Évaluation des effets des biotoxines sur les fonctions des cellules immunitaires chez le poisson-zèbre

Résumé

Ce protocole décrit des tests de cytométrie en flux qui permettent d’évaluer les effets de l’exposition aux toxines sur les fonctions endocytaires de différentes sous-populations de leucocytes de poisson-zèbre. L’utilisation d’inhibiteurs fonctionnels spécifiques dans le test permet de différencier les mécanismes endocytaires altérés.

Résumé

Diverses toxines biologiques peuvent être présentes à des niveaux nocifs dans l’environnement aquatique. Les cyanobactéries sont un groupe diversifié de micro-organismes procaryotes qui produisent des cyanotoxines dans le milieu aquatique. Ces biotoxines peuvent être des hépatotoxines, des dermatoxines ou des neurotoxines et peuvent affecter les poissons et les mammifères. À des niveaux élevés, ces composés sont mortels. À des niveaux non létaux, ils agissent insidieusement et affectent les fonctions des cellules immunitaires. Les biotoxines produites par les algues comprennent la microcystine et l’anatoxine A. Les animaux aquatiques peuvent également ingérer des matières contaminées par la neurotoxine botulique E (BoNT/E) produite par Clostridium botulinum, entraînant également la mort ou une diminution des fonctions immunitaires. Le poisson-zèbre peut être utilisé pour étudier comment les toxines affectent les fonctions des cellules immunitaires. Dans ces études, l’exposition aux toxines peut être effectuée in vivo ou in vitro. Des études in vivo exposent le poisson-zèbre à la toxine, puis les cellules sont isolées. Cette méthode démontre comment l’environnement tissulaire peut influencer la fonction leucocytaire. Les études in vitro isolent d’abord les cellules, puis les exposent à la toxine dans des puits de culture. Les leucocytes sont obtenus par extraction de moelle rénale, suivie d’une centrifugation à gradient de densité. La façon dont les leucocytes internalisent les agents pathogènes est déterminée par les mécanismes endocytaires. Les tests de phagocytose par cytométrie en flux montrent si les mécanismes endocytaires ont été altérés par l’exposition aux toxines. Il n’existe pas d’études utilisant des leucocytes isolés pour déterminer comment les toxines causent un dysfonctionnement immunitaire. Les procédures décrites dans cet article permettront aux laboratoires d’utiliser le poisson-zèbre pour étudier les mécanismes qui sont affectés lorsqu’une toxine environnementale diminue les fonctions endocytaires des cellules immunitaires.

Introduction

Il existe de nombreux types de biotoxines environnementales et d’agents immunosuppresseurs. Les proliférations d’algues contenant des toxines bactériennes se produisent dans les eaux intérieures et peuvent également se présenter sous forme de biofilms¹. Les cyanobactéries (algues bleu-vert) sont naturellement présentes dans tous les écosystèmes d’eau douce. Les proliférations de cyanobactéries ont considérablement augmenté dans les systèmes d’eau douce². À certains moments, les cyanobactéries peuvent produire des toxines nocives pour les animaux aquatiques et terrestres. Ces toxines peuvent affecter le foie, la peau et les muqueuses, et/ou le système nerveux. Deux composés produits par les cyanobactéries sont la microcystine et l’anatoxine A. La microcystine est un heptapeptide³ cyclique. L’anatoxine A est un alcaloïde⁴. La neurotoxine botulique E (BoNT/E) est une autre toxine présente dans les systèmes aquatiques. Il est produit par Clostridium botulinum et peut être ingéré par les animaux aquatiques⁵.

L’exposition aux toxines environnementales affecte les poissons et peut également affecter la santé animale et augmenter l’apparition de maladies⁶. Comprendre comment ces toxines affectent les cellules immunitaires est fondamental pour déterminer les risques associés à l’exposition à ces substances. Le poisson-zèbre est un excellent modèle pour étudier les effets des toxines environnementales sur les cellules immunitaires⁷. Le développement d’une méthode qui utilise la cytométrie en flux et les leucocytes du poisson-zèbre est très bénéfique. Les poissons-zèbres ont une pertinence physiologique pour les humains, et cette méthode peut être appliquée à un large éventail de domaines de recherche, de la toxicologie et de l’immunologie fondamentales à la découverte de médicaments et à la biologie du développement. Parce qu’il s’agit d’organismes aquatiques, le poisson-zèbre est particulièrement adapté à l’étude des effets des toxines environnementales d’origine hydrique⁷. L’utilisation du poisson-zèbre est moins coûteuse que celle d’autres modèles de vertébrés, et leur utilisation soulève moins de problèmes éthiques.

Les globules blancs, ou leucocytes, sont la première ligne de défense cellulaire contre les organismes pathogènes. L’endocytose est le processus par lequel une cellule absorbe ou internalise un liquide ou une particule externe à la cellule. Ceci est accompli par la cellule enfermant le composé dans une vésicule⁸. Les leucocytes utilisent ce processus comme première étape pour tuer les agents pathogènes et préparer une défense contre les maladies. La phagocytose est un type d’endocytose et a été l’une des premières méthodes utilisées pour étudier les effets des polluants environnementaux sur la santé des poissons⁹. Le laboratoire Petrie-Hanson a mis au point des méthodes utilisant les leucocytes du poisson-zèbre pour dépister les biotoxines afin de déterminer leur capacité potentielle à interférer avec les fonctions endocytaires et phagocytaires des leucocytes et à avoir un impact sur les défenses immunitaires. Les types d’endocytose inclus dans ces méthodes sont la pinocytose, la phagocytose, la phagocytose médiée par les récepteurs du calcium et la phagocytose médiée par les récepteurs du mannose. L’utilisation de méthodes de cytométrie en flux avec le poisson-zèbre a été décrite pour la première fois dans le laboratoire Petrie-Hanson⁹ et est couramment utilisée pour étudier les toxines et les agents pathogènes aquatiques. Le poisson-zèbre mutant Rag1^-/- n’a pas de cellules T et B¹⁰ et peut être utilisé pour étudier spécifiquement les mécanismes des cellules immunitaires innées.

La cytométrie en flux est basée sur le laser et peut être utilisée pour déterminer les propriétés physiques des cellules. La valeur de diffusion vers l’avant, ou FSC, est tracée sur l’axe des X et représente la taille de la cellule. La diffusion latérale, ou SSC, est tracée sur l’axe Y et représente la granularité cytoplasmique de la cellule. Le graphique résultant montre des populations de cellules ayant des caractéristiques physiques similaires regroupées, les différents types de cellules apparaissant à divers endroits sur un graphique de dispersion. Ces populations peuvent changer d’emplacement sur le nuage de points à mesure que les caractéristiques physiques des cellules changent⁹. L’utilisation de cette technique avec des leucocytes de poisson-zèbre permet aux chercheurs d’évaluer les changements dans les populations cellulaires en réponse à divers stimuli, y compris les toxines environnementales.

Le cytomètre en flux est multidimensionnel, et plusieurs types de fluorophores peuvent être utilisés dans l’évaluation pour caractériser davantage les cellules et leur activité. Dans les tests décrits dans ce protocole, l’endocytose est caractérisée par la mesure de la quantité de matière fluorescente qu’une cellule a internalisée. Il est possible de déterminer si et comment l’exposition aux toxines affecte les mécanismes endocytaires en comparant la capacité des cellules exposées aux toxines à absorber le matériau par rapport à la capacité des cellules non exposées aux toxines à l’aide de la cytométrie en flux. Les processus endocytaires qui peuvent être évalués de cette manière comprennent la pinocytose, l’endocytose médiée par les récepteurs et la phagocytose.

La pinocytose est l’absorption de composants solubles, et elle n’utilise pas de récepteurs cellulaires. L’absorption implique un réarrangement cytoplasmique par des microfilaments et des microtubules pour former de petites vacuoles. Le jaune de luciférase (LY) est un colorant fluorescent utilisé pour mesurer l’absorption de liquide par pinocytose non sélective¹¹. L’endocytose médiée par le récepteur implique l’absorption sélective de grosses molécules. Le dextran (DX) 40 marqué à la fluorescéine (FITC) peut être utilisé pour évaluer ce processus. La phagocytose est une forme d’endocytose qui consiste à ingérer des particules de plus de 0,5 micromètre. Ce processus est étudié par des procédures utilisant FITC-DX70 et FITC-Eschericia coli. Les DX40 et DX70 ont des poids moléculaires de 40 000 et 70 000, respectivement. FITC-E. coli est la souche de laboratoire standard d’E. coli liée à un fluor qui peut être mesurée par le cytomètre en flux. De nombreuses formes d’endocytose médiée par le récepteur nécessitent du calcium comme molécule de signalisation et pour le réarrangement cytosquelettique⁹. Un autre type d’endocytose médiée par les récepteurs est l’endocytose médiée par les récepteurs du mannose (MR). Les récepteurs du mannose sont des protéines transmembranaires qui reconnaissent les formes de mannane à la surface des cellules microbiennes⁹. Pour optimiser ces procédures, une courbe dose-réponse doit être créée avec chaque toxine afin d’établir les doses à utiliser. Une courbe de saturation doit être effectuée pour LY, FITC-DX40, FITC-DX70 et FITC-E. coli afin d’évaluer la concentration correcte à utiliser.

Les mécanismes utilisés par les leucocytes pour internaliser différentes particules peuvent varier. Pour suggérer quel composant du processus peut être affecté par l’exposition aux toxines, des inhibiteurs peuvent être ajoutés pour bloquer les mécanismes phagocytaires. La cytochalasine D (CCD) inhibera le mouvement des microtubules et donc la pinocytose. Le CCD n’influence pas l’endocytose médiée par le récepteur¹¹. L’EDTA bloque l’endocytose médiée par les récepteurs dépendants du calcium (Ca²⁺). Mannan est un ligand naturel pour le MR. Mannan est utilisé comme inhibiteur du récepteur du mannose pour évaluer si la phagocytose ou la pinocytose est médiée par le récepteur du mannose⁹.

Le but de ce protocole est de démontrer les procédures permettant de déterminer si l’exposition aux toxines a affecté la capacité des leucocytes phagocytaires à absorber les agents pathogènes. Ces protocoles peuvent également discerner si un mécanisme endocytaire spécifique est affecté. La réalisation de ces tests sur le cytomètre en flux permet une discrimination plus poussée en sélectionnant les populations de leucocytes en fonction de leur taille et de leur granularité cytoplasmique afin de déterminer si les sous-populations de leucocytes ont été affectées de manière différentielle. Cette méthode repose sur le gating électronique des populations cellulaires.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Mississippi (MSU-IACUC). Tous les poissons-zèbres utilisés dans cette étude ont été élevés à partir d’une colonie homozygote de poissons-zèbres mutants rag1^-/- précédemment établie dans l’écloserie exempte d’agents pathogènes spécifiques du College of Veterinary Medicine de l’Université d’État du Mississippi (MSU)¹⁰. Des poissons-zèbres de type sauvage ont également été multipliés dans cette écloserie. Dans ces études, l’exposition aux toxines peut être effectuée in vivo ou in vitro. Des études in vivo exposent le poisson-zèbre à la toxine, après quoi les leucocytes sont isolés, indiquant comment la toxine et le microenvironnement tissulaire peuvent interagir et influencer la fonction leucocytaire. Les études in vitro isolent les leucocytes, puis exposent les cellules à la toxine dans des puits de culture.

1. Préparation des réactifs et des solutions

1. Tampon de tri des cellules activées par fluorescence (FACS) : (solution saline équilibrée Hanks sans calcium ni magnésium (HBSS) + 0,05 % d’albumine sérique bovine (BSA)) (voir le tableau des matériaux). Préparez-le frais avant l’isolement cellulaire.
2. Milieux de culture tissulaire (MTC) : Utiliser le RPMI-1640 complété par du glutamax et 10 % de sérum fœtal bovin (voir le tableau des matériaux).
3. Cytochalasine D (CCD) : Préparez la solution mère en remettant en suspension le produit disponible dans le commerce (voir le tableau des matières) dans 1 mL d’éthanol absolu à 200 degrés. Préparez la solution de travail en ajoutant 20 μL de CCD stock à 980 μL de tampon FACS, pour obtenir la concentration finale de 2,5 μg/mL.
4. EDTA : La solution mère est de 1 mg/mL. Préparez la solution de travail en ajoutant 100 μL de la solution mère à 900 μL de tampon FACS, pour obtenir la concentration finale de 1 mM.
5. Mannan : Préparer une solution mère à 1 mg/mL (voir le tableau des matières). Ensuite, préparez la solution de travail en ajoutant 100 μL de la solution mère à 900 μL de tampon FACS, pour obtenir la concentration finale de 500 μg/mL.
6. Préparez séparément le Lucifer Yellow (10 μg/mL) (LY, un colorant fluorescent), le Dextran-40 (DX-40, 500 μg/mL) et le Dextran-70 (DX-70, 500 μg/mL) en préparant une solution de 1 mg/mL de chacun en remettant en suspension les réactifs disponibles dans le commerce (voir le Tableau des matières) dans de l’eau stérile.
7. Bactéries fluorescéine (FITC) : Cultiver Escherichia coli DH5α (voir le tableau des matériaux) en agitant dans un milieu Luria Bertani (LB) de 100 mL complété par 50 μg/mL de FITC pendant une nuit à 37 °C dans un environnement protégé de la lumière pour obtenir une densité optique (DO) de 0,8 à 540 nm.
   1. Laver les bactéries (3x) avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par centrifugation pendant 10 min à 1000 x g suivie d’un chauffage à 60 °C pendant 20 min. Laver 1 fois de plus, puis ajuster les concentrations bactériennes à OD₅₄₀ 0,8. Ce sera la solution standard.
   2. Préparez la solution de travail en diluant la solution mère à 1:100 (1 mL de solution mère : 99 mL de tampon FACS). Ajustez la concentration finale à 1,8 x 10⁸ cellules/mL.

2. Soins du poisson-zèbre

1. Maintenez le poisson-zèbre dans un système d’écoulement en un seul passage sur l’eau municipale déchlorée et donnez-lui de la farine de poisson riche en protéines et des artémias vivants à satiété.
2. À l’âge de 6 mois, retirez les poissons-zèbres mixtes de leurs aquariums et transportez-les au laboratoire de recherche pour être utilisés dans l’expérience. C’est le meilleur âge à utiliser pour l’isolement du nombre optimal de leucocytes de la moelle rénale⁹.

3. Isolement cellulaire

1. Euthanasier 10 poissons-zèbres dans de la tricaïne (~100 mL de sulfonate de méthane de tricaïne tamponné au phosphate de 4 mg/mL/litre d’eau de poisson) (voir le tableau des matériaux) en suivant les méthodes établies⁹.
2. Placez une crépine à cellules de 40 μm dans un tube à centrifuger conique de 50 mL.
3. Prélever les tissus de la moelle rénale⁹ et les placer dans un tube C avec 3 mL de milieu de culture tissulaire et homogénéiser le tissu à l’aide d’un dissociateur tissulaire. Il s’agit de la procédure privilégiée.
4. Vous pouvez également perturber les tissus avec l’extrémité en caoutchouc d’une seringue de 3 ml dans une crépine cellulaire. Une fois que le tissu est homogénéisé (ou perturbé), versez la suspension à travers une crépine cellulaire de 40 μm placée sur un tube conique de 50 mL.
5. Centrifuger la suspension filtrée à 500 x g pendant 5 min à 16 °C. Videz le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 3 mL de MTC. Répétez cette étape deux fois.
6. Disposez délicatement les cellules sur un milieu à gradient de densité filtré stérile de 3 ml (1,077 g/mL) à température ambiante.
7. Ensuite, centrifuger à 800 x g pendant 20 min à 16 °C. Assurez-vous que le frein est sur le réglage le plus bas, afin que les cellules ne soient pas remises en suspension lorsque la centrifugeuse s’arrête.
8. Retirez la couche leucosticole opaque de l’interface dans un tube à fond rond de 14 ml.
9. Laver les cellules en ajoutant 5 mL de TCM et en mélangeant avec une pipette Pasteur. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 16 °C.
10. Répétez l’étape, en jetant le surnageant et en remettant en suspension la pastille de cellule dans la MTC pour obtenir environ 1 x 10⁶ cellules/mL.

4. Essai de viabilité cellulaire

1. Pour surveiller la viabilité cellulaire, évaluez la mort cellulaire à l’aide de la coloration à l’iodure de propidium (PI).
   1. Ajouter de l’IP (200 μg/mL) à la concentration de 5 μL/mL de cellules à analyser. Lire sur la chaîne PE/Texas Red.
      REMARQUE : L’iodure de propidium se diffuse à travers les trous des membranes des cellules mortes, les colorant ainsi. La viabilité évaluée était de 85 % pour la présente étude.

5. Incubation de toxines

1. Aliquote 200 μL de cellules de la suspension cellulaire isolée dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 6 puits (3 puits pour le contrôle et 3 puits pour l’exposition aux toxines). Cela permet d’exécuter les réplicats en trois exemplaires.
2. Ajouter 2 mL de TCM dans chaque puits.
3. Ajoutez de la toxine (~2,5 μg/mL) dans les trois puits.
   REMARQUE : La concentration de toxine doit être optimisée avant de commencer l’expérience et dépendra de la toxine utilisée pour le test.
4. Incuber la plaque de culture tissulaire pendant le temps d’exposition souhaité. Le temps d’exposition souhaité doit être optimisé avant de commencer l’expérience et dépendra de la toxine utilisée pour le dosage. Dans la présente étude, le temps d’exposition était de ~1 h.
5. Après le temps d’exposition, placez la plaque de culture tissulaire sur de la glace pendant 10 min.
6. Pipetez les cellules de chaque puits vers le haut et vers le bas avec soin pour retirer toutes les cellules adhérentes de la plaque.
7. Retirer les cellules de la plaque dans un tube à centrifuger à fond rond de 14 ml.
8. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à 16 °C. Remettre les cellules en suspension dans 3 mL de tampon FACS. Répétez l’étape deux fois.
9. Remettez les cellules en suspension dans 1,5 mL de tampon FACS.
   REMARQUE : Pour les études in vivo , exposez le poisson-zèbre à la toxine (à une concentration similaire à celle mentionnée ci-dessus), puis isolez les cellules.

6. Test d’endocytose

1. Aliquote de 100 μL de cellules dans des tubes de cytométrie en flux de 5 mL. Étiquetez les tubes comme suit avec quatre tubes répétés de chaque puits : (1) LY, (2) DX40, (3) DX70, (4) FITC-E. coli.
2. Ajouter le colorant de fluorescence indiqué aux étapes 1.6 et 1.7 aux tubes appropriés : 50 μL de LY dans le tube (1), 50 μL de DX40 dans le tube (2) ; 50 μL DX70 vers tube (3) ; 50 μL de FITC-E. coli par tube (4).
3. Incuber pendant 1 h. Ajoutez 200 μL de tampon FACS dans chaque tube.
4. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 5 min à 16 °C. Videz le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 200 μL de tampon FACS. Répétez cette étape trois fois. Effectuez l’analyse cytométrique en flux.

7. Cytométrie en flux

1. Effectuer une cytométrie en flux pour visualiser les populations cellulaires et collecter des données. Voir Hohn et ^al.9 pour plus de détails.
2. Identifiez les populations cellulaires cibles dès la première étape. Utilisez la diffusion latérale (SSC) (généralement l’axe vertical) pour éliminer les débris et les petites cellules pycnotiques à l’extrême gauche et la diffusion vers l’avant (FSC) (généralement l’axe horizontal) pour éliminer les mêmes débris au bas du graphique.
3. Éliminez les lectures doublet (cellules comptées deux fois). Ceci est effectué à l’aide d’une porte à géométrie d’impulsion (FSC-H x FSC-A).
4. Déterminez le signal de fond. Exécutez uniquement le contrôle de fluorescence des cellules et un contrôle de fluorescence isotype pour chaque fluorochrome utilisé, afin d’identifier les niveaux de fluorescence de fond.
   REMARQUE : Chaque fluorochrome a son propre niveau unique de fluorescence de fond, influencé par l’autofluorescence cellulaire et la liaison non spécifique. Cela permet de faire la distinction entre les vrais signaux positifs et la fluorescence de fond. Lors de l’identification et de la régulation des populations cellulaires en fonction de la fluorescence, ces valeurs de contrôle sont soustraites du nombre d’événements positifs, et le nombre résultant est le nombre utilisé pour l’analyse.
5. Analysez les échantillons et identifiez les populations de cellules à contrôler. Utilisez FSC et SSC pour caractériser morphologiquement et identifier différentes populations cellulaires au sein d’un mélange de cellules.
   REMARQUE : Le FSC est principalement lié à la taille de la cellule. Les cellules plus grandes diffuseront plus de lumière vers l’avant, ce qui entraînera des valeurs FSC plus élevées, tandis que les cellules plus petites diffuseront moins de lumière et auront des valeurs FSC plus faibles. Différentes tailles de cellules se regroupent en grappes. Par exemple, les lymphocytes, étant plus petits, peuvent apparaître comme un groupe séparé avec des valeurs FSC inférieures à celles des granulocytes. La SSC est liée à la granularité, à la complexité et à la structure interne de la cellule. Les cellules avec une granularité cytoplasmique plus élevée auront des valeurs SSC plus élevées. Des cellules similaires se regrouperont. Par exemple, les neutrophiles ont des granules cytoplasmiques et se regroupent à une valeur SSC plus élevée que les lymphocytes.
6. Analysez tous les échantillons et, sur la base de FSC/SSC, appliquez des portes aux populations cellulaires pour une analyse plus approfondie. Les zones fermées sont appliquées en fonction de la densité cellulaire et des populations d’intérêt.
7. Tracez des zones fermées sur des histogrammes pour analyser l’intensité moyenne de fluorescence (MFI) de FITC dans chaque porte pour la fluorescence à 495 nm / 519 nm avec le laser bleu.
8. Exportez les nombres de cellules tels que déterminés par le logiciel pour exceller dans le programme d’analyse.
9. Analyser les données dans un progiciel statistique (voir la Table des matériaux).
10. Comparez l’IMF de chaque population de cellules témoins à l’IMF des populations cellulaires exposées à la toxine.

8. Effet de la toxine sur les mécanismes endocytaires et effets des inhibiteurs CCD, EDTA et mannane sur les mécanismes endocytaires

REMARQUE : Pour absorber des liquides ou des particules, le cytoplasme cellulaire se déplace activement. Ce mouvement nécessite de multiples éléments structurels et voies de signalisation. Les biotoxines peuvent affecter n’importe lequel de ces éléments ou voies. La comparaison des effets d’inhibiteurs caractérisés spécifiques peut être utilisée pour aider à discerner comment la biotoxine peut agir¹¹.

1. Effectuez les isolations de cellules comme décrit à l’étape 3.
2. Aliquote 100 μL de cellules dans des tubes de cytométrie en flux de 5 mL (avec quatre tubes répétés de chaque puits).
   REMARQUE : Étiquetez les tubes comme suit : (5) CCD + LY (le CCD inhibe la pinocytose en inhibant le réarrangement des microfilaments et des microtubules ; La LY est utilisée pour évaluer l’absorption de liquide par micropinocytose)⁹. (6) EDTA + DX40 (EDTA bloque la phagocytose et la micropinocytose médiées par le récepteur dépendant du Ca²⁺ ; mesure si l’absorption implique un mécanisme dépendant du calcium). (7) EDTA + DX70. (8) EDTA + FITC-E. coli. (9) Mannan + DX40 (le mannane inhibe l’absorption spécifique par le récepteur du mannose, mesurant l’endocytose dépendante de l’IRM⁹). (10) Mannan + DX70. (11) Mannan + FITC-E. coli.
3. Ajouter des inhibiteurs : 1 μL de CCD dans le tube (5) ; 10 μL d’EDTA dans les tubes (6-8) ; 100 μL de mannane par tubes (9-11). Suivez les concentrations mentionnées à l’étape 1. Incuber pendant 5 min.
4. Ajouter un fluorescent secondaire aux tubes appropriés : 50 μL de LY dans les tubes (1) et (5) ; 50 μL de DX40 dans le tube (2), (6) et (9) ; 50 μL de DX70 dans le tube (3), (7) et (10) ; 50 μL de FITC-E. coli dans le tube (4), (8) et (11). Incuber pendant 30 min.
5. Ajoutez 200 μL de tampon FACS dans chaque tube. Centrifugeuse à 400 x g à 16 °C pendant 5 min.
6. Videz le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 200 μL de tampon FACS. Répétez les étapes 8.5-8.6 deux fois.
7. Analysez les échantillons sur le cytomètre en flux en suivant l’étape 7.

Résultats

Les tests d’endocytose utilisent des leucocytes mixtes isolés à partir de gradients et contrôlés pour les phagocytes et les lymphocytes afin de déterminer si des mécanismes cellulaires spécifiques ont été modifiés par l’exposition à des toxines. Tout d’abord, les cellules sont contrôlées en fonction de leur taille et de leur granularité¹⁰. Les cellules mortes, fragmentées ou mourantes sont visualisées dans le coin inférieur gauche du nuage de points et sont éliminées, sans être analysées pour la phagocytose. La porte phagocytaire comprend les macrophages, les cellules Natural Killer (cellules NK) et les granulocytes, tandis que la porte lymphocytaire comprend les lymphocytes, les cellules B phagocytaires et les cellules cytotoxiques non spécifiques (NCC) (Figure 1).

La phagocytose est déterminée par l’absorption de particules marquées au FITC, comme le montre la lecture de la fluorescence à 495 nm / 519 nm avec le laser bleu. L’autofluorescence de fond et la fluorescence de liaison non spécifique sont éliminées en tenant compte de l’intensité moyenne de fluorescence (MFI) émise par les cellules de contrôle et le contrôle de l’isotype. Une courbe dose-réponse doit être effectuée pour chaque inhibiteur afin d’établir les concentrations à utiliser. Si les résultats de la cytométrie en flux des cellules exposées à la toxine testée sont les mêmes que ceux des cellules exposées à un inhibiteur, alors la toxine provoque un effet similaire et peut inhiber ce mécanisme endocytaire. Si les réponses de la toxine et de l’inhibiteur sont additives, cela suggère que la toxine peut inhiber l’endocytose par un mécanisme différent de celui de l’inhibiteur.

Des comparaisons sont faites entre les cellules non traitées et les cellules traitées avec la toxine testée (Figure 2), les cellules traitées avec la toxine ou l’inhibiteur (Figure 3A) et les cellules traitées avec l’inhibiteur seul (Figure 3B). Les résultats représentatifs montrent que les cellules traitées avec la microcystine étaient inhibées, de la même manière que les cellules traitées avec la CCD. Ces résultats démontrent que la microcystine inhibe l’absorption de liquide par micropinocytose. Les cellules fermées sont analysées par ANOVA à un facteur, et les résultats doivent être rapportés sous la forme du nombre moyen de cellules positives pour la FITC.

Figure 1 : Diagramme de dispersion représentatif de cytométrie en flux de leucocytes isolés dans le tissu rénal d’un poisson-zèbre de type sauvage, basé sur les caractéristiques de diffusion vers l’avant (FSC) et de diffusion latérale (SSC). La porte des phagocytes comprend les macrophages/monocytes et les granulocytes (23 % des cellules fermées. La porte des lymphocytes comprend les lymphocytes, les lymphocytes B phagocytaires et les cellules cytotoxiques non spécifiques (NCC) (26 % des cellules fermées). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Intensité moyenne de fluorescence (IMF) des cellules phagocytaires bloquées sur la figure 1 après exposition à la toxine. Le tube (1) montre des cellules non colorées tandis que les cellules du tube (2) émettent de la fluorescence par l’absorption de LY. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Intensité moyenne de fluorescence (MFI) des phagocytes bloqués sur la figure 1. Absorption du jaune de Lucifer (LY) sans la présence d’inhibiteur de la cytochalasine D (CCD) (A) ; l’adoption des LY avec la présence du CCD. Le tube (1) montre des cellules non colorées tandis que les cellules du tube (2) émettent de la fluorescence par l’absorption de LY. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Aperçu des étapes du protocole. *La durée et l’étendue de l’exposition des poissons à une biotoxine varient en fonction de la biotoxine utilisée et des règlements et protocoles de soins aux animaux et de biosécurité de différents établissements. **La concentration souhaitée utilisée et le temps d’exposition utilisé doivent être optimisés avant l’expérience et dépendront de la toxine utilisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’utilisation de la cytométrie en flux avec des leucocytes de poisson-zèbre offre une approche puissante et polyvalente pour étudier en détail le système immunitaire, évaluer l’impact des toxines environnementales et faciliter la recherche toxicologique. Il fournit un moyen d’évaluer rapidement et efficacement l’impact des toxines sur les cellules immunitaires et la réponse immunitaire. Les résultats révèlent des facteurs humoraux impliqués et suggèrent comment la physiologie et le métabolisme du poisson interagissent avec les biotoxines environnementales. La figure 4 donne un aperçu du protocole.

Cependant, ces méthodes présentent des limites. La préparation des leucocytes du poisson-zèbre pour la cytométrie en flux peut être plus complexe par rapport à d’autres modèles. La petite taille du poisson-zèbre peut limiter la quantité de sang et le nombre de leucocytes disponibles pour l’analyse ^9,10. Ces procédures nécessitent de dissocier les tissus pour obtenir des suspensions unicellulaires, et la viabilité cellulaire peut affecter la précision des résultats. Par rapport à des modèles comme les souris, la gamme d’outils immunologiques disponibles, tels que les anticorps spécifiques aux marqueurs cellulaires du poisson-zèbre, est plus limitée pour le poisson-zèbre. Cette limitation peut restreindre la profondeur d’analyse qui peut être menée sur les leucocytes du poisson-zèbre. De plus, l’interprétation des données de cytométrie en flux nécessite une expertise, en particulier lorsqu’il s’agit de réponses immunitaires complexes. Une mauvaise interprétation des données peut mener à des conclusions erronées, en particulier dans le contexte des impacts des toxines environnementales.

Les résultats d’échantillons de cellules sans inhibiteurs ajoutés peuvent être comparés à des échantillons de cellules contenant les inhibiteurs. Les résultats des échantillons de cellules avec la toxine ajoutée doivent être comparés aux échantillons de cellules avec les inhibiteurs. Si le réarrangement cytosquelettique a été affecté, l’absorption des LY sera limitée. Si la toxine inhibe l’absorption du DX-40 ou du DX-70, les différentes tailles de particules ne seront pas phagocytées. Si les cellules n’absorbent pas le FITC-E. coli, alors la toxine a inhibé la phagocytose.

En résumé, le poisson-zèbre sert d’excellent modèle pour étudier les effets des toxines environnementales sur les cellules immunitaires. Ce protocole décrit une méthode utilisant la cytométrie en flux et les leucocytes du poisson-zèbre pour dépister les biotoxines, en mettant l’accent sur les processus d’endocytose et de phagocytose¹¹. L’objectif de cette étude est de déterminer si l’exposition aux toxines affecte la capacité des leucocytes phagocytaires à absorber les agents pathogènes et de discerner les impacts potentiels sur des mécanismes endocytaires spécifiques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 % sérum fœtal bovin	Gibco	A3160501
14 mL tubes à centrifuger à fond rond	BD Biosciences	352059
40 µ ; séchoir à cellules m	Corning	07-201-430
Tubes de cytométrie en flux de 5 mL	BD Biosciences	352235
Tube à centrifuger conique de 50 mL	Corning	14-959-49A
Éthanol absolu	Fisher	BP2818-500
Compteur de cellules automatisé	Life Technologies Countess II FL		pour l’étude de la viabilité cellulaire
Bovin albumine sérique (BSA)	Sigma	A3059
cytochalasine D (CCD)	Sigma	C8273-5MG
Dextran 40	Sigma	FD40-100MG
Dextran 70	Sigma	46945-100MG-F
Escherichia coli DH5&alpha ; (ou une autre souche bactérienne de laboratoire)	New England Biolabs	C29871
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Sigma	ED4SS
Logiciel d’analyse de flux	Logiciel
Cytomètre	en flux Novocyte 3000
Fluorescéine	Fluka BioChemica	46950
hanks solution saline équilibrée sans calcium ni magnésium	Sigma	H4891
Histopaque 1077	Sigma	10771-100ML
Lucifer Yellow	Sigma	L0259-25MG
Mannan	Sigma	M7504-250MG
Saline tamponnée au phosphate	Sigma	P3813
RPMI-1640 avec GlutaMax	Gibco	61870036
Logiciel statistique	SPSS
Toxine
Tricaïne	Western Chemical Inc	NC0342409