Microcosmes de compost en tant qu’environnements naturels diversifiés sur le plan microbien pour la recherche sur le microbiome chez Caenorhabditis elegans

Le nématode Caenorhabditis elegans apparaît comme un modèle utile pour étudier les interactions entre les hôtes et leur microbiome intestinal ^1,2. En tant que modèle, il offre plusieurs avantages. Premièrement, les animaux exempts de germes ou gnotobiotiques sont faciles à obtenir et à entretenir; L’eau de Javel peut être utilisée pour tuer les vers gravides et les microbes associés, laissant leurs œufs résistants à l’eau de Javel sains et saufs pour se développer en tant que populations synchronisées selon l’âge qui peuvent être colonisées par des bactéries d’intérêt ^3,4. De plus, lorsqu’il est cultivé en présence de bactéries, C. elegans, un bactériivore, ingère les bactéries rencontrées, les espèces sensibles étant digérées ou excrétées, tandis que les espèces résistantes et persistantes colonisent de manière stable l’intestin du ver. De plus, C. elegans est principalement hermaphrodite, produisant des populations de descendance génétiquement identique, ce qui réduit la variation génétique confondante. Couplé à la disponibilité de souches mutantes et transgéniques, la collaboration avec C. elegans offre aux chercheurs un modèle gnotobiotique et génétiquement traitable pour étudier les fondements moléculaires des interactions hôte-microbe 5,6,7,8.

Bien que les expériences avec des bactéries bien caractérisées puissent faciliter l’analyse des mécanismes moléculaires, l’identification et l’étude des bactéries avec lesquelles les vers interagissent dans la nature sont essentielles pour explorer la diversité de ces mécanismes, démêler le contexte naturel de leur fonction et comprendre les forces sélectives qui ont façonné leur évolution. À l’extérieur du laboratoire, C. elegans est présent à l’échelle mondiale dans les climats tempérés humides, où l’on pense que les populations subissent un cycle de vie « d’expansion et de récession », caractérisé par une croissance démographique rapide lorsque les ressources sont abondantes, suivie d’un changement de développement vers des dauers pionniers et tolérants au stress lorsque les ressources sont épuisées⁹. Bien qu’elles soient considérées comme un nématode du sol, les populations sauvages de C. elegans qui prolifèrent le plus souvent se nourrissent de matières organiques en décomposition telles que des fleurs ou des fruits en décomposition, où les populations bactériennes sont abondantes et diversifiées.

Des études sur le microbiome intestinal chez des nématodes isolés dans la nature ont identifié diverses communautés bactériennes, mais caractéristiques 10,11, dont la composition a été confirmée par des études menées avec des vers élevés dans des environnements microcosmiques naturels ^12,13. Ensemble, ces études ont permis de délimiter un microbiome intestinal de ver central². Alors que l’échantillonnage des populations de C. elegans dans la nature représente l’examen le plus direct des interactions naturelles ver-microbe, il n’est pas réalisable partout et à tout moment, car il est limité aux régions et aux saisons avec des précipitations abondantes^10,11. Alternativement, au lieu d’isoler les vers de leur habitat naturel, des expériences utilisant des microcosmes amènent l’habitat naturel dans le laboratoire 6,8,12,13,14,15. Les environnements microcosmiques sont préparés à partir de sol composté avec divers fruits ou légumes, ce qui permet une plus grande diversification de la communauté du sol de départ. Ils offrent des méthodes expérimentales traitables qui combinent la diversité microbienne et l’environnement tridimensionnel du sol sauvage avec les avantages expérimentaux d’une installation de laboratoire contrôlée et de souches de vers génétiquement définies. Le protocole ci-dessous détaille les étapes impliquées dans le travail avec des microcosmes de compost, démontrant leur utilisation dans la compréhension de l’assemblage d’un microbiome intestinal caractéristique du ver dans divers environnements.

1. Préparation du compost

1. Procurez-vous du compost ou de la terre de jardin de n’importe quelle source pratique et conservez-les à l’intérieur du laboratoire dans un récipient en plastique de cuisine standard percé de trous dans le couvercle pour laisser entrer l’air. Boucher les trous avec du coton pour empêcher les mouches des fruits et autres invertébrés d’entrer (Figure 1A).
   NOTE: Cinq cents grammes de terre (rentrant dans un récipient de 1,5 gallon, dimensions: 30 cm x 20 cm x 10 cm) fourniront suffisamment de matière pour 12 microcosmes.
2. Enrichissez le compost ou le sol avec des produits hachés ou un mélange de différents produits dans un rapport masse de 1:2 de produits par rapport au sol.
3. Incuber pendant 7 à 14 jours à 20-25 °C, en mélangeant une fois par jour et en ajoutant le milieu M9 nécessaire pour maintenir l’humidité sans la rendre boueuse.
   NOTE: Les sols non enrichis avec des produits ne supportent généralement pas la croissance de C. elegans , mais le produit spécifique à utiliser dépend du chercheur, avec de nombreux types et mélanges capables de soutenir la croissance des vers. L’enrichissement avec différents produits favorisera la diversification des communautés bactériennes de différentes manières, permettant l’étude de l’assemblage du microbiome intestinal à partir de différents points de départ (voir la section discussion).

2. Préparation des microcosmes de compost

1. Pour chaque microcosme, ajouter 10 g de compost enrichi à un bécher en verre de 30 ml recouvert d’une feuille d’étain et d’un autoclave (figure 1B).
2. Pour préparer l’extrait microbien afin de reconstituer le compost autoclavé, commencez par ajouter 30 g du même compost utilisé à l’étape 2.1 à chacun des trois tubes de 50 ml et remplissez de M9. Vortex pendant 1 min (Figure 1C).
   REMARQUE: Cela devrait fournir suffisamment de bactéries pour neuf microcosmes, chacun soutenant le développement de centaines de nématodes.
3. Centrifuger les tubes à 560 × g pendant 5 min à température ambiante (RT).
4. En faisant attention à ne pas déranger la pastille, retirez les surnageants à l’aide d’une pipette sérologique et combinez-les dans un nouveau tube de 50 mL.
5. Concentrer l’extrait bactérien par centrifugation à vitesse maximale (2 000 × g) pendant 15 min à TA. Resuspendre les pastilles dans suffisamment de M9 pour avoir 200 μL pour chaque microcosme et 200 μL de plus à ajouter à une plaque qui servira de proxy visible du développement des vers à l’intérieur des microcosmes.
   REMARQUE : Par exemple, pour neuf microcosmes, remettre en suspension la pastille microbienne dans 2 mL de M9.
6. Ajouter 200 μL de l’extrait microbien concentré à chaque bécher de compost autoclavé, ainsi qu’à une plaque NGM qui servira de plaque proxy visible.
7. Incuber les microcosmes et la plaque proxy pendant 24 h à 20-25 °C avant l’ajout des vers.

3. Élever des vers dans les microcosmes de compost

1. Ajouter 500-1000 œufs ou larves L1³ à chaque microcosme et à la plaque proxy (étape 2.7) pour commencer l’expérience (Figure 1D).
   REMARQUE: Les expériences décrites ici utilisent des vers de type sauvage N2. Cependant, d’autres souches de C. elegans (et potentiellement d’autres nématodes) peuvent être utilisées.
2. Élever les vers jusqu’à l’âge adulte à 20 °C (généralement 3 jours).

Figure 1 : Préparation des microcosmes de compost, élevage des vers et récolte. (A) Enrichir le sol local ou le compost avec des produits et incuber pendant 2 semaines. Combiner (B) un sol enrichi autoclavé avec (C) un extrait microbien et (D) incuber pendant au moins 24 heures avant d’ajouter des vers L1 synchronisés aux microcosmes pour commencer l’expérience. (E, F) Lorsque vous êtes prêt à récolter, ajoutez le compost du microcosme dans un cylindre de support d’entonnoir Baermann et recouvrez de M9. (G) Après 15 min, libérer le filtrat dans un tube de 50 mL. Abréviation : sup. = surnageant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Préparation d’un entonnoir Baermann pour la récolte des vers

1. Assemblez un entonnoir Baermann en fixant 5 à 8 cm de tube en caoutchouc rigide à l’extrémité d’un entonnoir en plastique.
2. Faites glisser une pince sur le tube et fermez-le.
3. Placer dans l’entonnoir un tuyau cylindrique en PVC de 7 cm de long et 5 cm de diamètre avec un treillis de nylon de 1 mm collé au fond (figure 1E). Tapisser le cylindre de deux feuilles de papier de soie.
4. Placer l’entonnoir Baermann dans une fiole (figure 1F).

5. Récolte des vers dans les microcosmes et collecte des échantillons de sol respectifs

1. Ajouter 20 ml de M9 au microcosme dans lequel les vers ont été élevés, agiter le mélange, puis verser le mélange du bécher dans le cylindre doublé de papier de soie dans la configuration de l’entonnoir Baermann. Ajoutez plus de M9 pour immerger complètement le compost dans l’entonnoir.
   REMARQUE : Les populations de C. elegans (N2) atteignent l’âge adulte dans les microcosmes de compost à un rythme similaire à celui des plaques de gélose standard ensemencées avec Escherichia coli. Pour plus de précision dans la récolte des vers à un stade de développement spécifique, reportez-vous à la plaque proxy de l’étape 3.3.
2. Après 30 minutes, détacher la pince pour libérer le filtrat contenant les vers récoltés dans un tube de 50 ml (figure 1G).
3. Ajouter plus de M9 au cylindre et répéter pour un deuxième tour pour récolter plus de vers, et une fois de plus si des vers supplémentaires sont nécessaires.
   REMARQUE : Lorsque vous répétez les rondes de récolte, veillez à ne pas compromettre l’intégrité du papier de soie, ce qui pourrait laisser passer les particules de sol. Un maximum de quatre cycles de récolte devrait isoler au moins 50 % des vers ajoutés à l’origine au microcosme sans compromettre l’intégrité du papier de soie.
4. Concentrer les vers par centrifugation à 560 × g pendant 2 min (RT). Retirer 35 mL du surnageant à l’aide d’une pipette sérologique.
5. Transférer les 15 mL restants dans un tube de 15 mL et centrifuger à nouveau à 560 × g pendant 1 min pour concentrer davantage les vers. Retirer 14 mL du surnageant à l’aide d’une pipette sérologique.
6. En parallèle, recueillir 1 g du sol du microcosme restant dans un tube de 1,5 mL. Traiter immédiatement les échantillons de sol contenant la communauté bactérienne environnementale ou les entreposer à −20 °C pour une extraction ultérieure des acides nucléiques, comme décrit ci-dessous pour les échantillons de vers.

6. Lavage et stérilisation de surface des vers récoltés

1. Transvaser 1 mL des vers récoltés concentrés de l’étape 5,5 dans un tube de 1,5 mL à l’aide d’une pipette en verre. Incuber pendant 2 min pour permettre aux vers de s’installer au fond du tube. Retirez le surnageant, en laissant les 100 μL inférieurs intacts.
2. Lavez 6x avec 1,5 mL de M9+T (0,025% de Triton-X dans M9), permettant aux vers de se déposer au fond à chaque fois.
3. Transférer les vers lavés dans un volume de 100 μL dans un nouveau tube de 1,5 mL à l’aide d’une pipette en verre.
   REMARQUE : À ce stade du protocole, environ 30 minutes devraient s’être écoulées depuis le premier lavage (étape 6.2). Il est recommandé de laisser les vers sans nourriture pendant au moins 1 h avant l’ajout de lévamisole pour permettre l’excrétion des bactéries transitoires et la digestion complète des bactéries alimentaires.
4. Ajouter 100 μL de chlorhydrate de lévamisole 25 mM pour paralyser les vers. Incuber pendant 5 min à TA.
5. Ajouter 200 μL de solution d’eau de Javel à 4 %. Incuber pendant 2 min.
6. Retirez le surnageant, en laissant intact les 150 μL les plus bas, et lavez 3x avec M9+T, comme ci-dessus.
   REMARQUE: Pour minimiser la contamination des échantillons, il est recommandé d’utiliser du M9+T filtré (à travers un filtre de 0,2 μm) et de porter des gants à partir de ce moment.
7. Après les lavages, prélever 50 μL des 150 μL restants du dernier lavage et déposer sur une plaque LB, en incubant à 25 °C pendant 48 h pour confirmer l’élimination efficace des bactéries externes.
   REMARQUE : L’observation de jusqu’à 30 colonies au cours du dernier lavage (représentant 60 cellules bactériennes externes restantes dans l’échantillon) est permise et ne devrait avoir qu’une contribution marginale à la composition du microbiome analysé, étant donné les milliers de bactéries qui colonisent généralement chaque ver adulte¹⁵. Lorsque davantage de données sont observées, l’intégrité de l’échantillon peut être compromise.
8. Utiliser les vers stérilisés en surface immédiatement (p. ex. pour extraire des bactéries vivantes pour la culture [numération des UFC]) ou les conserver à −20 °C pour l’extraction ultérieure des acides nucléiques.

7. Extraction d’ADN

REMARQUE : Les étapes suivantes décrivent l’extraction de l’ADN des vers récoltés à l’aide d’une trousse commerciale conçue pour l’extraction de l’ADN microbien du sol (voir le tableau des matériaux), avec les modifications décrites ci-dessous pour faciliter l’extraction de l’ADN microbien des vers.

1. Transférer l’échantillon contenant des vers stérilisés en surface (décongeler à TA si nécessaire) dans les tubes fournis par la trousse, en remplaçant les billes de verre fournies par des billes de zircone d’environ 30 à 50 1 mm de diamètre (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: Les rendements en ADN observés sont plus élevés avec les billes de zircone qu’avec les perles de verre fournies par le kit. Bien que la raison de cette observation reste indéterminée, les billes de zircone peuvent briser la cuticule du nématode plus efficacement, libérant plus de bactéries.
2. Pour les échantillons de compost, ajoutez environ 250 mg de terre recueillie aux tubes de la trousse sans remplacer les billes de verre.
3. Après l’ajout de la solution tampon fournie par le kit à tous les échantillons, homogénéiser avec un homogénéisateur de puissance à TA (voir tableau des matériaux) pendant deux tours de 2 000 tr/min pendant 30 s chacun, en s’arrêtant pendant 30 s entre les deux.
4. Complétez les étapes restantes de purification de l’ADN selon le protocole du kit. Éluer les échantillons de vers dans un tampon d’élution ne dépassant pas 50 μL pour s’assurer que les concentrations d’ADN sont suffisamment élevées pour le séquençage.

Pour explorer la capacité de diversifier la communauté des microcosmes du sol, nous avons comparé les communautés microbiennes dans les microcosmes de compost préparés en enrichissant le même sol initial, un compost de qualité industrielle disponible dans la ville de Berkeley, en Californie, avec différents produits: pommes, poivrons, oranges ou pommes de terre (chacun en trois exemplaires). Nous avons ensuite comparé les communautés microbiennes de chaque environnement de compost avec le microbiome intestinal de C. elegans de type sauvage élevé dans le microcosme respectif. L’analyse a été effectuée avec des échantillons d’ADN extraits d’environ 500 adultes stérilisés en surface par microcosme et d’échantillons de compost de 250 mg des microcosmes respectifs.

La caractérisation des microbiomes environnementaux du sol et de l’intestin des vers reposait sur le séquençage de nouvelle génération de la région V4 du gène bactérien de l’ARNr 16S. La préparation de la bibliothèque de séquençage a été réalisée à l’aide des kits standard et effectuée conformément aux instructions des fabricants, le séquençage étant effectué sur un séquenceur commercial (voir le tableau des matériaux). Les séquences démultiplexées ont été traitées à l’aide de DADA2, taxonomie assignée basée sur la base de données de référence SILVA v132, et analysées avec phyloseq16,17,18 (voir le fichier supplémentaire 1, la figure supplémentaire S1, la figure supplémentaire S2, la figure supplémentaire S3, le tableau supplémentaire S1 et le tableau supplémentaire S2 pour une description détaillée du séquençage et de l’analyse; le pipeline de calcul complet est disponible dans GitHub [https://github.com/kennytrang/CompostMicrocosms]). Les données brutes sont disponibles dans les archives de lecture de séquences du NCBI (Bioproject ID PRJNA856419).

En moyenne, 73 220 séquences ont été obtenues par échantillon. Ces séquences représentent 15 027 variantes de séquence d’amplicon (ASV), couvrant 27 phylums et 216 familles, y compris des familles considérées comme faisant partie du microbiome intestinal13 de C. elegans, telles que Rhizobiaceae, Burkholderiaceae et Bacillaceae. Les entérobactéries et les Pseudomonadaceae, qui étaient auparavant considérées comme des membres dominants, étaient minoritaires cette fois-ci, mais étaient encore enrichies (2 à 10 fois) par rapport à leurs environnements pédologiques respectifs. Les comparaisons basées sur des distances UniFrac19,20 non pondérées et pondérées ont démontré une bonne reproductibilité entre les triplicates de microcosme enrichis avec le même produit, comme l’indique le regroupement rapproché. En revanche, les microbiomes environnementaux du sol enrichis avec différents produits se sont regroupés les uns des autres, démontrant la capacité de diversifier une communauté microbienne initiale par l’ajout de différents produits (Figure 2).

Dans les comparaisons des microbiomes intestinaux des vers et des communautés environnementales, l’analyse des coordonnées principales (PCoA) avec des distances UniFrac non pondérées ou pondérées a montré un regroupement distinct des microbiomes intestinaux des vers par rapport à celui de leurs environnements respectifs pour chaque type de microcosme (Figure 2). Alors que le PCoA basé sur les distances UniFrac non pondérées ne faisait pas de distinction entre les microbiomes du sol et ceux des vers (Figure 2A), le regroupement basé sur les distances pondérées a révélé une séparation claire des microbiomes intestinaux et compost (Figure 2B). Ces résultats soutiennent un processus dans lequel le filtrage de l’hôte fonctionne sur la disponibilité environnementale pour façonner un microbiome intestinal qui n’est pas complètement distinct de sa source environnementale en ce qui concerne la présence de taxons, mais module leur abondance en enrichissant pour un sous-ensemble des taxons disponibles, résultant finalement en un microbiome intestinal de ver de base partagé entre les vers élevés dans différents environnements.

Figure 2 : Les microbiomes intestinaux des vers se regroupent loin de leurs environnements microbiens respectifs diversifiés par les produits. La composition du microbiome a été déterminée par séquençage 16S, et les communautés de microcosmes enrichis avec les produits désignés ou de vers élevés dans ceux-ci ont été regroupées à l’aide de PCoA en fonction (A) des distances UniFrac non pondérées ou (B) pondérées. Les axes indiqués sont ceux qui expliquent la plus grande variation de la composition de la communauté entre les échantillons (N = 3 pour chaque type de microcosme). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Séquençage et analyse des données de nouvelle génération. Les étapes de préparation de la bibliothèque, de séquençage en laboratoire et d’analyse des données sont présentées ici. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S1 : Exemple de graphique de contrôle de la qualité pour les lectures inverses d’un échantillon. L’axe X (cycle) montre la position des nucléotides le long de la séquence lue. L’axe Y de gauche montre le score de qualité. La carte thermique en niveaux de gris représente la fréquence du score de qualité à chaque position nucléotidique; La ligne verte représente le score de qualité médian à chaque position nucléotidique; la ligne orange supérieure représente les quartiles de la distribution des scores de qualité; la ligne rouge du bas représente le pourcentage de lectures de séquence qui a étendu cette position nucléotidique (axe Y droit, ici 100%). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2: Taux d’erreur pour différents échantillons. La fréquence des erreurs dans les différents échantillons (points noirs) devrait diminuer avec l’augmentation du score de qualité pour chaque substitution possible de paires de bases représentée, reflétant la tendance attendue. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S3 : Exemple de PCoA basé sur des distances UniFrac pondérées. Les noms de groupes indiqués dans la légende représentent les produits utilisés pour enrichir le compost utilisé dans les différents microcosmes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S1 : Filtrage séquentiel des séquences. un Nombre de lectures de séquences avant le filtrage. b-d Chaque colonne représente le nombre de lectures de séquence restantes après une étape de filtration : filtrage des lectures de faible qualité (étape 2.5), algorithme de débruitage effectué par dada() (étape 2.8), fusion des lectures avant et arrière (étape 2.9) et suppression des chimères (étape 2.11). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S2 : Tableau des métadonnées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer qui soit pertinent pour le contenu de cet article.