Isolement de petits follicules préantraux de l’ovaire bovin à l’aide d’une combinaison de fragmentation, d’homogénéisation et de filtration en série

Résumé

Faire progresser l’étude de la folliculogenèse préantrale nécessite des méthodes efficaces d’isolement des follicules à partir d’ovaires simples. Un protocole mécanique simplifié pour l’isolement des follicules des ovaires bovins à l’aide d’un hachoir et d’un homogénéisateur de tissus est présenté ici. Cette méthode permet de prélever un grand nombre de follicules préantraux viables à partir d’un seul ovaire.

Résumé

Comprendre le processus complet de la folliculogenèse des mammifères est crucial pour améliorer les technologies de procréation assistée chez le bétail, les humains et les espèces en voie de disparition. La recherche s’est principalement limitée aux follicules antraux et aux grands follicules préantraux en raison de la difficulté d’isoler les follicules préantraux plus petits, en particulier chez les grands mammifères tels que les espèces bovines. Ce travail présente une approche efficace pour récupérer un grand nombre de petits follicules préantraux d’un seul ovaire bovin. Le cortex des ovaires bovins individuels a été tranché en cubes de 500 μm à l’aide d’un hachoir à tissus et homogénéisé pendant 6 minutes à 9 000-11 000 tr/min à l’aide d’une sonde de 10 mm. Les gros débris ont été séparés de l’homogénat à l’aide d’un tissu à fromage, suivi d’une filtration en série à travers des crépines cellulaires de 300 μm et 40 μm. Le contenu retenu dans la passoire de 40 μm a été rincé dans un plat de recherche, où les follicules ont été identifiés et recueillis dans une goutte de milieu. La viabilité des follicules collectés a été testée par coloration bleue de trypan. Cette méthode permet d’isoler un grand nombre de petits follicules préantraux viables d’un seul ovaire bovin en 90 minutes environ. Fait important, cette méthode est entièrement mécanique et évite l’utilisation d’enzymes pour dissocier le tissu, ce qui peut endommager les follicules. Les follicules obtenus à l’aide de ce protocole peuvent être utilisés pour des applications en aval telles que l’isolement de l’ARN pour la RT-qPCR, l’immunolocalisation de protéines spécifiques et la culture in vitro .

Introduction

Les follicules ovariens sont les unités fonctionnelles de l’ovaire, responsables de la production du gamète (ovocyte) ainsi que des hormones essentielles à la fonction de reproduction et à la santé globale. Les follicules primordiaux se forment dans l’ovaire au cours du développement fœtal ou dans la période néonatale selon les espèces¹, et ils constituent la réserve ovarienne d’une femelle. La croissance folliculaire commence par l’activation des follicules primordiaux qui quittent la piscine de repos et entrent dans la phase de croissance. La folliculogenèse préantrale, englobant tous les stades folliculaires avant le développement de l’antre....

Protocole

Les ovaires bovins (Bos taurus) ont été prélevés dans un abattoir local et transportés au laboratoire dans les 6 heures suivant la collecte. En raison du grand nombre d’animaux traités dans l’installation, l’âge, la race et le stade du cycle de l’oestrus des animaux sont inconnus. Étant donné qu’aucun animal vivant n’a été utilisé dans ces expériences, un protocole approuvé de soin et d’utilisation des animaux n’était pas requis.

1. Préparation de l’équipement et des réactifs

1. Couvrez une section de 2 pieds de large d’une paillasse de laboratoire avec du papier de laboratoire.
2. Obtenir un manche d....

Résultats

Vue d’ensemble et étapes critiques
Grâce à ce protocole, les petits follicules préantraux bovins peuvent être isolés de manière fiable à partir d’ovaires simples en nombre pertinent expérimentalement. Sur un total de 30 répétitions, une moyenne de 41 follicules a été obtenue par répétition, avec une plage de 11 à 135 follicules (Figure 4A). Dans 14 réplications, les follicules ont été caractérisés pour le stade de développement décrit précédemment²⁶

Discussion

Le présent protocole détaille une méthode reproductible pour récupérer les follicules préantraux à un stade précoce, en particulier aux stades primaire et secondaire précoce, de l’ovaire bovin. Ce protocole s’appuie sur les rapports précédents 20,25,30,34,35,36 et fournit des optimisations qui permettent d’isoler un nombre significatif de follicules d’un ovaire individuel.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette	Duran Wheaton Kimble	63A54	Pipette Pasteur qui peut être utilisée pour déloger les follicules des débris lors de la recherche dans la boîte de Pétri 16
Paraformaldéhyde	Microscopie électronique Sciences	15710	Dilué à 4 %; fixation des follicules pour l’immunocoloration
20 mL Seringue Luer-lock	Fisher Scientific	Z116882-100EA	Seringue utilisée avec l’aiguille 18 G pour déloger les follicules de la 40 &mu ; Filtre à cellules m
#21 Lame de scalpel stérile	Fisher Scientific	50-365-023	Utilisé pour couper les ovaires et enlever la médule
40 &mu ; m Passoire à cellules	Fisher Scientific  ;	22-363-547	Utilisé pour filtrer le filtrat du 300 &mu ; Filtre à cellules m
104 mm Entonnoir en plastique	Fisher Scientific	10-348C	La taille peut varier, mais assurez-vous que l’étamine est coupée de manière appropriée et que l’homogénat ovarien ne débordera pas sur
300 &mu ; m Crépine de cellules	pluriSelect  ;	43-50300-03	Utilisé pour filtrer le filtrat de l’étamine  ;
Fiole Erlenmeyer de 500 mL	Fisher Scientific	FB500500	Entonnoir et fiole utilisés pour récupérer le filtrat de l’étamine.
Aiguilles stériles Air-Tite 18 g	Thermo Fisher Scientific	14-817-151	18 g offre une pression suffisante pour déloger les follicules du 40 &mu ; Filtre à cellules m
Air-Tite Aiguilles stériles 27 G 13 mm	Fisher Scientific	14-817-171	Aiguilles pouvant être utilisées pour manipuler tout débris dans lequel les follicules sont coincés
BD Hoechst 33342 Solution Fisher	Scientific	BDB561908	Coloration fluorescente de l’ADN
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030-100G  ;	Composant du milieu de lavage des follicules
Cheese Cloth	Electron Microscopy Sciences	71748-00	Première étape de filtrage de l’homogénat ovarien destinée à éliminer les gros débris tissulaires Lames
rasoir de sécurité classiques à double tranchant	Wilkinson Sword	N/A	Lames de rasoir qui s’adaptent le mieux au hachoir à tissus McIlwain et ne s’émoussent pas rapidement
Anticorps secondaire Donkey-Anti-Rabbit, Alexa Fluor 488	Fisher Scientific	A-21206	Anticorps secondaire pour l’immunocoloration
Eisco Latex Pipette Bulbes Fisher		Scientific S29388	Poire en caoutchouc à utiliser avec les pipettes Pasteur
HEPES Buffer	Sigma-Aldrich	H3375	Composant du milieu de lavage des follicules
Homogénéisateur	VWR	10032-336	Homogénéiser le tissu ovarien pour libérer les follicules  ;
ImageJ/Fiji	NIH	v2.3.1	Logiciel utilisé pour l’analyse de l’immunolocalisation par fluorescence
McIlwain	Tissue Chopper Ted Pella	10184	Utilisé pour couper le tissu ovarien suffisamment petit pour l’homogénéisation
Microscope - Stéréoscope	Olympus	SZX2-ILLT	Microscope de dissection utilisé pour la recherche et le prélèvement des follicules du filtrat
Microscope - Inversé	Nikon	Diaphot 300	Microscope inversé utilisé pour la visualisation en fond clair à fort grossissement de follicules isolés
Microscope - Inversé	ECHO	Revolve R4	Microscope inversé utilisé pour la visualisation en fond clair et par épifluorescence de follicules isolés
Huile minérale	Sigma-Aldrich	M8410-1L	Huile pour couvrir les gouttes de fluide de lavage des follicules afin d’éviter l’évaporation pendant la recherche
Acides aminés non essentiels (NEAA)	Gibco	11140-050	Composant du milieu de lavage des follicules Sérum d’âne
normal	Jackson ImmunoResearch	017-000-001	Réactif pour tampon de blocage de l’immunocoloration
Nunc Plats à 4 puits pour FIV	Thermo Fisher Scientific	144444	Plats à 4 puits pour l’isolement et le lavage des follicules Solution
pénicilline-streptomycine 100x	Gibco	15-140-122	Composant du milieu de lavage des follicules
Boîte de Pétri 60 mm OD x 13,7 mm	Ted Pella	10184-04	Boîte de Pétri qui s’adapte le mieux à la McIlwain Tissue Chopper
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Fisher Scientific	BP665-1	Tampon de lavage pour ovaires et follicules
Planche à découper en plastique	Fisher Scientific	09-002-24A	Planche à découper de taille suffisante pour couper en toute sécurité ovaires
Polyvinylpyrrolidone (PVP)	Fisher Scientific	BP431-100	L’ajout de PVP (0,1 % p/v) au PBS empêche les follicules de coller à la plaque ou les uns aux autres  ;
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Milieu de montage pour cellules ou tissus marqués par fluorescence
Qiagen RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Kit de nettoyage de colonne d’ARN
R	The R Foundation	v4.1.2	Logiciel d’analyse statistique
Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Anticorps polyclonal	Abcam	ab181701	Cx37 Anticorps primaire pour l’immunocoloration
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	K1691	Kit de synthèse d’ADNc
Rstudio	RStudio, PBC	v2021.09.2	Logiciel d’analyse statistique
Solution d’hydroxyde de sodium (1N/Certified)	Fisher Scientific	SS266-1	Utilisé pour augmenter le pH du milieu à 7,6-7,8
Pyruvate de sodium (NaPyr)	Gibco	11360-070	Composant du moyen de lavage des follicules Boîte de
Pétri carrée 100 mm x 15 mm  ;	Thermo Fisher Scientific	60872-310	Les boîtes de Pétri grillagées permettent une identification plus efficace des follicules.
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725271	Mastermix pour réaction PCR
Filtre fileté Steritop Filtre fileté	Sigma-Aldrich	S2GPT02RE	Utilisé pour stériliser le milieu de lavage des follicules
Coloration de gel d’ADN sans danger pour SYBR	Thermo Fisher Scientific	S33102	Coloration des produits PCR visuels sur gel d’agarose
TCM199 avec Hank' s Sels	Gibco	12-350-039	Composant du milieu de lavage des follicules
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Détergent pour tampon de perméabilisation d’immunocoloration
Réactif de trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026	réactif d’isolement de l’ARN
Trypan Blue Solution, 0,4 %	Gibco	15-250-061	Utilisé pour tester la viabilité des follicules isolés
Tween 20			Détergent pour tampon de lavage immuno-colorant
Plaque chauffante Universel	WTA	20931	Plaque chaude pour maintenir les follicules à 38,5 ° ; C lors de la recherche au microscope
Wiretrol II Micropipettes calibrées	Drummond	50002-005	Micropipettes en verre pour manipuler les follicules

 % de de