Marquage de proximité basé sur AirID pour l’interaction protéine-protéine chez les plantes

Ahmad Zada; Imran Khan; Min Zhang; Yuting Cheng; Xueyun Hu

doi:10.3791/64428

Article de méthode

Marquage de proximité basé sur AirID pour l’interaction protéine-protéine chez les plantes

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DOI :

10.3791/64428

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16 septembre 2022

Ahmad Zada^*¹ , Imran Khan^*¹ , Min Zhang¹ , Yuting Cheng¹ , Xueyun Hu¹

¹College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole étape par étape pour réaliser l’expérience de marquage de proximité (PL) chez le concombre (Cucumis sativus L.) en utilisant la protéine AT4G18020 (APRR2)-AirID comme modèle. La méthode décrit la construction d’un vecteur, la transformation d’une construction par agroinfiltration, l’infiltration de biotine, l’extraction de protéines et la purification de protéines marquées à la biotine par une technique de purification par affinité.

Résumé

Dans les cellules et les plantes de mammifères, les approches de marquage de proximité (PL) utilisant l’ascorbate peroxydase modifiée (APEX) ou la biotine ligase BirA d’Escherichia coli (connue sous le nom de BioID) se sont avérées efficaces pour identifier les interactions protéine-protéine (IPP). APEX, BioID et TurboID, une version révisée de BioID, ont certaines restrictions en plus d’être des technologies précieuses. L’AirID, une nouvelle version de BioID récemment développée pour l’identification de proximité dans les interactions protéine-protéine, a permis de surmonter ces restrictions. Auparavant, AirID a été utilisé dans des modèles animaux, tandis que l’étude actuelle démontre l’utilisation d’AirID dans les plantes, et les résultats ont confirmé qu’AirID fonctionne mieux dans les systèmes végétaux par rapport à d’autres enzymes PL telles que BioID et TurboID pour le marquage des protéines qui sont proches des protéines cibles. Voici un protocole étape par étape pour identifier les partenaires d’interaction protéique en utilisant la protéine AT4G18020 (APRR2) comme modèle. Les méthodes décrivent la construction du vecteur, la transformation de la construction par agroinfiltration, la transformation de la biotine, l’extraction des protéines et l’enrichissement des protéines marquées à la biotine par une technique de purification par affinité. Les résultats concluent qu’AirID est une enzyme nouvelle et idéale pour analyser les IPP chez les plantes. La méthode peut être appliquée à l’étude d’autres protéines dans les plantes.

Introduction

Diverses protéines cellulaires fonctionnent dans le cadre du système de régulation biologique, et les interactions protéine-protéine (IPP) font partie de ce système et sont à la base de nombreux processus cellulaires. Outre les IPP, la fonction des protéines naturelles est favorisée post-traductionnellement par diverses modifications telles que la formation de complexes, l’ubiquitination et la phosphorylation. Par conséquent, l’étude des IPP est importante pour comprendre la fonction possible des protéines cibles. Les IPP ont été réalisés à l’aide de diverses technologies telles que l’analyse par spectrométrie de masse après immunoprécipitation (analyse IP-MS....