Méthode pour étudier la toxicité et l’agrégation de la α-synucléine à l’aide d’un modèle de levure humanisée

Summary

Un modèle physiologique in vivo de la α-synucléine est nécessaire pour étudier et comprendre la pathogenèse de la maladie de Parkinson. Nous décrivons une méthode pour surveiller la cytotoxicité et la formation agrégée de α-synucléine à l’aide d’un modèle de levure humanisé.

Abstract

La maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente et se caractérise par une mort cellulaire progressive causée par la formation de corps de Lewy contenant de la α-synucléine mal repliée et agrégée. α-synucléine est une protéine présynaptique abondante qui régule le trafic des vésicules synaptiques, mais l’accumulation de ses inclusions protéiques entraîne une neurotoxicité. Des études récentes ont révélé que divers facteurs génétiques, y compris les chaperons bactériens, pourraient réduire la formation d’agrégats de α-synucléine in vitro. Cependant, il est également important de surveiller l’effet anti-agrégation dans la cellule pour l’appliquer comme traitement potentiel pour les patients. Il serait idéal d’utiliser des cellules neuronales, mais ces cellules sont difficiles à manipuler et prennent beaucoup de temps à présenter le phénotype anti-agrégation. Par conséquent, un outil in vivo rapide et efficace est nécessaire pour une évaluation plus approfondie de l’activité anti-agrégation in vivo. La méthode décrite ici a été utilisée pour surveiller et analyser le phénotype anti-agrégation de la levure humanisée Saccharomyces cerevisiae, qui exprimait la α-synucléine humaine. Ce protocole démontre des outils in vivo qui pourraient être utilisés pour surveiller la toxicité cellulaire induite par la α-synucléine, ainsi que la formation d’agrégats de α-synucléine dans les cellules.

Introduction

La maladie de Parkinson (MP) est un problème grave pour les sociétés vieillissantes du monde entier. L’agrégation de la α-synucléine est étroitement associée à la MP, et les agrégats protéiques de α-synucléine sont largement utilisés comme biomarqueur moléculaire pour diagnostiquer la maladie¹. α-synucléine est une petite protéine acide (140 acides aminés de longueur) avec trois domaines, à savoir la α-hélice de liaison lipidique N-terminale, le domaine central de liaison amyloïde (NAC) et la queue acide C-terminale². Le mauvais repliement de la α-synucléine peut se produire spontanément et conduit ....

Protocol

1. Préparation des supports et des solutions

1. Préparation des médias
   1. Pour préparer le milieu YPD, dissoudre 50 g de poudre YPD dans_dH2Opour obtenir un volume final de 1 L. Autoclave pour stérilisation. Conserver à température ambiante (RT).
   2. Pour fabriquer un milieu gélosé YPD, dissoudre 50 g de poudre YPD et 20 g de gélose dans 1 L de_dH2O. Autoclave pour stérilisation. Après refroidissement, verser sur des boîtes de Petri. Conserver à 4 °C.
   3. Pour faire SC avec un milieu raffinose (SRd)-Ura, dissoudre 6,7 g de levure azotée base avec du sulfate d’ammonium et sans acides aminés dans 795 mL de

Results

La forte expression de la α-synucléine est connue pour être liée à la mort cellulaire neuronale et à la MP dans les systèmes modèles de MP. Cette étude décrit trois méthodes pour surveiller la cytotoxicité de la α-synucléine et la formation de foyers de α-synucléine agrégée dans la levure. Ici, la α-synucléine a été surexprimée dans la levure, et les phénotypes de la α-synucléine de type sauvage et de trois variantes de la α-synucléine connues sous le nom de mutants familiaux de la MP ont été examinés (

Discussion

Compte tenu de la complexité des différents systèmes cellulaires chez l’homme, il est avantageux d’utiliser la levure comme modèle pour étudier les maladies neurodégénératives humaines. Bien qu’il soit presque impossible d’étudier les interactions cellulaires complexes du cerveau humain à l’aide de levure, d’un point de vue unicellulaire, les cellules de levure présentent un niveau élevé de similitude avec les cellules humaines en termes d’homologie de séquence génomique et de processus cellulaires eucaryotes fondamentau.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaque à 96 puits	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	diversified biotech	BEM-1	Membrane d’étanchéité perméable aux gaz pour verres de protection des plaques de microtitration
	Marienfeld		24 x 60 mm
Tube de culture	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Galactose	sigma	G0625
D-(+)-Glucose	sigma	G8270
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Daejung	6638-4105
Incubateur (agitation)	Labtron		: SHI1
Incubateur (statique)	Vision scientifique		modèle : VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Lecteur de microplaques	Tecan	30050303 01	Modèle : Infinite 200 pro
pipette multicanaux 20-200 µ ; L	gilson	FA10011
pipette multicanaux 2-20 & micro ; L	gilson	FA10009
Microscope	Olympus	Olympus IX-53
PEG	sigma	P4338	mol moyen pt 3 350
Pétride	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Vecteurs navettes multifonctionnels à nombre élevé de copies. Gène. 110 (1), 119 à 122 (1992).
pRS426 GAL1 promoteur &alpha ;-synucléine A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Les cellules de levure donnent un aperçu de la biologie et de la pathobiologie de l’alpha-synucléine. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoteur &alpha ;-synucléine A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Les cellules de levure donnent un aperçu de la biologie et de la pathobiologie de l’alpha-synucléine. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoteur &alpha ;-synucléine E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Les cellules de levure donnent un aperçu de la biologie et de la pathobiologie de l’alpha-synucléine. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoteur &alpha ;-synucléine WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Les cellules de levure donnent un aperçu de la biologie et de la pathobiologie de l’alpha-synucléine. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Réservoir	SPL	23050
Spectrophotomètre	eppendorf	6131 05560
W303a			Présent de James Bardwell
Base d’azote de levure sans acides aminés	Difco	291940
Suppléments de milieu de chute synthétique de levure sans uracile	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00