Un protocole de défrichement efficace pour l’étude du développement des semences de tomates (Solanum lycopersicum L.)

La tomate (S. lycopersicum L.) est l’une des cultures légumières les plus importantes au monde, avec une production de 186,8 millions de tonnes de fruits charnus sur 5,1 millions d’hectares en 2020¹. Il appartient à la grande famille des solanacées avec environ 2 716 espèces², y compris de nombreuses cultures commercialement importantes telles que l’aubergine, les poivrons, la pomme de terre et le tabac. La tomate cultivée est une espèce diploïde (2n = 2x = 24) avec une taille de génome d’environ 900 Mb³. Pendant longtemps, de grands efforts ont été faits pour la domestication et la reproduction de la tomate en sélectionnant des caractères souhaitables chez Solanum spp. Il y a plus de 5 000 accessions de tomates répertoriées dans le Centre de ressources génétiques sur la tomate et plus de 80 000 germoplasmes de tomates sont stockés dans le monde⁴. Le plant de tomate est vivace en serre et se propage par graines. Une graine de tomate mature se compose de trois compartiments principaux : un embryon adulte, un endosperme résiduel de type cellulaire et un tégument dur ^5,6 (figure 1A). Après une double fécondation, le développement de l’endosperme de type cellulaire précède le développement des zygotes. À ~5-6 jours après la floraison (DAF), le proembryon bicellulaire est observé pour la première fois lorsque l’endosperme est constitué de six à huit noyaux⁷. Chez Solanum pimpinellifolium, l’embryon approche de sa taille finale après 20 DAF, et les graines sont viables pour la germination après 32 DAF⁸. Au fur et à mesure que l’embryon se développe, l’endosperme est progressivement absorbé et seule une petite quantité d’endosperme reste dans la graine. L’endosperme résiduel est constitué d’endosperme micropylaire entourant l’extrémité radiculaire et d’endosperme latéral dans le reste de la graine ^9,10. Le tégument externe est développé à partir de l’épiderme externe épaissi et lignifié du tégument, et avec les couches mortes de restes de tégument, ils forment une coquille dure pour protéger l’embryon et l’endosperme⁵.

Figure 1 : Représentation schématique d’une graine mature chez Solanum lycopersicum et Arabidopsis thaliana. (A) Anatomie longitudinale d’une graine de tomate mature. (B) Anatomie longitudinale d’une graine d’Arabidopsis mature. Une graine de tomate mûre est environ 70 fois plus grande qu’une graine d’Arabidopsis. Barres d’échelle = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La production de semences de tomates de haute qualité dépend de la coordination entre l’embryon, l’endosperme et les composants maternels^{des semences 11}. La dissection de gènes et de réseaux clés dans le développement des semences nécessite un enregistrement phénotypique approfondi et complet des graines mutantes. Les techniques conventionnelles d’encastrement-section, telles que la section semi-mince et la section de paraffine, sont largement appliquées aux graines de tomates pour observer les structures locales et plus fines de l’embryon^12,13,14,15. Cependant, l’analyse du développement des graines à partir de sections minces est généralement laborieuse et manque de résolution spatiale de l’axe z. En comparaison, la clairsemage tissulaire est une méthode rapide et efficace pour déterminer le stade de développement des anomalies embryonnaires les plus susceptibles de se produire¹⁶. La méthode de nettoyage réduit l’opacité des tissus internes en homogénéisant l’indice de réfraction avec un ou plusieurs agents biochimiques¹⁶. Le nettoyage des tissus entiers permet d’observer la structure d’un tissu végétal sans détruire son intégrité, et la combinaison de la technologie de nettoyage et de l’imagerie tridimensionnelle est devenue une solution idéale pour obtenir des informations sur la morphologie et l’état de développement d’un organe végétal^17,18. Au fil des ans, des techniques de débroussaillage ont été utilisées chez diverses espèces végétales, notamment Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare et Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Parmi celles-ci, la technologie de défrichage des ovules à montage entier a été une approche efficace pour étudier le développement des graines d’Arabidopsis, en raison de sa petite taille, de ses 4-5 couches de cellules de tégument et de l’endosperme de type nucléaire^24,25. Avec la mise à jour continue de différents mélanges de nettoyage, tels que l’émergence de la solution²⁶ de Hoyer, les structures internes de l’ovule d’orge ont été imagées avec un haut degré de clarté, bien que son endosperme constitue la majeure partie des graines. L’embryogenèse de la betterave sucrière peut être observée par débroussaillage combiné à un traitement sous vide et ramollissement à l’acide chlorhydrique¹⁹. Néanmoins, contrairement aux espèces mentionnées ci-dessus, les observations embryologiques par protocoles de nettoyage dans les graines de tomates n’ont pas été rapportées. Cela empêche une étude détaillée du développement embryonnaire et des semences de tomates.

L’hydrate de chloral est couramment utilisé comme solution de compensation qui permet aux tissus immergés et aux cellules d’être affichés sur différents plans optiques et préserve considérablement les cellules ou les composants tissulaires^27,28,29. Le protocole de nettoyage à base d’hydrate de chloral a été utilisé avec succès pour le nettoyage complet des graines afin d’observer l’embryon et l’endosperme d’Arabidopsis^21,28. Cependant, cette solution de nettoyage n’est pas efficace pour éliminer les graines de tomates, qui sont plus imperméables que les graines d’Arabidopsis. Les barrières physiques comprennent: (1) le tégument de la tomate a près de 20 couches cellulaires à 3 à 15 DAF 30,31, (2) l’endosperme de la tomate est de type cellulaire, pas de type nucléaire³², et (3) les graines de tomate sont environ 70 fois plus grandes en taille^33,34 et (4) produisent de grandes quantités de mucilage de tégument^, ce qui bloque la pénétration des réactifs d’élimination et affecte la visualisation des cellules embryonnaires.

Par conséquent, ce rapport présente une méthode optimisée de nettoyage à base d’hydrate de chloral pour l’élimination complète des graines de tomates à différents stades, ce qui permet une imagerie approfondie du processus de développement de l’embryon (Figure 2).

1. Préparation des solutions

1. Préparer le fixateur FAA en ajoutant 2,5 mL de formaldéhyde à 37 %, 2,5 mL d’acide acétique glacial et 45 mL d’éthanol à 70 % dans un tube à centrifuger de 50 mL. Vortex et conserver à 4 °C. Préparer fraîchement le fixateur FAA juste avant utilisation.
   ATTENTION : 37 % de formaldéhyde est corrosif et potentiellement cancérogène en cas d’exposition ou d’inhalation. Le fixateur doit être effectué dans une hotte tout en portant un équipement de protection individuelle approprié.
2. Préparer la solution de nettoyage en ajoutant 5 mL de glycérol à 100 %, 40 g d’hydrate de chloral et 10 mL d’eau distillée dans une bouteille en verre de 100 ml enveloppée de papier d’aluminium. Dissoudre à l’aide d’un agitateur magnétique pendant une nuit à température ambiante. La solution préparée peut être conservée à 4 °C jusqu’à 6 mois.
   ATTENTION : L’hydrate de chloral est cancérigène et dégage une odeur âcre. Effectuez l’expérience dans une hotte et portez un équipement de protection individuelle approprié. L’hydrate de chloral est facile à déliquescer dans l’air et ne doit pas être stocké en grande quantité. La solution de compensation peut se décomposer lorsqu’elle est exposée à la lumière et doit être tenue à l’écart de la lumière.
3. Préparer la solution désinfectante en ajoutant 10 mL d’hypochlorite de sodium à 6 %, 40 mL d’eau distillée et 50 μL de Tween-20 dans un tube à centrifuger de 50 mL. Vortex et stockez-le à température ambiante. Préparez fraîchement la solution désinfectante juste avant utilisation.
   NOTE: La teneur en chlore efficace de l’hypochlorite de sodium qui a été placé pendant une longue période peut diminuer, et la teneur en hypochlorite de sodium à 6% peut être augmentée en fonction de la situation réelle.

2. Collecte des semences

1. Semez des graines de tomates (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, voir tableau des matières) dans des bassins carrés de 8 cm × 8 cm × 8 cm remplis d’un mélange 1:1 de sol nutritif de fleurs et de substrat (v/v) (voir tableau des matières), et poussez dans une salle de croissance avec 16/8 h de périodes lumière/obscurité à 24 ± 2 °C (jour) et 18 ± 2 °C (nuit), 60% à 70% d’humidité relative et une intensité lumineuse de 4 000 Lux. Environ 6 semaines plus tard, les plantes sont entrées dans la phase de floraison.
2. Marquez la date de floraison des fleurs indépendantes à l’anthèse (l’angle d’ouverture des pétales est de 90°) et enregistrez le lendemain de la floraison (DAF).
3. Récoltez les fruits de 3 à 23 plants de tomates DAF et mettez-les immédiatement sur la glace. Répartir les fruits (graines ou embryons) de 3 à 23 DAF en fruits précoces (3-10 DAF), moyens (11-16 DAF) et tardifs (17-23 DAF) (graines ou embryons).
   REMARQUE: Ne récoltez pas trop de fruits à la fois et assurez-vous que les graines de chaque fruit sont dépouillées dans les 1 h pour un traitement ultérieur.
4. Pour les fruits primeurs, cassez le fruit et mettez-le sur une lame, et recueillez soigneusement les graines fraîches avec une pince de précision au stéréomicroscope (voir le tableau des matériaux) à un grossissement de 1x à 4x. Pour les fruits moyens et tardifs, cassez les fruits et collectez directement les graines fraîches à l’aide d’une pince de précision.

3. Élimination des semences à base d’hydrate de chloral

REMARQUE : Les protocoles conventionnels³⁵ et optimisés ont été comparés dans cette étude pour leur efficacité de défrichement des semences.

1. Compensation à l’aide d’un protocole conventionnel
   1. Placer immédiatement les graines fraîches (obtenues à l’étape 2.4) dans un tube à centrifuger de 2 mL contenant 1,5 mL de fixateur FAA et incuber sur un agitateur orbital (5 tr/min, voir le tableau des matières) pendant 4 h à température ambiante.
   2. Déshydrater ces graines dans une série d’éthanol de 70%, 95% et 100% éthanol (v/v) pendant 1 h chacune sur un agitateur orbital (5 rpm).
   3. Placer les graines dans 3 à 5 gouttes de solution de nettoyage (~100 μL) sur la lame et couvrir délicatement l’échantillon d’une lame. Remplacer la lame par une seule lame concave (voir le tableau des matières) pour les graines moyennes et tardives.
   4. Conservez ces lames ou lames concaves simples à température ambiante pendant 30 min (3 DAF), 2 h (6 DAF), 1 jour (9 DAF), 3 jours (12 DAF) ou 7 jours (14 à 22 DAF) selon les stades de développement du matériel semencier (plus les matériaux sont jeunes, plus la vitesse de dégagement est rapide).
   5. Observez les échantillons à l’aide d’un microscope à contraste interférentiel différentiel (CIV) équipé d’un appareil photo numérique (voir le tableau des matériaux) à un grossissement de 10x, 20x et 40x. Ajustez et optimisez la luminosité de la lumière transmise, le curseur DIC et l’ouverture du condensateur en temps réel pour chaque échantillon et capturez des images.
2. Effacement à l’aide du protocole optimisé
   1. Placer les graines fraîches (obtenues à l’étape 2.4) directement dans un tube à centrifuger de 2 mL contenant 1,5 mL de solution désinfectante (étape 1.3).
      REMARQUE : Le nombre de graines recueillies dans le tube à centrifuger de 2 ml varie selon le stade de développement des graines. Les détails sont présentés dans le tableau 1.
   2. Incuber les échantillons sur un agitateur orbital (30 rpm) à température ambiante pendant 3 à 50 minutes jusqu’à ce que le contour le plus interne du tégument soit clairement visible. Jetez la solution désinfectante.
      NOTE: Le temps d’incubation requis dépend du stade de développement de la graine (plus les graines sont tardives, plus le temps d’incubation sera long). Les détails sont présentés dans le tableau 1.
   3. Pour les graines moyennes et tardives, transférer les graines sur une lame et retirer le mucilage de la graine avec une pince et une aiguille à dissection sous un stéréomicroscope à un grossissement de 1x à 4x. Transférez les graines dans le tube centrifuge d’origine à l’aide d’une pince.
      REMARQUE : Cette étape n’est pas nécessaire pour les graines précoces.
   4. Lavez les graines 5x avec 1,5 mL d’eau désionisée, 10 s à chaque fois. Jetez l’eau désionisée.
   5. Ajouter une solution de nettoyage de 2 × le volume des graines, suivie d’un traitement sous vide pendant 0 à 50 min (tableau 1) avec une pompe à vide (voir tableau des matériaux). Un traitement intermittent sous vide est effectué avec chaque traitement sous vide pendant 10 min espacés de 10 minutes.
   6. Remplacer par une solution de nettoyage fraîche de 2 × le volume des graines. Conserver le tube à centrifuger de 2 ml contenant les graines à température ambiante et à l’abri de la lumière pendant 30 minutes à 7 jours pour faciliter le nettoyage (tableau 1). Pendant l’incubation, pour les embryons tardifs, remplacer quotidiennement la solution de clairance par une solution fraîche et soumettre les graines à un traitement sous vide pendant 10 min.
   7. Préparez les graines dégagées sur des lames ou des lames concaves simples et observez avec le microscope DIC équipé d’un appareil photo numérique à un grossissement de 10x, 20x et 40x. Ajustez et optimisez la luminosité de la lumière transmise, le curseur DIC et l’ouverture du condensateur en temps réel pour chaque échantillon et capturez des images.

Lorsque les graines de tomates ont été éliminées à l’aide d’une méthode conventionnelle comme chez Arabidopsis, des cellules endospermatiques denses ont bloqué la visualisation des embryons de tomates précoces à 3 DAF et 6 DAF (Figure 3A,B). Au fur et à mesure que le volume total de l’embryon augmentait, un embryon globulaire était à peine discernable à 9 DAF (Figure 3C). Cependant, à mesure que la taille de la graine continuait d’augmenter, sa perméabilité diminuait, ce qui donnait un embryon de cœur flou à 12 DAF (Figure 3D). À partir de 13 DAF, le mucilage et le tégument des semences se sont progressivement densifiés, empêchant la pénétration des agents de défrichement. Le contour de l’embryon à l’intérieur de 14-19 graines DAF était extrêmement flou même lorsque la durée du traitement a été prolongée à 7 jours (Figure 3E-G). Dans 22 graines DAF, la structure interne de la graine était complètement invisible (Figure 3H).

Par conséquent, la procédure conventionnelle de nettoyage à base d’hydrate de chloral a été optimisée pour permettre le nettoyage efficace des semences de tomates. Les détails de toutes les étapes sont présentés dans le tableau 1. Premièrement, les étapes de fixation de la FAA et de déshydratation à l’éthanol, qui sont souvent requises dans les procédures de déminage conventionnelles, ont été omises du protocole. Bien que la fixation de la FAA soit généralement utilisée pour préserver la structure morphologique et les composants cellulaires de la décomposition, il a été constaté (dans cette étude) que la structure interne des graines de tomates n’était pas facilement déformée et était bien préservée malgré l’absence de fixation de la FAA et de déshydratation à l’éthanol.

Deuxièmement, le mucilage du tégument produit par les cellules épidermiques du tégument est très important à partir de 13 DAF (Figure 4). Le mucilage des graines riche en polysaccharides a montré une viscosité élevée et une perméabilité significativement faible35,36. Les essais initiaux pour l’enlever sans détruire le tégument à l’aide de pinces fines et d’aiguilles sous un microscope à dissection ont malheureusement échoué. C’est parce que le tégument est fragile et étroitement relié au mucilage. De plus, l’existence de pigment dans le tégument entraîne en outre une baisse de la qualité de l’image en fond clair37. Pour surmonter ce problème, les graines ont été traitées avec une solution désinfectante d’hypochlorite de sodium à 1,2% et de Tween 20 à 0,1%. L’effet blanchissant de l’hypochlorite de sodium permet une identification claire du tégument interne et crée un environnement relativement stérile qui a permis de stocker les échantillons pendant une longue période. L’utilisation du détergent Tween 20 pourrait réduire la tension superficielle et augmenter la perméabilité des graines. Plus important encore, après cette étape, la majeure partie du mucilage adhérent peut être détachée de la graine sans endommager le tégument (Figure 4). Dorénavant, les graines traitées ont été regroupées dans un tube centrifuge de 2 mL et incubées à température ambiante dans un agitateur orbital (30 rpm).

Troisièmement, le traitement par vide a été utilisé pour accélérer la pénétration de la solution de compensation dans les embryons aux stades moyen et tardif. Enfin, comme les graines de tomates sont particulièrement grosses après 12 DAF, les lames conventionnelles ont été remplacées par des lames concaves simples lors de l’imagerie DIC.

Après traitement selon le protocole de défrichement optimisé, les semences de tomates ont montré une transparence satisfaisante à tous les stades de développement testés (Figure 5A-L). Contrairement aux contours cellulaires flous obtenus à l’aide de protocoles conventionnels, des couches cellulaires distinctes du tégument à 3 DAF étaient visibles (Figure 5A). Les cellules endospermatoïdes étaient plus faciles à distinguer à 5 DAF (Figure 5B). L’embryon en forme de bâton est apparu à 7 DAF, puis l’embryon a atteint le stade globulaire à 9 DAF et le stade cardiaque à 11 DAF (Figure 5C-E). Au cours de ces stades de développement, les contours des cellules à l’intérieur de l’embryon étaient les plus clairement visibles. Par rapport à la méthode conventionnelle, le protocole optimisé a produit des images de bien meilleure qualité du stade cardiaque au stade embryonnaire mature. Lorsque le développement embryonnaire a atteint le stade précoce de torpille à 13 DAF, le stade moyen de torpille à 14 DAF, le stade de torpille tardif à 15 DAF, le stade de cotylédon précoce à 16 DAF, le stade de cotylédon courbé à 19 DAF et 21 DAF, et l’embryon mature à 23 DAF, le degré de boucle des cotylédons et du méristème apical des pousses a été très facilement capturé (Figure 5F-L ). Cependant, au-delà de 23 DAF, il n’était pas possible de visualiser les détails dans l’embryon, même lorsque le traitement d’éclaircissement était prolongé à plus de 1 semaine.

Figure 2 : Organigramme du protocole conventionnel et du protocole optimisé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Images de contraste d’interférence différentielle des ovules de S. lycopersicum traités par la méthode de nettoyage conventionnelle. (A) Un ovule avec un sac embryonnaire flou à 3 DAF. (B) Sac embryonnaire avec des cellules endospermatozoïdes visibles (pointes de flèches) à 6 DAF. (C) Un embryon globulaire à peine distinguable à 9 DAF. Un embryon flou à (D) 12, (E) 14, (F) 16 et (G) 19 DAF. (H) La structure interne de la graine est complètement invisible à 22 DAF. Barres d’échelle = 25 μm; em = embryon; es = sac embryonnaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Désinfection des graines de S. lycopersicum à différents stades de développement. Les images du haut (A1-F1) sont les graines rayées des fruits en développement à (A1) 11, (B1) 12, (C1) 14, (D1) 16, (E1) 18 et (F1) 21 DAF, tandis que les images du bas (A2-F2) sont des graines traitées avec une solution désinfectante. En A2-F2, le contour interne du tégument peut être clairement identifié. Barres d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Images de contraste d’interférence différentielle d’embryons de S. lycopersicum effacées à l’aide du protocole optimisé. (A-L) images de microscopie DIC de l’ovule de tomate avec un sac embryonnaire visible à (A) 3 DAF et (B) 5 DAF, (C) un embryon en forme de bâton à 7 DAF, (D) un embryon globulaire à 9 DAF, (E) un embryon cardiaque à 11DAF, (F) un embryon de torpille précoce à 13 DAF, (G) un embryon de torpille moyenne 14 DAF, (H) un embryon de torpille tardive à 15 DAF, (I) un embryon de cotylédon précoce à 16 DAF, un embryon de cotylédon courbé à (J) 19 DAF et (K) 21 DAF, et (L) un embryon mature à 23 DAF. Barres d’échelle = 50 μm; em = embryon; sc = tégument; fr = endosperme; es = sac embryonnaire; hy = hypocotyle; co = cotylédon; r = radicule; SA = pousse apicale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Optimisation du protocole pour améliorer l’efficacité de nettoyage des semences de tomates. 1 = Opérations par lots, élimination de l’observation d’un grand nombre de graines à la fois; les graines ont été placées dans un tube à centrifuger de 2 mL. 2 = Désinfection à 6 % de NaClO:dH2O:Tween-20, dans des proportions de 200:800:1 (v/v); Toutes les étapes ont été effectuées sur un agitateur orbital avec une secousse de 30 tr/min. 3 = Toutes les étapes ont été effectuées au microscope à dissection à l’aide de pinces et d’aiguilles à dissection, sauf indication contraire. 4 = Les graines ont été lavées à l’eau distillée après chaque étape. 5 = Nettoyage à 100% glycérol:hydrate de chloral:dH2O, dans des proportions de 1:8:2 (v/p/v). 6 = Chaque traitement sous vide durait 10 minutes et était espacé de 10 minutes. 7 = Remplacer par une solution de nettoyage fraîche et conserver les graines à l’abri de la lumière à température ambiante; pour les semences de 17 DAF à 23 DAF, remplacer la solution de nettoyage par une solution fraîche et passer sous vide pendant 10 min par jour pendant toute la période d’incubation.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.