Article de méthode

Extraction de lumican à partir d’une membrane amniotique et détermination de sa température de stockage

DOI :

10.3791/64460

⸱

14 octobre 2022

 ,  ,  , 
1Instituto de Oftalmologia Fundacion Conde de Valenciana IAP, 2Biochemistry Department, Medicine Faculty, Universidad Nacional Autónoma de Mexico

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le présent protocole décrit l’extraction du lumican de la membrane amniotique (AM) et leurs conditions de stockage sous forme d’extrait de MA (AME) à -20 °C, 4 °C et à température ambiante (RT) pendant 6, 12, 20 et 32 jours pour quantifier ses protéines et sa concentration en lumicane.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lumican est un petit protéoglycane riche en leucine dans la membrane amniotique humaine (AM) qui favorise l’épithélialisation cornéenne et l’organisation des fibres de collagène, en maintenant la transparence cornéenne. Dans le présent travail, une méthode d’extraction de protéines de la FA pour obtenir du lumican est proposée. De plus, la stabilité du lumican dans l’extrait AM (AME) stocké à différentes températures et périodes est évaluée. 100 mg de MA ont été décongelés et déépithélialisés mécaniquement. La MA désépithélialisée a été congelée et broyée jusqu’à l’obtention d’une poudre fine, qui a été solubilisée avec 2,5 mL de tampon saline avec des inhibiteurs de protéase et centrifugée pour l’extraction des protéines. Le surnageant a été recueilli et conservé à -20 °C, 4 °C et à température ambiante (RT) pendant 6, 12, 20 et 32 jours. Par la suite, le lumican a été quantifié dans chaque TEA. Cette technique permet un protocole accessible et acquis pour l’extraction du lumican à partir de la FA. La concentration de lumican a été affectée par le temps de stockage et les conditions de température. Le Lumican dans le TEA de 12 jours stocké à -20 °C et 4 °C était significativement plus élevé que les autres TEA. Cette extraction de lumican pourrait être utile pour développer des traitements et des solutions pharmaceutiques. D’autres études sont nécessaires pour déterminer les utilisations du lumican AME dans la réépithélialisation et le processus de cicatrisation.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’un des traitements les plus utilisés pour les affections cornéennes est la greffe de membrane amniotique; Cependant, au cours des dernières années, de nouvelles propositions ont émergé pour l’utilisation de divers composants du tissu amniotique comme traitements alternatifs et adjuvants. Parmi les composants les plus étudiés de la FA figurent ceux obtenus à partir de l’extrait d’AM (AME)1,2,3,4,5,6,7. La MA contient de multiples facteurs solubles tels que des protéines antiangiogéniques, des interleukines (IL), des inhibiteurs tissulaires des métalloprotéinases (TIMPs), des protéines anti-inflammatoires médiées par TSG-6 qui inhibent les pièges extracellulaires des neutrophiles, des facteurs de croissance: facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance transformant (TGF) (alpha et bêta), facteur de croissance kératinocytaire (KGF), facteur de croissance hépatocytes (HGF) et lumican, qui maintient la transparence cornéenne en régulant la fibrillogenèse du collagène1, 2,3,4,5,6,7,8,9.

Le lumican est un petit protéoglycane riche en leucine (SLRP), l’un des principaux composants extracellulaires de la collagénase interstitielle dans la matrice du stroma cornéen, responsable de l’organisation des fibres de collagène et du maintien de la transparence cornéenne 4,10,11. Les protéoglycanes sont des molécules de la matrice extracellulaire (MEC), qui sont les principales dans la réalisation de la signalisation cellulaire et le maintien de l’homéostasie intracellulaire12. Il a été rapporté que les protéines ECM conduisent les processus cellulaires de prolifération, de différenciation et de migration pendant la cicatrisation des plaies11.

Les preuves indiquent la participation possible du lumican dans le processus de réépithélialisation cornéenne. Saika et al., dans une étude, ont montré qu’après une lésion cornéenne, le lumican pouvait être détecté dans les kératocytes cornéens entre les 8 premières heures et jusqu’à 3 jours après la blessure. Présentant la plus forte concentration de lumican le deuxième et le troisième jour, ce protéoglycane est par la suite indétectable le septième jour13. Ces données suggèrent la participation du lumican dans l’activation du processus de réépithélialisation cornéenne. D’autre part, dans une autre étude, il a été rapporté que l’absence de lumican retarde la réépithélialisation; Fait intéressant, l’ajout de Lumican pourrait accélérer le processus de réépithélialisation 4,11,13. De même, une étude récente a rapporté que le lumican peut moduler les fonctions inflammatoires des fibroblastes du limbe cornéen14, ce qui suggère un rôle pour le lumican en tant que modulateur de la réponse inflammatoire, antifibrotique et ré-épithélialisante. De même, le lumican peut moduler la réponse cornéenne en interagissant avec des molécules de signalisation telles que Fas-FasL. De plus, l’absence de lumican dans un modèle Lum-/- souris knockout a démontré que l’absence de signalisation lumican empêche une réparation cornéenne adéquate15.

Principalement, cette méthode vise à démontrer un moyen réalisable et accessible d’extraire le lumican de la FA. Avec cette méthode avantageuse d’extraction du lumican, il est possible d’obtenir des concentrations similaires de protéines, ce qui diminue le temps de traitement et le rend plus pratique pour les chercheurs par rapport aux études précédentes16. De plus, ce lumican AME pourrait être utilisé comme adjuvant pour les processus de réparation et de réépithélialisation de la cornée.

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Protocole

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Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d’examen institutionnel (projet n° CEI-2020/06/04). La MG a été obtenue auprès de la banque d’amnions de l’Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana (à partir de sujets humains déidentifiés), qui est préparée comme décrit par Chávez-García et al.17.

1. Préparation de l’extrait membranaire amniotique

  1. Obtenez 100 mg d’AM de la banque d’amnions.
    NOTE: Selon un rapport précédent, 50 mg de AM sécrètent un total de 10 ng / mL de lumican14. Pour obtenir une concentration plus élevée de lumicane, utiliser 100 mg d’AM, équivalent à une surface totale de 32cm2.
  2. Si le AM est congelé, décongelez-le à température ambiante.
    REMARQUE : Effectuez les procédures suivantes sous une hotte à flux laminaire de classe II B.
  3. Laver le MA dans une boîte de Petri avec 10 ml de solution saline équilibrée stérile (BSS, voir le tableau des matières) pendant 2 min.
    1. Versez le BSS dans un bécher.
    2. Répétez l’étape 3 et confirmez visuellement que le milieu glycérol n’est pas présent dans la boîte de Petri BSS.
      Remarque : Répétez l’étape 3. au besoin jusqu’à ce que le milieu glycérol ne soit pas présent dans la boîte de Petri BSS.
  4. Incuber le MA avec 10 mL de dispase II (1,7 UI/mL, voir le tableau des matières) à 37 °C, 5% de CO2 pendant 30 min.
    REMARQUE: Dispase II est une protéase neutre avec une activité douce sur les cellules épithéliales. Cette enzyme sépare efficacement l’épiderme intact du derme et isole les feuillets épithéliaux intacts18.
  5. Après l’incubation de la dispase, effectuer une désépithélialisation mécanique14 avec un policier en caoutchouc (voir Tableau des matériaux). Confirmer la désépithélialisation par visualisation microscopique.
    NOTE: Le processus de désépithélisation est corroboré dans un microscope inversé utilisant des objectifs 4x et 20x. Visualisez le tissu pour exclure la présence de toute couche cellulaire.
  6. Laver le AM dans une boîte de Petri avec 10 ml de BSS pendant 2 min. Versez le BSS dans un bécher.
  7. Placez la FA désépithélialisée (dAM) dans un tube microcentrifuge de 2 mL. Plongez le dAM dans de l’azote liquide pendant 40 min.
  8. Broyer manuellement le dAM congelé pendant 2-3 min dans un mortier prérefroidi à -85 °C jusqu’à obtention d’une poudre fine.
  9. Dans le mortier, solubiliser la poudre de dAM avec 2,5 mL de solution inhibitrice de protéase (BSS avec inhibiteurs de protéase).
    REMARQUE : Chaque comprimé d’inhibiteur de la protéase est constitué du mélange d’enzymes suivant : extrait de pancréas (0,02 mg/mL), thermolysine (métalloprotéase) (0,0005 mg/mL), chymotrypsine (0,002 mg/mL), trypsine (0,02 mg/mL) et papaïne (0,33 mg/mL) (voir le tableau des matières).
  10. Recueillir le mélange avec une micropipette et nettoyer les murs du mortier à l’aide d’un couteau à scalpel. Placer le mélange dans un tube de 5 mL.
  11. Bien mélanger avec le vortex pendant 30 s.
  12. Homogénéiser le mélange tissulaire par centrifugation à 34 x g pendant 20 min à 4 °C et centrifuger immédiatement à 3360 x g pendant 20 min à 4 °C.
  13. Le surnageant recueilli est le TEA (figure 1). Entreposer 0,7 mL de chaque TEA dans différents tubes microcentrifugeuses de 2 mL pendant 6, 12, 20 et 33 jours aux différentes conditions de température de -20 °C, 4 °C et température ambiante (RT).

figure-protocol-1
Figure 1 : Processus de préparation de la TEA et mesure de la concentration en lumican. 100 mg de MA ont été incubés avec la dispase II à 37 °C pendant 30 min et désépithélialisés mécaniquement. La FA dé-épithélialisée a été lavée et immergée dans de l’azote liquide pendant 40 minutes, puis broyée jusqu’à obtention d’une poudre fine, qui a été solubilisée avec 2,5 mL de tampon saline avec des inhibiteurs de protéase et centrifugée. Le surnageant a été recueilli et conservé à -20 °C, 4 °C et RT pendant 6, 12, 20 et 32 jours jusqu’à la quantification totale des protéines et du lumican. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Quantification des protéines AME

NOTE: La quantification des protéines totales dans le TEA doit être effectuée immédiatement après l’obtention. Quantifier les protéines à l’aide du dosage des protéines de Lowry et suivre les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Il est recommandé que tous les étalons et échantillons soient analysés en trois exemplaires.

  1. Pipeter 40 μL de chaque échantillon de TEA dans une microplaque de 96 puits.
    1. Préparer une courbe étalon dans la même microplaque en utilisant l’étalon d’albumine sérique bovine (BSA) pour une concentration finale de BSA de 0 à 1 500 μg/mL (0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1 000 et 1 500 μg/mL).
  2. Pipeter 200 μL du réactif Lowry modifié dans chaque puits. Mélangez-le immédiatement sur un batteur à plaques pendant 30 s.
  3. Couvrir la microplaque de papier d’aluminium et l’incuber à TA pendant 10 min.
  4. Pipeter 20 μL de 1x réactif Folin-Ciocalteu à chaque puits. Mélangez-le immédiatement sur un batteur à plaques pendant 30 s.
    NOTE: Pour préparer 1x réactif Folin-Ciocalteu, diluer 2x (2N) réactif 1:1 avec de l’eau ultrapure. Préparer 1x réactif Folin-Ciocalteu le jour même d’utilisation car le réactif dilué est instable.
  5. Couvrir la microplaque de la lumière avec du papier d’aluminium et l’incuber à TA pendant 30 min.
  6. Mesurer l’absorbance des échantillons à 660 nm dans un spectromètre à plaques ELISA (voir Tableau des matériaux).
    REMARQUE: La couleur peut être mesurée à des longueurs d’onde comprises entre 650 nm et 750 nm.
  7. Faire la moyenne de la valeur d’absorbance de 660 nm des échantillons blancs étalons et la soustraire des autres valeurs de 660 nm des échantillons standard et inconnus.
    1. Mesurer l’absorbance à l’aide d’un spectromètre à plaques ELISA en mode point final avec une faible secousse pendant 10 s.
  8. Utilisez la courbe standard pour déterminer la concentration en protéines de chaque échantillon inconnu.
  9. Pour le calcul de la protéine, déterminer la concentration à partir d’un graphique de régression linéaire en utilisant les valeurs d’absorbance sur l’axe des Y par rapport aux concentrations en mg/mL sur l’axe X de chaque courbe BSA standard.
    1. Obtenez l’équation de régression linéaire et la valeur r pour calculer la concentration en protéines.
      REMARQUE : Les résultats sont exprimés sous forme de valeurs de concentration relative normalisées de protéines totales par rapport à mg d’AM (μg/mL de protéines/mg de tissu AM).

3. Quantification du Lumican dans le TEA

NOTA : La concentration de lumican doit être mesurée dans le TEA entreposé dans différentes conditions et périodes d’entreposage. Quantifier le lumican à l’aide d’un test ELISA sandwich et suivre les instructions du fabricant. Il est recommandé que tous les étalons et échantillons soient analysés en double.

  1. Diluer l’anticorps de capture de lumican humain (voir le tableau des matériaux) à la concentration employée dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    REMARQUE : Le flacon d’anticorps de capture contient 120 μg d’anticorps. Après reconstitution avec 0,5 mL de PBS, diluer l’anticorps de capture à une solution de travail de 2 μg/mL.
    1. Pipeter instantanément 100 μL par puits de l’anticorps de capture dilué sur une microplaque de 96 puits. Enfermez l’assiette et incuberez-la pendant la nuit chez RT.
  2. Aspirer chaque puits et le laver par pipetage avec 300 μL de tampon de lavage : monolaurate de polyoxyéthylène sorbitan à 0,05 % 20 dans du PBS, pH 7,2-7,4 (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un pipeteur multicanal. Répétez trois fois.
    REMARQUE: Après le dernier lavage, retirez tout tampon de lavage restant en éversant la plaque et tapotez-la doucement contre les serviettes en papier.
  3. Bloquer les plaques en ajoutant 300 μL de diluant réactif : 1 % de BSA dans PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 μm filtré (voir le tableau des matériaux) à chaque puits. Incuber à TA pendant 1 h.
  4. Répétez l’étape 2.
  5. Préparer une courbe étalon dans une microplaque à 96 puits en utilisant des dilutions en série doubles de 0 à 8 000 pg/mL pour des concentrations finales de 125, 250, 500, 1 000, 2 000, 4 000 et 8 000 pg/mL. Le kit lumican ELISA contient un lumican recombinant standard de 75 ng (voir le tableau des matériaux).
  6. Ajouter 100 μL d’échantillons et la courbe standard dans la microplaque à 96 puits revêtue d’anticorps de capture.
  7. Couvrir la microplaque et incuber pendant 2 h à TA avec une faible agitation dans une bascule compacte en maintenant la vitesse entre 2-3 tr / min.
  8. Répétez l’étape 2.
  9. Ajouter 100 μL de l’anticorps de détection biotinylé (voir le tableau des matériaux) à chaque puits. Couvrir de la lumière et incuber 2 h à TA avec une faible agitation dans une bascule compacte en maintenant la vitesse entre 2-3 tr / min.
    REMARQUE : Le flacon d’anticorps de détection biotinylée contient 24 μg d’anticorps. Après reconstitution avec 1,0 mL de diluant réactif, diluer l’anticorps de détection biotinylé à une solution de travail de 400 ng/mL.
  10. Répétez l’étape 2.
  11. Ajouter 100 μL de la dilution de travail de la streptavidine-peroxydase de raifort (HRP, voir le tableau des matières) à chaque puits. Couvrir la microplaque de la lumière et incuber pendant 20 min à TA.
    REMARQUE: La streptavidine-HRP réactive était concentrée 40 fois. La solution de travail 1x de streptavidine-HRP a été faite avec un diluant réactif.
    REMARQUE: Évitez de placer la plaque à la lumière directe.
  12. Répétez l’étape 2.
  13. Enfin, ajouter 100 μL de solution de tétraméthylbenzidine (TMB, voir le tableau des matériaux) dans chaque puits.
    NOTE: Préparer la solution TMB avec un volume égal de solution de peroxyde d’hydrogène stabilisé à 30% fournie dans le kit.
    NOTE: Préparer la solution immédiatement avant utilisation et la maintenir à température ambiante.
  14. Incuber pendant 30 min à RT dans un endroit sombre.
    REMARQUE: Évitez de placer la plaque à la lumière directe. N’aspirez pas la solution TMB car aucun lavage supplémentaire n’est nécessaire.
  15. Ajouter 50 μL de solution d’arrêt 1N H2SO4 pour arrêter la réaction colorimétrique. Tapotez doucement la plaque pour assurer un mélange complet.
  16. Déterminer immédiatement l’absorbance de chaque puits à l’aide d’un lecteur de microplaques réglé à 450 nm dans un spectromètre à plaques ELISA.
  17. Mesurer l’absorbance à l’aide d’un spectromètre à plaques ELISA en mode point final avec une faible secousse pendant 10 s.
  18. Faire la moyenne de la valeur d’absorbance de 450 nm des échantillons blancs étalons et la soustraire des autres valeurs de 450 nm des échantillons standard et inconnus.
  19. Utilisez la courbe étalon pour déterminer la concentration en lumicane de chaque échantillon inconnu.
  20. Pour le calcul de la concentration de lumicane, faire un graphique de régression linéaire en utilisant les valeurs d’absorbance sur l’axe des Y par rapport aux concentrations en pg/mL sur l’axe X de chaque courbe lumican standard.
    1. Obtenez l’équation de régression linéaire et la valeur r pour calculer la concentration en lumicane.
      REMARQUE : La concentration de lumican a été normalisée par rapport au mg de tissu extrait. Les résultats sont exprimés sous forme de valeurs de concentration relative normalisées de lumican en mg AM (ng/mL de lumican/mg de tissu AM).

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les résultats sont présentés sous forme de valeur moyenne ±écart-type (ET). Les tests t de Student et l’analyse de la variance (ANOVA) ont été effectués. Les valeurs de p < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un logiciel de statistiques (voir le tableau des matières).

La quantité totale de protéines dans le TEA a été influencée par le temps et les conditions d’entreposage. La conce...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette étude, la présence de lumican a été analysée dans le TEA et sa corrélation directe avec sa stabilité dans différentes conditions de stockage. Fait intéressant, lorsque la concentration totale de protéines dans la TEA a été quantifiée, la concentration de protéines a augmenté après le stockage. Les preuves suggèrent trois mécanismes qui pourraient modifier la concentration de protéines dans l’entreposage congelé : la dénaturation à froid, la concentration congelée de solutés et le déploiement partiel de la stru...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étude a été financée par le Programme de soutien aux projets de recherche et d’innovation technologique de l’Universidad Nacional Autonoma de Mexico (subvention n° PAPIIT IN203821) et le ministère de l’Éducation, de la Science, de la Technologie et de l’Innovation (subvention n° SECTEI 250/2019).

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 N H2SO4 stop solutionR& D SystemsDY994
100 &mu ; L micropipetteEppendorf
1000 &mu ; L micropipetteEppendorf
15 mm Boîte de PétriSymlaboratorios
18 G Aiguille (1,2 mm x 40 mm)BD Becton Dickinson  ;
tube de microcentrifugationEppendorfZ606340
seringue en plastique de 20 mLBD Becton Dickinson  ;
20 &mu ; L micropipetteEppendorf
20-200 &mu ; Micropipette LEppendorf
5 mLEppendorf30119401
96 puitsSARSTEDT821581
Feuille d’aluminiumN/AN/A
Membrane amniotiqueInstituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank100 mg
Solution saline équilibréeBausch + LombBSS-403802
BécherN/AN/A
BioRender  ;Conception des figurinesBioRender
Compact RockerBioRad970822DDMod. 5202SD-BIO
complet, sans EDTA, Inhibiteur de protéase
comprimés cocktail		Roche11 873 580 001Inhibiteur de protéase
Daiggner vortex Genie 2A.Daigger & Co. , INC22220A
Dispase IIGibco17105-041
Spectromètre à plaques ELISAThermo Labsystems& nbsp ;35401106
Congélateur
GraphPad Prism  ;GraphPad Software, Incversion 9analyse statistique et programme graphique
Humain lumican DuoSet Kit ELISAR& LeDY2846-05comprend un incubateur d’anticorps de capture de Lumican humain
.Forma Scientific  ;3326 S/N 36481-7002
Microscope à lumière inverséeOlympus  ;6A13921pour confirmer la désépithélialisation Mod.CK2
Hotte à flux laminaireForma Scientific  ;14753-567Mod.1184
Azote liquideN/AN/A
MortierN/AN/A
PIPETTE MULTICANAUXEppendorf
Réservoir d’azoteThermo ScientificMod. Biocan 20
Essuie-toutN/AN/A
Saline tamponnée au phosphateR& D SystemsDY006
Pierce Modified Lowry Protein Assay KitThermo Scientific23240
Scelleusesde plaques R& D SystemsDY992
Diluant réactifR& D SystemsDY9951 % BSA dans PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 & mu ; m filtré
Centrifugeuse réfrigéréecenturion scientific Ltd  ;15877Mod. K2015R
Racleur de cellule de policier en caoutchoucNEST710001pour désépithélialisation mécanique
Couteau à scalpelBraunBB521N° 10 ou 21
Streptavidine-HRP 40 fois concentré  ;R& D Systemspart 893975
Substrat tétraméthylbenzidine (TMB) solutionR& D SystemsDY999
Pince à épiler dentéeInvent Germany6binox  ;
Eau ultrapurePISA
Wash bufferR& D SystemsWA1260,05 % Tween 20 en PBS, pH 7,2-7,4
305211302562 Microtube à centrifuger Multiscan de D Systems

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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