires, la conception expérimentale et, surtout, la localisation intracellulaire PS et les dommages ciblés liés à la PDT13.

La vertéporfine est un PS de deuxième génération, approuvé par les organismes de réglementation pour une utilisation clinique en Norvège et en Chine pour traiter la dégénérescence maculaire liée à l’âge7. Après l’administration de la dose, il a été rapporté que cette prodrogue s’accumulait partiellement dans les mitochondries14 et induisait la phosphorylation de la protéine cellulaire tyrosine et la fragmentation de l’ADN, conduisant à l’apoptose des cellules tumorales15,16. Après 24 h d’incubation pour l’internalisation des vertéporfines, un protocole PDT utilisant une configuration de longueur d’onde de 690 nm est recommandé pour atteindre des niveaux efficaces de transfert de rayonnement électromagnétique aux molécules adjacentes 7,17.

En ce qui concerne la source lumineuse pour PDT, les systèmes laser à diodes classiques sont généralement coûteux, techniquement compliqués, surdimensionnés, et donc non portables18,19. En raison de son profil de longueur d’onde unique, qui peut également être observé dans les équipements PDT à base de LED, la demande d’unités indépendantes pour chaque application de photosensibilisateur rend l’utilisation de systèmes laser à diodes encore plus complexe et économiquement irréalisable20,21. Par conséquent, l’utilisation de machines LED est considérée comme l’alternative la plus prometteuse pour résoudre non seulement les coûts22 et les problèmes de maintenance, mais aussi pour fournir une puissance de sortie élevée et une capacité d’éclairage moins nocive 23 et plus large 24,25,26,27.

Malgré la contribution potentielle que l’équipement à base de LED peut offrir aux expériences PDT28, la plupart des options commerciales présentent encore des inconvénients tels qu’un manque de portabilité, des coûts élevés et des projets de construction et d’exploitationcomplexes 29. L’objectif principal de ce travail était d’offrir un outil simple et fiable pour les tests PDT in vitro . Cet article décrit PhotoACT, un appareil PDT à LED construit en interne, qui est peu coûteux, convivial et portable. En tant que preuve de concept, il a été démontré que ce dispositif améliore la cytotoxicité de la vertéporfine dans un modèle de culture cellulaire 2D et, par conséquent, peut être utilisé comme outil de recherche dans les expériences PDT.

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Protocole

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et logiciels utilisés dans ce protocole.

1. Construction de l’appareil

  1. Scie des panneaux de fibres de densité moyenne (MDF) de 3 mm d’épaisseur pour obtenir des pièces dont les dimensions sont indiquées à la figure 1A.
    Remarque : Utilisez le fichier vectoriel (fichier supplémentaire 1) pour la découpe par commande numérique par ordinateur (CNC).
  2. Construire deux boîtes avec les dimensions suivantes (longueur x largeur x hauteur) : 330 mm x 235 mm x 225 mm pour les plus grandes boîtes, et 300 mm x 220 mm x 150 m pour les plus petites boîtes (Figure 1B).
  3. Percez l’arrière de la plus grande boîte pour installer un connecteur de prise de barillet. Percez le haut de la plus grande boîte et le haut et le bas de la plus petite boîte pour permettre un passage aux câbles électriques (Figure 1C).
  4. Peignez toutes les surfaces internes avec de l’encre noire pour favoriser une incidence homogène de la lumière (Figure 1D).
  5. Fixez, en parallèle, trois rubans de DEL de 10 LED chacun sur la surface intérieure supérieure du boîtier plus petit (Figure 1E).
  6. Installez un capteur de luminosité au centre de la surface intérieure inférieure du boîtier plus petit (Figure 1F).
  7. Imprimez la structure de l’unité de commande (Figure 1G) à l’aide du fichier d’impression 3D (Fichier supplémentaire 2).
  8. Installez tous les composants (bouton d’alimentation, potentiomètres, pavé tactile d’heure/de démarrage, voyants, capteur de luminosité, écran LCD, avertisseur sonore et bloc d’alimentation) aux ports d’une carte de commande ESP32 montée à l’intérieur de l’unité de commande (Figure 2).
  9. Téléchargez le code de programmation (fichier supplémentaire 3, fichier supplémentaire 4 et fichier supplémentaire 5) et exécutez un test pour vérifier que toutes les connexions fonctionnent (Figure 1H).
  10. Assemblez les boîtes et fixez-les ensemble pour éviter les espaces et, par conséquent, les interférences lumineuses externes et les pertes de lumière émise. Fixez l’unité de commande montée à la zone percée au sommet du prototype (figure 1I).
  11. Fixez une porte d’entrée du même matériau et de 330 mm x 225 mm (longueur x largeur) sur la plus grande boîte avec deux petites charnières. Fixez également des bandes velcro latéralement à la plus grande boîte pour renforcer la fermeture prototype (Figure 1J). Installez une poignée pour manipuler la porte d’entrée de l’équipement.
  12. Fixez quatre repose-pieds en caoutchouc au bas du prototype pour assurer une plus grande stabilité pendant les opérations (figure 1K).

2. Lignées cellulaires : culture, semis et traitement

  1. Produits chimiques
    1. Dissoudre la porphyrine dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) pour obtenir une concentration de 100 mM.
      ATTENTION : Le DMSO doit être manipulé avec précaution (manipulation à l’aide d’un équipement de protection individuelle et dans un endroit ventilé). Manipuler soigneusement les solutions mères et diluées pour éviter une exposition excessive à la lumière.
  2. Lignées cellulaires
    1. Cultivez la lignée cellulaire HeLa dans le milieu hypoglycémique Modified Eagle’s Medium (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de gentamicine.
    2. Conserver les flacons de culture dans un incubateur de culture cellulaire à 5 % de CO2 à 37 °C.
    3. Gérer et inspecter les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent 80% à 90% de confluence.
  3. Processus d’ensemencement
    1. Retirer le milieu de culture de la fiole.
    2. Lavez la monocouche cellulaire avec du PBS.
    3. Détacher la culture cellulaire confluente avec la trypsine-EDTA (0,5%) 1x pendant 5 min à 37 °C. Arrêter l’action de la trypsine en remettant les cellules en suspension avec un milieu de culture supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de gentamicine.
    4. Compter les cellules remises en suspension à l’aide d’un hémocytomètre et les ensemencer dans une plaque de 96 puits à 2,0 × 104 cellules/puits.
    5. Préparez deux assiettes pour les conditions sombres et claires.
    6. Incuber les plaques pendant 24 h pour la fixation des cellules.
  4. Processus de traitement
    1. Retirez le milieu des deux plaques de 96 puits.
    2. Traiter les cellules avec 100 μL de concentrations croissantes de vertéporfine (0,045 à 24 μM, dilution en série).
    3. Incuber les cellules avec un traitement médicamenteux pendant 24 h pour permettre l’internalisation de la vertéporfine.
    4. Après 24 h, jeter le milieu contenant le médicament, laver la monocouche de cellules avec du PBS (100 μL) et ajouter un milieu sans médicament (100 μL).
    5. Couvrir une microplaque de papier d’aluminium pour la protéger de l’exposition à la lumière et incuber pendant 24 h. Cette plaque fournira des données de contrôle pour les résultats PDT (condition d’obscurité). L’autre microplaque sera utilisée dans les conditions d’exposition à la lumière dans l’appareil.

3. Fonctionnement de l’appareil

  1. Branchez l’appareil PDT sur la prise électrique et allumez-le en appuyant sur le bouton d’alimentation .
  2. Placez l’autre microplaque (état d’éclairage) dans le dispositif PDT et fermez l’équipement en fixant la porte d’entrée avec les bandes velcro.
  3. Utilisez les potentiomètres pour ajuster la configuration RVB (une expérience RVB 255 , 255, 255 ici) et définissez la couleur de l’émission de lumière.
    NOTE: Chaque combinaison RVB a un spectre d’émission spécifique, qui doit être ajusté pour des expériences avec différents photosensibilisateurs et, par conséquent, différentes courbes d’absorbance.
  4. Appuyez sur le pavé tactile (+)/(-) pour ajuster la configuration de l’heure (une expérience de 60 minutes ici) et définir la durée du test.
    NOTE: La configuration temporelle, associée à la valeur d’éclairement énergétique, déterminera la fluence du procédé - la dose lumineuse appliquée dans le test.
  5. Vérifiez les informations de configuration à l’écran.
  6. Appuyez sur le bouton Démarrer pour lancer le test. Assurez-vous qu’un signal sonore à un bip se fait entendre au début de l’essai.
  7. Au cours de l’expérience, observez les informations en temps réel sur l’écran, telles que l’irradiance et le temps restant.
  8. N’ouvrez pas la porte d’entrée et ne modifiez aucune configuration pendant le test PDT.
  9. À la fin du test, attendez qu’un buzzer à quatre bips et que le système électronique éteigne toutes les LED. Observez un message Terminé et la quantité finale d’énergie dépensée - fluence - pendant l’expérience dans l’affichage.
    REMARQUE : La valeur finale de fluence est calculée à l’aide de l’équation (1) :
    figure-protocol-1 (1)
    Où F est égal à J/cm 2 et I égal à mW/cm 2 ou mJ/s·cm 2. La valeur d’éclairement énergétique tient compte de la puissance des LED (source émettrice) et de la zone uniformément irradiée de la chambre noire (660cm2) (équation [2]):
    figure-protocol-2 (2)
    La valeur d’irradiance théorique est affichée sur l’écran de l’appareil tout au long du test PDT. À la fin de l’opération, utilisez l’équation (3) pour calculer la fluence :
    Fluence (F) = irradiance (I, valeur constante) × temps de fonctionnement (s) (3)

4. Essai de viabilité cellulaire

  1. Après le test PDT, couvrir la microplaque exposée à la lumière et incuber pendant 24 h.
  2. Après la période d’incubation, retirer le milieu de culture des deux plaques, laver la monocouche de cellules avec du PBS (100 μL) et ajouter une solution de MTT (0,5 mg/ml, 100 μL). Incuber les deux plaques - conditions sombres et claires - pendant 4 h pour permettre la formation de cristaux de formazan.
  3. Retirer soigneusement la solution de MTT et dissoudre les cristaux violets avec une solution de DMSO/éthanol (1:1).
  4. Après dissolution complète des cristaux, effectuer la mesure d’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques à 595 nm.
    REMARQUE: Le dispositif peut être utilisé dans d’autres expériences importantes telles que la mort cellulaire médiée par ROS déclenchée par des photosensibilisateurs après exposition à la lumière par cytométrieen flux 30.

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Résultats

Le dernier dispositif PDT, nommé PhotoACT, comprenait une chambre sombre pour attribuer jusqu’à quatre microplaques multipuits, avec sa surface intérieure supérieure équipée d’un ensemble de 30 LED dispersées programmées pour émettre des spectres distincts de lumière visible (Figure 3 et Fichier supplémentaire 6). Le dispositif a été construit à l’aide de deux boîtiers associés : un boîtier interne conçu comme une chambre sombre pour les tests PDT, et un boîtier externe pour...

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Discussion

Le dernier appareil PhotoACT était pratique à construire avec des composants disponibles dans le commerce et à faible coût à un coût total inférieur à 50 $. Les avantages supplémentaires incluent de faibles exigences d’entretien, la capacité d’irradier plusieurs types de plaques de culture, l’utilisation simultanée de jusqu’à quatre unités par essai, un faible poids (2 kg)/taille (44 cm3) qui permet la portabilité, une irradiation précise et reproductible (données non présentées) et une interface de configurat...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Nous remercions Arthur Henrique Gomes de Oliveira et Lucas Julian Cruz Gomes pour leur aide dans le processus de tournage. Ce projet a été soutenu par le Conseil brésilien de la recherche (CNPq, numéros de subvention 400953/2016-1-404286/2021-6) et Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Cette étude a également été financée en partie par Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 % Trypsine-EDTA (10x)TGibco15400054Réactif de dissociation de culture cellulaire de mammifères
Imprimante 3DModèle FlashforgeFinder Plaques
96 puitsPlaques de surface non stériles, en polystyrène et à haute liaison avec puits à fond plat utilisées pour la culture cellulaire 2D
Capteur
Modèle TSL2561 avec niveaux de détection de 0,1 à 40 000+ lux et interface I2C
Boutons
Buzzer
Flacons de culture cellulaire Flaconsà fond rectangulaire stérile en polystyrène avec surface traitée par culture tissulaire (TC), col incliné et capuchon d’aération (tailles)
Tubesà centrifugerTubes stériles en polypropylène d’une capacité de 15/50 ml utilisés pour la dilution de la culture cellulaire à l’étape d’ensemencement du test
CO2 Carte
ESP32
Le DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) est un milieu basal largement utilisé pour soutenir la croissance de nombreuses cellules de mammifères différentes.
DMSOSigma-AldrichD4540-500MLDiméthylsulfoxyde, &ge ; 99,5 % (GC), adapté à la culture de cellules végétales
Sérum de veau fœtal  ;Gibco12657029FBS offre la meilleure valeur en assurant la cohérence de la croissance cellulaire dans le temps et les passages.
Gentamicine (50 mg/mL)Gibco15750060Médicament antibiotique soluble dans l’eau purifié à l’origine du champignon Micromonospora purpurea. La gentamicine agit en empêchant la contamination de la culture cellulaire
Hémocytomètreà motif Neubauer Chambre utilisée pour le comptage cellulaire à l’étape d’ensemencement du test
Microscope de laboratoire inverséLeicaDM IL
HotteCabine conçue pour protéger l’environnement de travail des contaminants en maintenant un flux constant et unidirectionnel d’air filtré HEPA sur le travail aire. Utilisé à plusieurs étapes des procédures de culture et de traitement des cellules
écran
LED RGB WS28125050 RGB Modèle SMD avec processeur intégré. Ruban avec 30 LED, 1 mètre de long et 9 watts
de fibres MDFde 3 mm d’épaisseur Panneaux de fibres à densité moyenne
microcentrifugationTubes stériles en polypropylène avec couvercle de sécurité et capacité de 1,5/2,0 ml. Outils pratiques pour manipuler de petits volumes à l’étape de traitement du test Lecteur de
microplaquesThermoFischerMultiskan FC Photomètre sur microplaques conçu pour détecter une large gamme de longueurs d’onde d’absorbance (340-850 nm). L’équipement a été utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire après l’incubation de MTT.
Réactif MTTInvitrogenM64943-(4,5-Diméthylthiazol-2-yl)-2,5-bromure de diphényltétrazolium. Utilisé pour les tests de viabilité cellulaire
Système opérationnelReal Time Engineers ltd.FreeRTOS
P10 micripipetteNon électronique, monocanal, 1-10 &mu ; L capacité
P1000 micropipetteNon électronique, monocanal, 10-1000 &mu ; L capacité
P200 micropipetteNon électronique, monocanal, 20-200 &mu ; Capacité L
PDT ÉquipementLumaCareModèle LC-122
Saline tamponnée au phosphate pH 7,4Gibco10010031Formulation de sel équilibrée utilisée pour le lavage des cellules pendant les procédures de culture et de dosage
Potentiomètres
EmboutsNon stérile, ajustement universel, 10/200/1000 &mu ; L volumes maximaux
VerteporfineSigma-AldrichSML0534-5MGVerteporfin, &ge ; 94 % (HPLC)
à de luminosité Arduino contrôleur d’incubateur Logiciel de conception Trimble SketchUp DMEM High Glucose Gibco 11965092 LED à flux laminaire , LCDPanneaux Tubes de

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Dispositif LEDculture cellulaire 2Dessai de photosensibilisateurlign e cellulaire HeLaesp ces r actives de l oxyg neessai MTTcytom trie en fluxexposition la lumi re

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