Nous rapportons une chambre environnementale flexible au sommet de l’étage pour l’imagerie accélérée de cellules vivantes à l’aide de la microscopie à diffusion Raman stimulée verticalement avec détection de signal transmis. Des gouttelettes lipidiques ont été imagées dans des cellules SKOV3 traitées à l’acide oléique pendant 24 heures avec un intervalle de temps de 3 minutes.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Une chambre flexible pour l’imagerie de cellules vivantes en accéléré avec microscopie à diffusion Raman stimulée
Dans cet article
Résumé
Résumé
La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est une technologie d’imagerie chimique sans marquage. L’imagerie de cellules vivantes avec SRS a été démontrée pour de nombreuses applications biologiques et biomédicales. Cependant, l’imagerie SRS à long terme de cellules vivantes n’a pas été largement adoptée. La microscopie SRS utilise souvent un objectif d’immersion dans l’eau à grande ouverture numérique (NA) et un condenseur à immersion d’huile à haute NA pour obtenir une imagerie à haute résolution. Dans ce cas, l’écart entre l’objectif et le condensateur n’est que de quelques millimètres. Par conséquent, la plupart des chambres environnementales commerciales ne peuvent pas être utilisées pour l’imagerie SRS en raison de leur grande épaisseur avec un couvercle en verre rigide. Cet article décrit la conception et la fabrication d’une chambre flexible pouvant être utilisée pour l’imagerie de cellules vivantes en accéléré avec détection de signal SRS transmis sur un cadre de microscope vertical. La flexibilité de la chambre est obtenue en utilisant un matériau souple - un film mince de caoutchouc naturel. La nouvelle conception du boîtier et de la chambre peut être facilement ajoutée à une installation d’imagerie SRS existante. Les tests et les résultats préliminaires démontrent que le système de chambre flexible permet une imagerie SRS stable, à long terme et accélérée de cellules vivantes, qui peut être utilisée pour diverses applications de bioimagerie à l’avenir.
Introduction
La microscopie optique est utilisée pour observer les microstructures des échantillons. L’imagerie optique est rapide, moins invasive et moins destructrice que les autres technologies1. L’imagerie de cellules vivantes avec microscopie optique est développée pour capturer la dynamique des cellules vivantes cultivées sur une longue période2. Différents types de contrastes optiques fournissent des informations distinctes sur les échantillons biologiques. Par exemple, la microscopie optique en phase montre la différence subtile dans les indices de réfraction à travers l’échantillon3. La microscopie à ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Construire l’enceinte environnementale du microscope
REMARQUE : Cette grande enceinte environnementale de microscope est utilisée pour contrôler la température du corps du microscope et de l’environnement d’imagerie à stabiliser à 37 °C (Figure 1A).
- Marquez l’emplacement des pieds du cadre du microscope SRS et de la platine motorisée à l’aide d’un marqueur sur la table optique. Montez deux diaphragmes d’iris devant le scanner Galvanomètre du microscope et ajustez-les pour que la pompe et les faisceaux laser Stokes passent par le centre des diaphragmes d’iris.
- Retirez le cadre du microscop....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Nous avons fabriqué et assemblé le système de chambre flexible pour l’imagerie SRS time-lapse (Figure 1 et Figure 2), puis évalué les performances du système. La température à l’intérieur de l’enceinte environnementale du microscope a atteint les 37 °C attendus en 1 h, ce qui n’a pas affecté de manière significative la température ambiante (figure 3A). La température dans la chambre flexible a atteint 37 °C en 1,5 h, et elle a été m.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La microscopie SRS à cellules vivantes en accéléré est une technique d’imagerie alternative pour le suivi des molécules de manière sans marquage. Par rapport au marquage par fluorescence, l’imagerie SRS est exempte de photoblanchiment, ce qui permet une surveillance à long terme des molécules. Cependant, à ce jour, le système d’imagerie de cellules vivantes sur une microscopie SRS verticale n’est pas disponible dans le commerce. Dans ce travail, un système d’imagerie de cellules vivantes avec une boîte de boîtier de micr.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier l’équipe de conception principale de premier cycle 2019 (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza et James Walsh) de l’Université de Binghamton pour la conception, la fabrication et les tests de la boîte d’enceinte de microscope. Nous remercions Scott Hancock, Olga Petrova et Fabiola Moreno Olivas de l’Université de Binghamton pour leurs discussions utiles. Cette recherche a été soutenue par les National Institutes of Health sous le numéro d’attribution R15GM140444.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Un microscope SRS de laboratoire | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplier | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Diaphragme à iris | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Monture à miroir cinématique | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Monture de microscope | Nikon Inc | FN-1 | |
| Platine de microscopie motorisée | Prior Scientific | Z-Deck | |
| (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Objectif | à immersion dans l’eau MBL71405 | |
| (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Matériaux et pièces pour le boîtier du microscope (31'' x 29'' x 28'' L x l x H) | |||
| Module de chauffage Airtherm | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Contrôleur de chauffage Airtherm, moniteur <>2 et humidité | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Module mélangeur air/CO2 | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Boyau flexible pour conduits (2-1/2'' DI, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| Verre-mica céramique haute température, facile à usiner (6'' x 6'', 1/4'' d’épaisseur) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Feuilles de polycarbonate (épaisseur 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Feuilles de caoutchouc de silicone (36'' x 36'', épaisseur 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Matériaux et pièces pour la chambre flexible | |||
| Plaque chauffante | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| Filtre en ligne haute pureté, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Scie cloche (diamètre de coupe 1-7/8 po) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Scie-cloche (diamètre de coupe 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| Tube en caoutchouc de silicone haute température, souple, 2 mm de diamètre intérieur, 5 mm de diamètre extérieur | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Filtre en ligne (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Tube rond polyvalent en aluminium 6061 (épaisseur de paroi de 1/8'', 4' ' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Tube rond polyvalent en aluminium 6061 (épaisseur de paroi 3/4'', 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Barre d’aluminium polyvalente 6061 (12'' x 12'', épaisseur 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Barre d’aluminium 6061 polyvalente (8'' x 8'', épaisseur 3/8' ') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objectif porte-objectifs (simple) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Porte-échantillon (modifié) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Film de caoutchouc naturel ultra-mince (épaisseur 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Pot en verre scellable sous vide | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB MathWorks | |||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | Logiciel d’imagerie SRS | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover boîtes de culture stériles à fond de verre (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| Milieu de culture cellulaire DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor colorant fluorescent DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Acide oléique | MilliporeSigma | 364525 | |
| Lignée cellulaire SKOV3 | ATCC | HTB-77 |
Références
- Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
