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Article de méthode

Collecte d’exsudats de racines de luzerne pour étudier l’impact du phtalate de di(2-éthylhexyle) sur la production de métabolites

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DOI :

10.3791/64470

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2 juin 2023

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

Dans cet article

Résumé

La sécrétion d’exsudats racinaires est généralement une stratégie de désintoxication externe pour les plantes dans des conditions de stress. Ce protocole décrit comment évaluer l’impact des xénobiotiques sur la luzerne par analyse métabolomique non ciblée.

Résumé

Les exsudats racinaires sont les principaux moyens de communication de l’information et de transfert d’énergie entre les racines des plantes et le milieu environnant. Le changement dans la sécrétion des exsudats racinaires est généralement une stratégie de désintoxication externe pour les plantes dans des conditions de stress. Ce protocole vise à introduire des lignes directrices générales pour la collecte d’exsudats de racines de luzerne afin d’étudier l’impact du phtalate de di(2-éthylhexyle) (DEHP) sur la production de métabolites. Tout d’abord, les semis de luzerne sont cultivés sous stress DEHP dans une expérience de culture hydroponique. Deuxièmement, les plantes sont transférées dans des tubes de centrifugation contenant 50 mL d’eau ultrapure stérilisée pendant 6 h pour recueillir les exsudats racinaires. Les solutions sont ensuite lyophilisées dans un lyophilisateur sous vide. Les échantillons congelés sont extraits et dérivatisés avec le réactif bis(triméthylsilyl)) trifluoroacétamide (BSTFA). Par la suite, les extraits dérivatisés sont mesurés à l’aide d’un système de chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse à temps de vol (GC-TOF-MS). Les données sur les métabolites acquis sont ensuite analysées selon des méthodes bioinformatiques. Les métabolites différentiels et les voies métaboliques significativement modifiées devraient être explorés en profondeur pour révéler l’impact du DEHP sur la luzerne compte tenu des exsudats racinaires.

Introduction

Le phtalate de di(2-éthylhexyle) (DEHP) est un composé chimique synthétique largement utilisé dans divers plastiques et polymères comme plastifiant pour améliorer leur plasticité et leur résistance. Au cours des dernières années, un nombre croissant d’études ont suggéré que le DEHP est un perturbateur endocrinien et a des effets néfastes sur les systèmes respiratoire, nerveux et reproducteur des humains et des autres animaux 1,2,3. Compte tenu de son risque pour la santé, l’Agence de protection de l’environnement des États-Unis, l’Union européenne et le Centre de surveillance environnementale de Chine ont tous classé le DEHP dans la liste des polluants prioritaires. Le sol a été considéré comme un puits important de DEHP dans l’environnement, en raison de l’application de paillage plastique et d’engrais organiques, de l’irrigation avec des eaux usées et de l’application de bouesagricoles 4. Comme prévu, le DEHP a été détecté de manière omniprésente dans les sols des terres agricoles, dont la teneur atteint même jusqu’à milligrammes par kilogramme de sol séché dans certaines régions de Chine 5,6. Le DEHP peut pénétrer dans les plantes principalement par les racines et subir une bioamplification à différents niveaux trophiques dans les écosystèmes du sol7. Par conséquent, au cours des dernières décennies, des préoccupations importantes ont été soulevées au sujet du stress induit par le DEHP dans les usines.

Les plantes sont généralement vulnérables à l’exposition au DEHP. Il a été observé que le stress du DEHP exerce un effet néfaste sur la germination des graines et le métabolisme normal, inhibant ainsi la croissance et le développement des plantes 8,9. Par exemple, le DEHP peut induire des dommages oxydatifs aux cellules mésophylles, diminuer la teneur en chlorophylle et en osmolytes, et élever les activités enzymatiques antioxydantes, entraînant éventuellement une baisse du rendement et de la qualité des plantes comestibles10,11. Cependant, la plupart des études antérieures sur la réponse des plantes au stress du DEHP se sont concentrées sur le stress oxydatif et les caractéristiques physiologiques et biochimiques. Les mécanismes correspondants associés au métabolisme des plantes sont moins étudiés. Les exsudats racinaires sont un terme générique décrivant les composés que les racines des plantes sécrètent et libèrent dans l’environnement. Ils ont été considérés comme les milieux d’interaction entre les plantes et le sol de la rhizosphère, jouant un rôle important dans le soutien de la croissance et du développementdes plantes 12. Il est bien connu que les exsudats racinaires représentent environ 30% à 40% de tout le carbone photosynthétique13. Dans les milieux pollués, les exsudats racinaires sont impliqués dans l’amélioration de la tolérance des plantes au stress des polluants par métabolisme ou exclusion externe14. En conséquence, une compréhension approfondie de la réponse des exsudats racinaires des plantes au stress de pollution peut aider à révéler les mécanismes sous-jacents associés à la biochimie cellulaire et aux phénomènes biologiques15.

La technologie métabolomique fournit une stratégie efficace pour mesurer un grand nombre de métabolites de petites molécules simultanément dans les cellules 16,17, les tissus18, et même les exsudats d’organismes 19, y compris les sucres, les acides organiques, les acides aminés et les lipides. Par rapport aux méthodes d’analyse chimique traditionnelles ou classiques, l’approche métabolomique augmente considérablement le nombre de métabolites pouvant être détectés20, ce qui peut aider à identifier les métabolites de manière plus débitée et à identifier les voies métaboliques clés. La métabolomique a été largement utilisée dans le domaine de la recherche sur la réponse biologique dans les environnements de stress, tels que les métaux lourds21, les polluants émergents22 et les nanoparticules19. La plupart de ces études sur les plantes se sont concentrées sur les changements métaboliques dans les tissus végétaux intérieurs, alors que peu ont été rapportées sur la réponse des exsudats racinaires au stress environnemental. Par conséquent, le but de cette étude est d’introduire des lignes directrices générales pour la collecte d’exsudats de racines de luzerne afin d’étudier l’impact du DEHP sur la production de métabolites. Les résultats fourniront une orientation méthodologique pour l’étude de suivi de la métabolomique végétale par le DEHP.

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Protocole

L’objectif de ce protocole est de fournir un pipeline général, d’une expérience de culture hydroponique à l’analyse métabolomique, quantifiant l’effet du DEHP sur les exsudats de racines de luzerne.

1. Expérience de culture hydroponique

REMARQUE : Ce protocole présente un exemple d’expérience de culture hydroponique de luzerne conçue pour obtenir des semis de luzerne (Medicago sativa) sous le stress de différentes concentrations de DEHP. Trois traitements ont été mis en place : le témoin sans aucun ajout, et la solution nutritive enrichie de 1 mg kg-1 et 10 mg kg-1 de di(DEHP. Les concentrations de DEHP ont été fixées en fonction de la teneur réelle en DEHP dans le sol23. Chaque traitement a eu six répétitions.

  1. Stériliser les graines de luzerne avec de l’hypochlorite de sodium à 0,1 % pendant 10 min et de l’alcool éthylique à 75 % pendant 30 min.
    1. Rincer les graines stérilisées plusieurs fois avec de l’eau distillée, puis faire germer sur du papier filtre humide dans une boîte de Petri stérile à 30 °C dans l’obscurité.
  2. Transférer 20 graines uniformes, germées et dodues sur un panier de greffe dans un flacon de culture rempli d’une solution nutritive, composée de (en μM) : Ca(NO 3)2,3 500; NH4H2PO4, 1 000; KNO3, 6 000; MgSO4, 2 000; Na2acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 75; H3 BO3, 46; MnSO4, 9.1; ZnSO4, 0,8; CuSO4, 0,3; et (NH4 )6Mo7O24, 0,02. Ajuster le pH de la solution à 7,0 en utilisant 0,1 M KOH. Renouvelez toutes les solutions chaque semaine.
  3. Placer toutes les bouteilles de culture dans une chambre de croissance contrôlée d’une intensité lumineuse de 150-180 μmol m-2 s-1 avec une photopériode de 16 h chaque jour, à 27 °C et 20 °C représentant le jour (16 h) et la nuit (8 h), respectivement.
  4. Transférer 15 plantules de luzerne uniformes dans une nouvelle bouteille en verre pour des expériences de culture sous 1 mg kg-1 et 10 mg kg-1 DEHP stress après 2 semaines. Enveloppez les bouteilles en verre avec du papier d’aluminium et du parafilm pour prévenir la photolyse et la volatilisation du DEHP. Pour appliquer les mêmes conditions, enveloppez également les flacons de contrôle avec du papier d’aluminium et du parafilm. Complétez la solution nutritive quotidiennement pour maintenir le niveau de liquide.
  5. Placez et alternez les bouteilles au hasard tous les 2 jours pour assurer des conditions de croissance constantes pour les plants de luzerne.
  6. Après 7 jours de culture, retirez les plants de luzerne des bouteilles et lavez-les plusieurs fois à l’eau ultrapure, en vous préparant à la collecte des exsudats racinaires.

2. Collecte, extraction et analyse métabolomique des exsudats racinaires

REMARQUE: Ce protocole est divisé en trois parties: une expérience de collecte, une expérience d’extraction et une analyse métabolomique des exsudats racinaires. Le but de l’expérience de collecte est de transférer les métabolites sécrétés dans les échantillons de plantes au système de solution pour une extraction ultérieure.

  1. Expérience de collecte
    1. Transférer 10 plantules de luzerne uniformes dans des tubes centrifugeux remplis de 50 ml d’eau désionisée stérilisée. Immerger les racines dans l’eau pour recueillir les exsudats racinaires pendant 6 h; Gardez les tubes à la verticale. Effectuer au moins six répétitions pour chaque traitement.
    2. Enveloppez les tubes de centrifugation avec du papier d’aluminium pour protéger les racines de la lumière.
    3. Retirer les plantes et lyophiliser le liquide recueilli pour le profilage des métabolites.
  2. Expérience d’extraction
    1. Ajouter 1,8 mL de solution d’extraction (méthanol:H2O = 3:1, V/V) dans les tubes et le vortex pendant 30 s.
    2. Appliquez des ondes ultrasonores sur les tubes pendant 10 minutes dans un bain d’eau glacée.
    3. Centrifuger les échantillons à 4 °C et 11 000 × g pendant 15 min.
    4. Transférer délicatement 200 μL de surnageant dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Prélever 45 μL de surnageant de chaque échantillon et les mélanger dans des échantillons de contrôle de la qualité (CQ) à un volume final de 270 μL, qui est utilisé pour l’étalonnage des données de métabolome des échantillons.
    5. Lyophiliser les extraits dans un concentrateur sous vide. Poursuivre le séchage avec 5 μL de l’étalon interne (ribonucléol).
    6. Après évaporation dans un concentrateur sous vide, ajouter 30 μL de chlorhydrate de méthoxyamination (dissous dans de la pyridine à une concentration de 20 mg mL-1) dans les tubes et incuber les tubes à 80 °C pendant 30 min. Ensuite, ajouter 40 μL de réactif bis(triméthylsilyl)trifluoroacétamide (BSTFA) (avec 1% de triméthylchlorosilane [TMC], V/V) aux échantillons et placer les tubes à 70 °C pendant 1,5 h pour la dérivatisation.
    7. Refroidir les échantillons à température ambiante et ajouter 5 μL d’esters méthyliques d’acides gras (EMAG) (dans le chloroforme) aux échantillons de CQ.
  3. Analyse métabolomique
    1. Injecter 1,0 μL des extraits dérivatisés dans un système de chromatographie en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse à temps de vol (GC-TOF-MS) pour l’analyse de profilage métabolomique en utilisant un mode sans fractionnement.
      1. Utiliser une colonne capillaire (30 m x 250 μm x 0,25 μm) pour la séparation des exsudats racinaires, avec de l’hélium comme gaz porteur à un débit de 1,0 mL min-1. Réglez la température d’injection à 280 °C et maintenez la température de la conduite de transfert et la température de la source d’ions à 280 °C et 250 °C, respectivement.
      2. Pour la séparation, utilisez le programme de four suivant : 1 min de chauffage isotherme à 50 °C, une rampe de four de 10 °C/min-1 à 310 °C et un chauffage isotherme final à 310 °C pendant 8 min.
      3. Effectuer le mode de collision d’électrons avec -70 eV d’énergie. Obtenez des spectres de masse en utilisant le mode de surveillance à balayage complet avec une plage de balayage de masse de 50 à 500 m/z à une vitesse de 12,5 spectres/s.
    2. Filtrez les pics individuels pour éliminer le bruit. La valeur de l’écart est filtrée en fonction de l’intervalle interquartile.
    3. Remplissez les valeurs manquantes avec la moitié des valeurs minimales, standardisez et normalisez les données.
    4. Importez les données finales dans .csv format dans un logiciel d’analyse statistique pour l’analyse multivariée.
    5. Recherchez les métabolites dans la base de données Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (une ressource de base de données pour comprendre les fonctions et les utilités de haut niveau du système biologique) et classez les métabolites en différentes catégories, telles que les glucides, les acides, les lipides, les alcools et les amines. Utilisez un logiciel d’analyse statistique pour construire un graphique circulaire afin d’indiquer le pourcentage de chaque catégorie dans tous les exsudats racinaires.
    6. Appliquer des projections orthogonales supervisées à l’analyse de discrimination des structures latentes (OPLS-DA) pour démontrer les différences entre les groupes.
    7. Le criblage a significativement changé les métabolites en tant que métabolites différentiels en fonction d’une importance variable dans la projection (VIP) > 1 et p < 0,05 (test t de Student).
    8. Utilisez les données du métabolome pour construire des cartes thermiques avec le logiciel d’analyse statistique et utilisez les changements de plis sous différents traitements pour construire des histogrammes.
    9. Recherchez les métabolites différentiels dans la base de données KEGG et Pubchem et compilez les voies métaboliques contenant les métabolites différentiels. Effectuez une analyse d’enrichissement de chemin ou une analyse de topologie.

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Résultats

Dans cette expérience, des exsudats de racines de luzerne ont été recueillis, extraits et analysés selon les méthodes ci-dessus (figure 1). Trois groupes de traitement ont été mis en place : témoin, faible concentration de DEHP (1 mg L-1) et concentration élevée de DEHP (10 mg L-1).

Au total, 778 pics ont été détectés dans le chromatographe du témoin, dont 314 métabolites ont pu être identifiés en fonction des spectres de masse. Comme le mont...

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Discussion

Ce protocole fournit des conseils généraux sur la façon de recueillir et de mesurer les exsudats racinaires de luzerne sous stress DEHP, ainsi que sur la façon d’analyser les données du métabolome. Une attention particulière doit être accordée à certaines étapes critiques de ce protocole. Dans les expériences de culture hydroponique, les semis de luzerne ont été cultivés hydroponiquement dans des bouteilles en verre remplies de solutions nutritives avec différentes concentrations de DEHP. Les bouteilles en verre doivent ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer le travail rapporté dans cet article.

Remerciements

Ce travail a été soutenu conjointement par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (41877139), les grands projets de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (41991335), le Programme national clé de recherche et de développement de Chine (2016YFD0800204), la Fondation des sciences naturelles de la province du Jiangsu (n ° BK20161616), le Plan « 135 » et le Programme des frontières de l’Académie chinoise des sciences (ISSASIP1615).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AdonitolSIGMA&ge ; 99 %
Graines de luzerneAcadémie des sciences agricoles du Jiangsu (Nanjing, Chine)
Balance analytiqueSartoriusBSA124S-CW
BSTFAREGIS Technologiesavec 1 % TMCS, v/v
CentrifugeuseThermo Fisher ScientificHeraeus Fresco17
Colonne chromatographiqueAgilentDB-5MS (30 m & fois ; 250 &mu ; m & fois ; 0,25 &mu ; m)
Phtalate de di(2-éthylhexyle)Dr. Ehrenstorfer
FAMEsDr. Ehrenstorfer
Chromatographie en phase gazeuse (GC)Agilent7890A
Instrument de broyageShanghai Jingxin Technology Co., LtdJXFSTPRP-24
Spectromètre de masse(MS)LECOPEGASUS HT
MéthanolCNW TechnologiesHPLC
Chlorhydrate de méthoxyaminatioTCIAR
Tube de microcentrifugationEppendorfEppendorf Four de1,5 mL
Yiheng Scientific Instrument Co., LtdDHG-9023A
PyridineAdamasLogiciel
HPLC RLogiciel d’analyse statistique (enrichissement de la voie, topologie)
SIMCA16.0.2  ;logiciel d’analyse statistique (OPLS-DA, etc)
Congélateur à très basse températureThermo Fisher ScientificForma série 900
ÉchographieShenzhen Fangao Microelectronics Co., LtdYM-080S
Sécheur sous videTaicang Huamei usine d’instruments biochimiquesLNG-T98
Shanghai

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

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Collecte d’exsudats de racines de luzerne pour étudier l’impact du phtalate de di(2-éthylhexyle) sur la production de métabolites
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