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Article de méthode

Établissement d’un modèle de rat silicotique par exposition de l’ensemble du corps à de la silice respirable

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DOI :

10.3791/64467

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28 octobre 2022

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1Hebei Key Laboratory for Organ Fibrosis Research, School of Public Health, North China University of Science and Technology

Dans cet article

Résumé

Cette étude décrit une technique permettant d’établir un modèle de silicose chez le rat avec l’inhalation de silice dans tout le corps dans une chambre d’inhalation. Les rats atteints de silicose ont pu imiter étroitement le processus pathologique de la silicose humaine d’une manière simple, rentable et avec une bonne répétabilité.

Résumé

La principale cause de silicose est l’inhalation de silice dans l’environnement professionnel. Malgré certaines différences anatomiques et physiologiques, les modèles de rongeurs continuent d’être un outil essentiel pour étudier la silicose humaine. Pour la silicose, le processus pathologique classique doit être inductible par l’inhalation de particules de quartz fraîchement générées, ce qui signifie induire spécifiquement une maladie professionnelle humaine. Cette étude a décrit une technique permettant d’établir et d’imiter efficacement le processus d’évolution dynamique pathologique de la silicose. De plus, la technique avait une bonne répétabilité sans intervention chirurgicale. Le système d’exposition par inhalation a été fabriqué, validé et utilisé pour des études toxicologiques sur l’inhalation de particules respirables. Les composants critiques étaient les suivants : (1) générateur de poudre de SiO2 sec en vrac réglé avec un régulateur de débit d’air ; (2) chambre d’exposition par inhalation corps entier de 0,3 m3 pouvant accueillir jusqu’à 3 rats adultes ; (3) un système de surveillance et de contrôle pour réguler la concentration d’oxygène, la température, l’humidité et la pression en temps réel ; et (4) une barrière et un système d’élimination des déchets pour protéger les techniciens de laboratoire et l’environnement. En résumé, le présent protocole signale l’inhalation par l’ensemble du corps, et la chambre d’inhalation a créé un modèle silicotique de rat fiable, raisonnable et reproductible avec une faible mortalité, moins de blessures et plus de protection.

Introduction

La silicose, qui est causée par l’inhalation de silice, est la maladie professionnelle la plus grave en Chine, représentant plus de 80 % du nombre total de déclarations de maladies professionnelles chaque année1. L’étiologie de la silicose est claire, et elle peut être prévenue et contrôlée, mais aucune méthode de traitement efficace n’est disponible2. De nombreux médicaments se sont avérés efficaces dans les études fondamentales, mais ils ont des effets cliniques imprécis 3,4. Par conséquent, les mécanismes pathologiques et physiologiques de la silicose doivent encore être explorés.

De nombreuses études ont utilisé une perfusion unique de silice dans la trachée de rats ou de souris pour étudier la pathogenèse de la silicose 5,6. Bien que ces modèles silicotiques de rongeurs aient pu être obtenus en peu de temps7, ces méthodes présentaient encore des défis, tels que des traumatismes chez les animaux et une mortalité élevée. Certaines études ont impliqué l’instillation de silice stockée dans les poumons pour induire une réaction pulmonaire non spécifique, mais n’ont pas mentionné de nodules silicotiques chez la souris8. De plus, en dehors de la silicose aiguë, l’exposition chronique à la silice en milieu de travail a induit une inflammation pulmonaire significativement plus faible et a élevé les niveaux de marqueurs anti-apoptotiques, plutôt que de marqueurs pro-apoptotiques, dans les poumons9. Par conséquent, un modèle animal fiable, raisonnable et reproductible est nécessaire pour explorer plus en détail la pathogenèse de la silicose.

La présente étude décrit une méthode permettant d’imiter le processus pathologique des patients atteints de silicose par inhalation de silice par l’intermédiaire de particules transmises par l’air dans tout le corps dans une chambre d’inhalation, composée d’un générateur de silice administré par air, d’une chambre pour tout le corps et d’un système d’élimination des déchets. Cette méthode est simple, facile à utiliser et imite efficacement le processus d’évolution dynamique pathologique de la silicose. De plus, de nombreux mécanismes possibles et la pathogenèse de la silicose sont identifiés à l’aide de cette méthode 10,11,12. On s’attend à ce que le protocole proposé contribue à d’autres recherches dans le domaine connexe de la recherche sur la silicose.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément au Guide des soins et de l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health des États-Unis et approuvées par le Comité d’éthique de l’Université des sciences et technologies de Chine du Nord (code de protocole LX2019033 et 2019-3-3 d’approbation). Des rats Wistar mâles, âgés de 3 semaines, ont été utilisés pour la présente étude. Tous les rats ont été gardés dans des cages statiques avec des copeaux de bois. Les animaux ont été maintenus dans un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h, et ont reçu de la nourriture et de l’eau ad libitum. Des expériences de suivi ont été menées après 1 semaine d’alimentation adaptative.

1. Préparation des animaux

  1. À leur arrivée, logez tous les rats dans une pièce exempte d’agents pathogènes (FPS).
  2. Divisez au hasard les rats sains en deux groupes (n = 10) : les rats témoins inhalant de l’air pur et les rats atteints de silicose inhalant de la silice.

2. Préparation de la silice

ATTENTION : La poussière de silice inhalée par le corps humain peut endommager les poumons. Par conséquent, les personnes doivent porter une combinaison, des gants médicaux et des masques de protection (N95) pendant les opérations.

  1. Broyez les particules de silice (voir tableau des matériaux) avec un mortier d’agate pendant 1,5 h avant chaque exposition. En effet, le quartz fraîchement fracturé produit de plus grandes quantités d’espèces actives de l’oxygène que le quartz13 vieilli, et la silice d’un diamètre de 1 à 5 μm est la plus pathogène.
  2. Peser la silice (30 g) à l’aide d’une balance électronique après le broyage, la placer dans un récipient en verre et la faire cuire à 180 °C pendant 6 h dans un séchoir à soufflage d’air électrique (voir tableau des matériaux) pour éliminer les agents pathogènes de la surface des particules de silice.

3. Exposition de la silice aux rats

  1. Connectez l’injection et les systèmes de générateur disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux) et placez la silice (30 g) dans le générateur. Vérifiez si le tuyau de connexion est normal, si le cordon d’alimentation est connecté et si l’alimentation est normale.
    1. Vérifiez manuellement le niveau d’eau de la tour de pulvérisation et de l’humidificateur de l’appareil de traitement des gaz résiduaires (voir tableau des matériaux) et ajoutez de l’eau si elle est insuffisante (pas jusqu’à la ligne standard).
    2. Ajoutez de l’eau du robinet dans la tour de pulvérisation du dispositif de traitement des gaz résiduaires et de l’eau distillée dans l’humidificateur (Figure 1).
  2. Allumez le dispositif d’évacuation des gaz d’échappement (voir le tableau des matériaux) et l’interrupteur de source d’air pour confirmer si l’intérieur de l’armoire de blindage est en état de pression négative.
    1. Vérifiez que les vannes de mélange de liquide, de mélange de poudre, de régulation de débit de gaz pur et de décharge d’eaux usées sous la chambre d’inhalation sont fermées.
  3. Placez un total de 10 rats dans la chambre d’inhalation (voir le tableau des matériaux) et fermez le compartiment d’inhalation et les portes grillagées de l’armoire.
  4. Réglez les paramètres expérimentaux suivants sur le tableau de bord ou dans l’ordinateur : pression de l’armoire : -50 à -30 Pa ; concentration en oxygène : 21 % ; température de l’armoire : 26-30 °C ; humidité : 30%-70% ; taux d’entrée de poussière : 2,0-2,5 mL/min ; et concentration de poussière dans l’armoire : 60 ± 5 mg/m3.
    REMARQUE : Observez les données expérimentales et l’état de l’équipement en permanence pendant l’expérience. L’alarme de défaillance de l’équipement a entraîné un traitement rapide.
    1. Exposez chaque animal à la silice en continu pendant 3 h par jour, 5 jours par semaine, et laissez les animaux du groupe témoin inhaler de l’air pur.
  5. À la fin de l’expérience, fermez la vanne de régulation du débit de gaz mixte et ouvrez la vanne de débit de gaz pur. Injecter le gaz pur en continu dans la chambre d’inhalation.
    NOTA : Dans la présente étude, le débit de gaz pur (7,0-7,5 m3/h) a été injecté pendant au moins 20 min jusqu’à ce que le gaz toxique dans la chambre d’inhalation soit complètement remplacé.
    1. Fermez la vanne de débit d’air pur, ouvrez la porte, sortez les rats et renvoyez-les dans la pièce exempte d’agents pathogènes.
  6. Retirez le râtelier à rats et les composants du tuyau de dérivation dans l’ordre et placez-les dans l’évier pour le nettoyage. Après le rinçage, fermez la vanne de nettoyage automatique et ouvrez la trappe.
    1. Essuyez la paroi intérieure avec un chiffon propre ou allumez le gaz pur pour sécher le réservoir. Enfin, effectuez la désinfection. Après avoir nettoyé et désinfecté avec de l’éthanol à 75 %, fermez la porte d’échappement et, dès que possible, ouvrez légèrement la porte de la cabine d’inhalation pour évaporer l’humidité, afin que l’intérieur de la cabine d’inhalation reste sec.
  7. Vérifier la concentration de silice dans l’armoire à l’aide d’un échantillonneur atmosphérique complet en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux) deux fois par semaine pour s’assurer de la stabilité de la concentration de silice pendant l’expérience. Calibrer l’échantillonneur atmosphérique avant l’échantillonnage.
    1. Utilisez une balance analytique numérique à plateau unique pour la détermination gravimétrique. La concentration de silice calculée était de 65 mg/m3 (figure 1 et tableau 1).
      REMARQUE : Peser le papier filtre avant et après l’absorption de la silice. La concentration de silice a été calculée à l’aide de la formulesuivante 12 :
      figure-protocol-1
      où W2 = poids du papier filtre après échantillonnage, W1 = poids du papier filtre avant échantillonnage, et V = volume d’air.

4. Acquisition et fixation des tissus pulmonaires

  1. Euthanasier les rats par injection intrapéritonéale de pentobarbital (100 mg/kg de poids corporel) et de lidocaïne (4 mg/kg de poids corporel). Évaluez la mort par la perte du rythme cardiaque14.
  2. À la fin de l’expérience, fixez le poumon inférieur droit, les reins, le foie, la rate et l’os avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 24 h, incorporez-les dans de la paraffine et coupez-les en sections de 5 μm 7,15.

5. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)

  1. Déparaffinez les sections de paraffine dans du xylol (voir le tableau des matériaux) deux fois pendant 10 minutes toutes les16 et réhydratez-les dans de l’éthanol à 100 %, de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 90 %, de l’éthanol à 80 %, de l’éthanol à 70 % et de l’eau distillée pendant 3 minutes chacune.
  2. Teindre les sections avec de l’hématoxyline (voir le tableau des matériaux) pendant 5 min, puis laver les sections à l’eau10.
  3. Placez les sections dans de l’alcool chlorhydrique à 2%, puis dans de l’eau distillée jusqu’à ce que la couleur devienne bleue.
  4. Colorez les sections avec de l’éosine pendant 1 min, déshydratez-les avec de l’éthanol à 95%, rendez-les transparentes avec du xylène, scellez-les avec de la gomme neutre et observez-les au microscope optique12.

6. Coloration immunohistochimique

  1. Lavez régulièrement les sections de paraffine avec de l’eau.
  2. Exposer les antigènes à haute pression (60 kPa) et à haute température (100 °C) pendant 80 s puis bloquer avec un bloqueur de peroxydase endogène (3%) pendant 15 min pour éliminer les peroxydases endogènes7.
  3. Incuber les échantillons avec des anticorps dirigés contre CD68 (dilution 1 :200 - ajouter 4 μL de CD68 à 396 μL de diluant d’anticorps ; voir le tableau des matériaux) à 4 °C pendant la nuit.
  4. Incuber les échantillons avec un anticorps secondaire (polymère IgG anti-souris conjugué à la chèvre et à la souris ; voir tableau des matériaux) à 37 °C pendant 30 minutes, puis laver les échantillons avec 1x PBS.
  5. Visualisez l’immunoréactivité avec la 3,3-diaminobenzidine (DAB ; voir le tableau des matériaux). Après avoir appliqué le DAB sur le tissu, observez la coloration du tissu au microscope optique10.
    REMARQUE : Le temps de coloration variait de quelques secondes à quelques minutes selon le temps de coloration du tissu. La procédure de coloration a été interrompue en plaçant les sections dans l’eau. Dans cette étude, la coloration brune du tissu représentait l’expression positive de CD68. Tous les anticorps ont été dilués dans 1x PBS.

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Résultats

À l’aide de la méthode proposée, certains mécanismes potentiels et la pathogenèse de la silicose ont été explorés chez le rat. Le schéma de la chambre d’inhalation est illustré à la figure 1. La chambre se composait d’un générateur de silice à air comprimé, d’une chambre pour tout le corps et d’un système d’élimination des déchets, comme décrit précédemment17. Les fonctions pulmonaires, les niveaux de facteurs inflammatoires dans le sérum et le poumon, le dépôt de col...

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Discussion

En tant que principale cause de silicose, la silice joue un rôle décisif dans le moulage. Les particules de silice inhalées par les patients atteints de pneumoconiose sont des particules de silice fraîches et libres produites par découpe mécanique. La silice peut générer des espèces réactives de l’oxygène soit directement sur les surfaces des particules fraîchement clivées, soit indirectement par son effet sur les macrophages25. Par conséquent, le broyage des particules de silice est d’une grande ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ces travaux ont été financés par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82003406), la Fondation des sciences naturelles de la province du Hebei (H2022209073) et le Projet scientifique et technologique du Département de l’éducation du Hebei (ZD2022127).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Détecteur d’air (échantillonneur atmosphérique compressif)Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD
Table  ; Aucune marque spécifique n’est recommandée.
Anticorps de CD68Abcamab201340
DABZSGB-BIOZLI-9018
Chauffage électrique séchoir à soufflage d’airShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD
Balance électroniqueOHRUS Machine d’enrobage
leica
Dispositif de décharge des gaz d’échappementHOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Systèmes de générateurs  ;HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Gants (gants de laboratoire minces)Le secco medical
Hematoxylin and eosinBaSO Diagnostics Inc.BA4025
HOPE MED 8050 appareil de contrôle de l’expositionHOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Chambre d’inhalationHOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Seringued’injection  ; Aucune marque spécifique n’est recommandée.
Microscope optique  ;olympus
Object slideshitai
PV-6000 (polymère IgG anti-souris de chèvre conjugué HRP)Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltds5631
Dioxyde de siliciumSigma-Aldrich
, machine à trancherleicaRM2255
Dispositif de traitement des gaz résiduairesHOPE Industry and Trade Co., Ltd.
Boîte humideCoopérative en plastique Produits Usine Xylol
Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD
anatomique

Références

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