Un protocole de défrichement efficace pour l’étude du développement des semences de tomates (Solanum lycopersicum L.)

Summary

La graine de tomate est un modèle important pour étudier la génétique et la biologie du développement pendant la reproduction des plantes. Ce protocole est utile pour éliminer les graines de tomates à différents stades de développement afin d’observer la structure embryonnaire plus fine.

Abstract

La tomate (Solanum lycopersicum L.) est l’une des principales cultures commerciales au monde. La graine de tomate est un modèle important pour étudier la génétique et la biologie du développement pendant la reproduction des plantes. La visualisation d’une structure embryonnaire plus fine dans une graine de tomate est souvent entravée par le mucilage du tégument, le tégument multicellulaire et un endosperme à paroi épaisse, qui doit être résolu par une encastre-section laborieuse. Une alternative plus simple consiste à utiliser des techniques de nettoyage des tissus qui rendent la graine presque transparente à l’aide d’agents chimiques. Bien que les procédures de défrichage conventionnelles permettent de mieux comprendre les petites graines avec un tégument plus mince, le défrichement des semences de tomates continue d’être techniquement difficile, en particulier dans les derniers stades de développement.

Un protocole de défrichement rapide et économique permet d’observer le développement des graines de tomates de 3 à 23 jours après la floraison, lorsque la morphologie embryonnaire est presque terminée. Cette méthode combine une solution de nettoyage à base d’hydrate de chloral largement utilisée chez Arabidopsis avec d’autres modifications, y compris l’omission de la fixation formol-acéto-alcool (FAA), l’ajout d’un traitement à l’hypochlorite de sodium des graines, l’élimination du mucilage ramolli du tégument et le lavage et le traitement sous vide. Cette méthode peut être appliquée pour un nettoyage efficace des graines de tomates à différents stades de développement et est utile pour le suivi complet du processus de développement des graines mutantes avec une bonne résolution spatiale. Ce protocole de défrichage peut également être appliqué à l’imagerie en profondeur d’autres espèces commercialement importantes dans les Solanaceae.

Introduction

La tomate (S. lycopersicum L.) est l’une des cultures légumières les plus importantes au monde, avec une production de 186,8 millions de tonnes de fruits charnus sur 5,1 millions d’hectares en 2020¹. Il appartient à la grande famille des solanacées avec environ 2 716 espèces², y compris de nombreuses cultures commercialement importantes telles que l’aubergine, les poivrons, la pomme de terre et le tabac. La tomate cultivée est une espèce diploïde (2n = 2x = 24) avec une taille de génome d’environ 900 Mb³. Pendant longtemps, de grands efforts ont été faits pour la domestication et la repro....

Protocol

1. Préparation des solutions

1. Préparer le fixateur FAA en ajoutant 2,5 mL de formaldéhyde à 37 %, 2,5 mL d’acide acétique glacial et 45 mL d’éthanol à 70 % dans un tube à centrifuger de 50 mL. Vortex et conserver à 4 °C. Préparer fraîchement le fixateur FAA juste avant utilisation.
   ATTENTION : 37 % de formaldéhyde est corrosif et potentiellement cancérogène en cas d’exposition ou d’inhalation. Le fixateur doit être effectué dans une hotte tout en portant un équipement de protection individuelle approprié.
2. Préparer la solution de nettoyage en ajoutant 5 mL de glycérol à 100 %, 40 g d’hydrate de chloral et 10 mL d’eau distillée da....

Results

Lorsque les graines de tomates ont été éliminées à l’aide d’une méthode conventionnelle comme chez Arabidopsis, des cellules endospermatiques denses ont bloqué la visualisation des embryons de tomates précoces à 3 DAF et 6 DAF (Figure 3A,B). Au fur et à mesure que le volume total de l’embryon augmentait, un embryon globulaire était à peine discernable à 9 DAF (Figure 3C). Cependant, à mesure que la taille de la graine continuait d’augme.......

Discussion

Par rapport à la section mécanique, la technologie de nettoyage est plus avantageuse pour l’imagerie tridimensionnelle car elle conserve l’intégrité des tissus ou organes végétaux¹⁶. Les protocoles de nettoyage conventionnels sont souvent limités à de petits échantillons en raison de la pénétration plus facile des solutions chimiques. La graine de tomate est un échantillon problématique pour le nettoyage des tissus car elle est environ 70 fois plus grande qu’une graine d’Arabidopsis et pr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 000 et micro ; Pipette L	GILSON	FA10006M
1 000 & micro ; Pointes de pipette L	Corning	T-1000-B
Tube à centrifuger de 2 ml	Axygen	MCT-200-C
37 % formaldéhyde	DAMAO	685-2013
5 000 & micro ; Pipette L	Eppendorf	3120000275
5 000 & micro ; L pointes de pipette	biosharp	BS-5000-TL
50 ml tube à centrifuger	Corning	430829
Absolute Ethanol	BOYUAN	678-2002
Bouteille verre	Fisher	FB800-100
Chloral Hydrate	Meryer	M13315-100G
Coverslip	Leica	384200
microscope DIC	Zeiss	Axio Imager A1	Grossissement 10x, 20x et 40x
Désinfectant	QIKELONGAN	17-9185
Aiguille de dissection	Bioroyee	17-9140
Sol nutritif pour fleurs	FANGJIE
Forceps	HAIOU	4-94
Acide acétique glaciaire	BOYUAN	676-2007
Glycérol	Solarbio	G8190
Agitateur magnétique	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Agitateur orbital	QILINBEIER	QB-206
Substrat de semis	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Criblage :0-10 mm
Lame concave simple	HUABODEYI
Diapositive	Leica	3800381
Stéréomicroscope	Leica	S8 APO	Grossissement 1x à 4x
Feuille d’étain	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Pompe à vide	SHIDING	SHB-III
Vortex mètre	Silogex	MX-S