Essai de criblage à haute teneur pour l’identification de composés modificateurs de la cytotoxicité cellulaire dépendants des anticorps

Résumé

Ce protocole présente une technique automatisée à haut débit basée sur l’image pour identifier les composés modulant la destruction des cellules cancéreuses du sein médiée par les cellules tueuses naturelles en présence d’un anticorps thérapeutique anti-HER-2.

Résumé

L’immunothérapie avec des anticorps spécifiques de l’antigène ou des inhibiteurs du point de contrôle immunitaire a révolutionné le traitement du cancer du sein. Les cellules cancéreuses du sein exprimant le récepteur du facteur de croissance épidermique HER2 peuvent être ciblées par l’anticorps anti-HER-2 trastuzumab. La cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) est un mécanisme important impliqué dans l’action antitumorale de HER-2. Le trastuzumab lié aux cellules cancéreuses peut être reconnu par les récepteurs Fc des cellules effectrices ADCC (p. ex. cellules tueuses naturelles (NK), macrophages et granulocytes), déclenchant l’activité cytotoxique de ces cellules immunitaires conduisant à la mort des cellules cancéreuses. Nous avons entrepris de développer un test basé sur l’image pour la quantification de l’ADCC afin d’identifier de nouveaux composés modulateurs de l’ADCC par criblage à haute teneur. Dans le test, les cellules cancéreuses du sein JIMT-1 surexprimant HER2 sont co-cultivées avec des cellules NK-92 en présence de trastuzumab, et la mort cellulaire cible est quantifiée par microscopie automatisée et analyse quantitative d’images. Les cellules cibles sont distinguées des cellules effectrices en fonction de leur fluorescence EGFP. Nous montrons comment les banques de composés peuvent être testées dans le test pour identifier les médicaments modulateurs de l’ADCC. À cette fin, une plaque d’essai de bibliothèque de composés a été mise en place en utilisant des produits chimiques fins sélectionnés au hasard sur les étagères du laboratoire. Trois composés déstabilisants des microtubules (colchicine, vincristine, podophyllotoxine) susceptibles d’interférer avec la migration et la dégranulation des cellules NK ont également été inclus dans la bibliothèque de tests. Le criblage d’essai a identifié les trois composés témoins positifs comme des résultats prouvant la pertinence de la méthode pour identifier les médicaments modifiant l’ADCC dans une bibliothèque chimique. Avec ce test, des criblages de bibliothèques de composés peuvent être effectués pour identifier les composés améliorant l’ADCC qui pourraient être utilisés comme agents thérapeutiques adjuvants pour le traitement des patients recevant des immunothérapies anticancéreuses. En outre, la méthode peut également être utilisée pour identifier les effets secondaires indésirables inhibiteurs de l’ADCC des médicaments thérapeutiques pris par les patients cancéreux pour différentes indications.

Introduction

L’immunothérapie avec des anticorps anticancéreux, des inhibiteurs du point de contrôle immunitaire ou des lymphocytes T exprimant des récepteurs antigéniques chimériques (CAR-T) représente une approche puissante du traitement du cancer ^1,2,3. Le trastuzumab est un anticorps monoclonal humanisé anti-HER-2 (récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain) utilisé pour traiter le cancer du sein à un stade précoce ou métastatique HER-2 positif, ainsi que le cancer gastrique métastatique HER-2 positif ^4,5,6. Il agit principalement en inhibant l’effet stimulant la prolifération du facteur de croissance épidermique⁴. Il a été rapporté, cependant, que le trastuzumab déclenche efficacement la mort des cellules cancéreuses même si les cellules cancéreuses ont perdu leur réactivité à la stimulation HER-2⁷. Cet effet paradoxal de l’anticorps est dû à la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC)⁷. L’ADCC peut être médiée par des cellules tueuses naturelles (NK), des granulocytes et des macrophages collectivement connus sous le nom de cellules effectrices de l’ADCC ^8,9. Si un anticorps, tel que le trastuzumab, se lie aux cellules tumorales, ces cellules effectrices utilisent leurs récepteurs Fc pour se lier à la région constante (Fc) de l’anticorps. L’anticorps relie les cellules tumorales et les cellules effectrices porteuses du récepteur Fc, déclenchant la libération de leurs médiateurs cytotoxiques¹⁰. Les cellules tueuses naturelles libèrent la cargaison cytotoxique de leurs granules contenant de la perforine pour générer des pores dans la membrane cellulaire cible et du granzyme (déclenchant des voies de signalisation de la mort cellulaire) dans la synapse immunitaire conduisant à l’apoptose des cellules cancéreuses (voir Figure 1).

Figure 1 : Interactions entre l’effecteur et la cellule cible dans l’ADCC. Le récepteur Fcγ de surface cellulaire de la cellule NK effectrice reconnaît la région Fc de l’anticorps anti-HER2 trastuzumab spécifique de la molécule HER2 exprimée à la surface de la cellule tumorale. Ainsi, la synapse dite immunologique est établie entre les deux cellules, induisant l’exocytose dirigée des granules cytotoxiques de la cellule effectrice. Les molécules de perforine et de granzyme libérées finissent par entraîner l’apoptose de la cellule cible. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Plusieurs tests ont déjà été développés pour quantifier la cytotoxicité, y compris l’ADCC. L’étalon-or est la méthode de libération de chrome radioactif, où les cellules cibles sont marquées avec un isotope radioactif ⁵¹Cr, et l’ADCC est quantifié en mesurant la radioactivité du surnageant des cellules cibles lysées¹¹. En raison des problèmes évidents dus à la manipulation, au stockage et à l’élimination strictement réglementés des pharmacons et des déchets radioactifs, cette méthode est devenue de moins en moins populaire parmi les scientifiques de la vie. En outre, il ne se prête pas non plus aux applications à haut débit. La mesure de l’activité des enzymes (p. ex. lactate-déshydrogénase) libérées par les cellules cibles tuées peut fournir une alternative non radioactive au test ⁵¹Cr¹². Ces essais, cependant, ne font pas la distinction entre les morts cellulaires cibles et effectrices. La détection d’impédance électrique de substrat cellulaire (ECIS) s’est avérée appropriée pour la quantification de l’ADCC¹³, mais l’équipement ECIS n’est pas disponible dans la plupart des laboratoires et la technique n’est pas compatible avec les applications / criblage à haut débit. Les cellules marquées par fluorescence représentent une alternative populaire dans de nombreux tests de biologie cellulaire et sont souvent utilisées dans la cytométrie en flux ou les applications basées sur des lecteurs de plaques^14,15,16. Cependant, ces tests contiennent souvent des étapes de lavage ou sont autrement incompatibles avec les applications à haut débit (par exemple, les techniques basées sur la cytométrie en flux). Certains tests de cytotoxicité populaires, qui en théorie devraient convenir à la quantification de l’ADCC, ne parviennent pas à déterminer de manière fiable l’efficacité de l’ADCC¹³. Récemment, avec la diffusion de la microscopie confocale fluorescente, les tests à haute teneur basés sur l’image sont devenus de plus en plus populaires dans divers domaines des sciences de la vie¹⁷. D’une part, les équipements d’imagerie cellulaire sont maintenant assez omniprésents, tandis que, d’autre part, des paramètres morphologiques pratiquement infinis peuvent être recueillis à partir des images acquises. Par conséquent, nous avons entrepris de développer un test ADCC compatible avec le criblage à haute teneur et de démontrer son adéquation au criblage par bibliothèque de composés.

Ici, nous présentons un test ADCC basé sur l’image et démontrons comment ce test peut être utilisé pour le criblage à haute teneur (HCS) afin d’identifier les composés modulateurs ADCC. Le modèle est basé sur des cellules cibles du carcinome du sein JIMT-1, des cellules effectrices CD16.176V.NK-92 et l’anticorps monoclonal humanisé anti-HER2 trastuzumab. Avec cette méthode, il est possible d’identifier des médicaments qui peuvent améliorer l’action tumorale des cellules NK ou de mieux comprendre le mécanisme de l’ADCC médié par les cellules NK en identifiant de petites molécules interférant avec l’ADCC. Nous suggérons que les scientifiques de la vie visant à quantifier la cytotoxicité à médiation cellulaire en accordant une attention particulière à l’ADCC puissent bénéficier de l’utilisation de ce test soit pour la science de la découverte, soit pour le développement de médicaments. Ce test peut être une alternative si un laboratoire a accès à l’imagerie fluorescente et à l’analyse quantitative d’images et possède une certaine expérience en la matière.

Protocole

REMARQUE : Les étapes clés du flux de travail de l’essai sont présentées à la figure 2.

Figure 2 : Workflow de l’écran ADCC. Les cellules cibles JIMT-1-EGFP ensemencées dans des plaques HCS à 96 puits sont traitées avec des médicaments de la bibliothèque de composés. À leur tour, des cellules NK (effectrices) non colorées et du trastuzumab sont ajoutés, et la plaque est imagée à 0 point de temps et après 3 h d’incubation. L’évaluation de l’ADCC est basée sur l’évolution du nombre de cellules cibles viables (adhérentes à la surface). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Revêtement de la plaque HCS

1. Enduire les 96 plaques de criblage à haute teneur (CSH) de 50 μL/puits de milieu JIMT-1 (milieu DMEM/F-12 complété par 20 % de sérum fœtal bovin (FBS), 0,3 U/mL d’insuline (100 UI/mL, Humulin R et 1 % de pénicilline-streptomycine).
2. Placer la plaque dans un incubateur de CO₂ pendant 1 h.
   REMARQUE: Le revêtement est crucial pour fixer les cellules JIMT-1 à la surface en verre de la plaque.

2. Ensemencement des cellules JIMT-1 Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)

REMARQUE: Des cellules JIMT-1 exprimant l’EGFP ont été générées dans nos travaux précédents¹⁸, et les cellules ont été cultivées dans des flacons de culture tissulaire T25 dans des milieux JIMT-1 (voir composition à l’étape 1.1).

1. Lavez les cellules avec 2 mL de PBS stérile.
2. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA dans la fiole et remettre la fiole dans un incubateur de CO₂ pendant 10 min.
3. Après l’incubation, tapotez la fiole pour vérifier si les cellules JIMT-1 sont détachées.
4. Arrêtez la digestion avec 2 mL de milieu JIMT-1 et recueillez la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL.
5. Compter les cellules contenant 0,4 % de bleu de trypan (80 μL du colorant + 20 μL de la suspension cellulaire) dans une chambre de Bürker et ajuster le nombre de cellules à 133 000 cellules/mL.
6. Aspirer le milieu de revêtement de la plaque de 96 puits (étape 1.2).
7. Pipeter 75 μL de la suspension cellulaire à chaque puits des plaques HCS (voir le tableau des matériaux).
8. Laisser les cellules se fixer pendant une nuit d’incubation à 37 °C dans un incubateur de CO₂ .

3. Prétraitement des cellules JIMT-1 EGFP avec la bibliothèque de composés

1. Aspirer le milieu des cellules JIMT-1 et ajouter 50 μL/puits de milieu JIMT-1 frais dans les puits. Transférez la plaque au laboratoire de criblage à haut débit.
   REMARQUE: L’utilisation d’un robot de manipulation de liquides rend l’ajout de bibliothèques de composés plus efficace et reproductible.
2. Transférer les composés d’essai de la plaque de la bibliothèque de composés sur la plaque d’essai à l’aide d’un outil à goupille étalonné à un volume de 25 nL. Effectuez cette opération quatre fois. Quatre cycles de transfert donnent un volume final de 100 nL (et une concentration finale de 20 μM).
3. Entre chaque étape, lavez l’outil à broches, d’abord avec 50% de DMSO, puis avec 70% d’éthanol.
4. Incuber les plaques pendant 1 h dans un incubateur de CO₂ à 37 °C.

4. Démarrage du test ADCC en ajoutant les cellules effectrices

REMARQUE : Des cellules CD16.176V.NK92 (ci-après appelées cellules NK92) ont été cultivées dans du α-MEM complété par 20 % de FBS, 1 % de MEM-NEAA, 1 % de Na-pyruvate, 1 % de glutamine, 1 % de pénicilline-streptomycine et 100 UI/mL d’IL-2.

1. Compter les cellules NK92 avec du bleu de trypan (80 μL du colorant + 20 μL de la suspension cellulaire). Ajustez le nombre de cellules à 400 000 cellules/mL.
2. Centrifuger 4 mL de la suspension cellulaire à 150 x g pendant 3 min à température ambiante.
3. Préparer le milieu ADCC en ajoutant 20 μg/mL d’anticorps anti-HER2 (trastuzumab) au milieu JIMT-1.
4. Remettez en suspension la pastille de cellule NK dans un milieu ADCC de 5 mL.
5. Pipeter 20 000 cellules NK dans 50 μL de milieu ADCC vers les cellules JIMT-1 cibles. Le volume final est de 100 μL et la concentration finale de trastuzumab est de 10 μg/mL.
6. Placez la plaque d’analyse dans l’équipement d’analyse à haute teneur à l’aide d’un incubateur intégré réglé à 37 °C.

5. Imagerie

REMARQUE: Les plaques doivent être imagées à deux points temporels, d’abord, immédiatement après l’ajout des cellules effectrices aux cellules cibles et ensuite, 3 heures après l’ajout de cellules NK. Pour l’imagerie, l’analyseur à haute teneur et son logiciel ou des alternatives appropriées peuvent être utilisés (voir Tableau des matériaux).

1. Sélectionnez Type de plaque (96-well cell carrier ultra) dans la liste des plaques.
2. Sélectionnez l’autofocus à deux pics si le test est effectué en plaques.
3. Utilisez l’objectif 10x en mode non confocale.
4. Sélectionnez Binning 2 pour doubler le rapport signal/bruit.
5. Prenez des images en fond clair à 650-760 nm et des images fluorescentes des cellules JIMT-1 transduites par EGFP à des longueurs d’onde de 488 nm (excitation) et 500-550 nm (émission).
6. Sélectionnez le nombre de champs et le nombre de points temporels pour la création d’images.

6. Analyse d’images

REMARQUE: Pour analyser l’efficacité ADCC, les cellules JIMT-1 viables sont comptées. Les cellules cibles tuées par l’ADCC se détachent de la surface et s’éloignent du plan focal du microscope. Par conséquent, la différence entre le nombre de cellules viables au début et à la fin de la réaction ADCC correspond aux cellules cibles éliminées par l’ADCC. Pour montrer comment construire la séquence d’évaluation, un puits ADCC de contrôle est montré dans la vidéo.

1. Utilisez le module Rechercher des cellules pour détecter les régions de l’image qui correspondent aux cellules.
   REMARQUE: Chaque cellule est détectée comme une région sur l’image avec une intensité de fluorescence supérieure à son environnement.
2. Sélectionnez des cellules à l’aide de l’algorithme M intégré d’un diamètre minimal de 80 μm.
3. Définissez la sensibilité de fractionnement, qui répartit un objet volumineux en objets plus petits, sur 0,5.
4. Définissez le seuil commun (le niveau d’intensité de pixels le plus bas) sur 0.
5. Exclure la détection de la zone de fond avec une intensité de fluorescence EGFP élevée en deux étapes.
   1. Tout d’abord, utilisez la fonction Calculer les propriétés d’intensité pour déterminer l’intensité de fluorescence EGFP dans la région Cellules précédemment sélectionnée.
   2. Définissez les seuils d’intensité minimale et maximale à l’aide de l’option Sélectionner une population .

Résultats

Pour démontrer comment le test fonctionne dans la vie réelle, nous avons créé une bibliothèque de tests de 16 composés sélectionnés au hasard dans les étagères du laboratoire (Figure 3). En outre, le DMSO a également été inclus comme témoin négatif, et trois composés inhibiteurs de polymérisation des microtubules (colchicine, vincristine et podophyllotoxine) comme témoins positifs. Ces derniers devaient inhiber l’ADCC en interférant avec la migration des cellules NK vers les cellules cancére...

Discussion

La réaction de l’ADCC a été décrite il y a relativement longtemps. Les événements moléculaires clés du processus ont également été décrits¹⁹. Les méthodes de mesure de l’ADCC vont du test de libération de chrome radioactif de référence, des tests de libération d’enzymes cytoplasmiques à plusieurs tests de cytométrie en flux ou de microplaques basés sur la fluorescence²⁰. Cependant, une limitation commune de ces tests est qu’ils ne se prêtent pas aux applications à haut débi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5-fluorouracile	Applichem	A7686	dans la bibliothèque de composés
Cellule à 96 puits Carrier Ultra plate	PerkinElmer	LLC 6055302
Betulin	Sigma	B9757	dans la bibliothèque de composés
CD16.176V.NK92 cellules	Nankwest Inc.  ;
Cérulénine	ChemCruz	sc-396822	dans la bibliothèque de composés
Cisplatine	Santa Cruz Biotechnology	sc-200896	dans la bibliothèque de composés
Colchicine	Sigma	C9754	dans la bibliothèque de composés
Concanavalin-A	Calbiochem	234567	dans la bibliothèque
de composés Dexaméthasone	Sigma	D4902	dans bibliothèque de composés
DMEM/F-12 medium	Sigma	D8437	dans JIMT-1 EGFP medium
DMSO	Sigma	D2650	dans la bibliothèque de composés
Etoposide	Sigma	E1383	E1383
Sérum de veau fœtal (FBS)	Biosera	FB-1090/500	JIMT-1 EGFP et NK medium
Fisetin	Sigma	F4043	dans la bibliothèque
de composésRobot de manipulation de liquides Freedom EVO	TECAN
Gallotannin	Fluka Chemical Corp.	16201	dans la bibliothèque de composés
Glutamine	Gibco	35 050&ndash ; 061	dans le
logiciel NK medium Harmony  ;	PerkinElmer
Humanized anti-HER2 monoclonal anti-HER2 (Herzuma)	EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary	N/A
Humulin R (insuline)	Eli Lilly	HI0219	JIMT-1 EGFP medium
IL-2	Novartis Hungá ; ria Kft.	PHC0026	dans le milieu NK
Isatin	Sigma	114618	dans la bibliothèque de composés
MEM Acides aminés non essentiels (MEM-NEAA)	Gibco	11,140&ndash ; 050	en milieu NK
Na-pyruvate	Lonza	BE13-115E	en milieu NK
Naringénine	Sigma	N5893	en bibliothèque composée
NQDI-1	Sigma	SML0185	en bibliothèque composée
Opera Phenix Équipement d’analyse à haut contenu	PerkinElmer
Pénicilline&ndash ; streptomycine	Biosera	LM-A4118	JIMT-1 EGFP et NK milieu
Pentoxyfilline	Sigma	P1784	dans une banque de composés
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Lonza	BE17-517Q	pour laver les cellules
Podophyllotoxine	Sigma	P4405	dans une banque
Quercétine	Sigma	Q4951	dans une bibliothèque
de composésAcide tannique	Sigma	T8406	dans une banque de composés
Témozolomide	Sigma	T2577	dans une banque de composés
Bleu de trypan solution à 0,4 %	Sigma	T8154	pour le comptage cellulaire
Sulfate de vincristine	Sigma	V0400000	dans une bibliothèque de composés
;-MEM	Sigma	M8042	dans un milieu NK