Article de méthode

Procédé d’enrichissement de petites vésicules extracellulaires dérivées de tissus cancéreux du foie

DOI :

10.3791/64499

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3 février 2023

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1The First School of Clinical Medicine, Gannan Medical University, 2Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital of Gannan Medical University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici l’enrichissement de petites vésicules extracellulaires dérivées du tissu cancéreux du foie grâce à une méthode d’ultracentrifugation différentielle optimisée.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) dérivées du tissu peuvent refléter l’état fonctionnel des cellules sources et les caractéristiques de l’espace interstitiel du tissu. L’enrichissement efficace de ces sEV est une condition préalable importante à l’étude de leur fonction biologique et une clé pour le développement de techniques de détection clinique et de technologie de support thérapeutique. Il est difficile d’isoler les sEV des tissus, car ils sont généralement fortement contaminés. Cette étude fournit une méthode pour l’enrichissement rapide de sEVs de haute qualité à partir de tissus cancéreux du foie. La méthode implique un processus en quatre étapes: l’incubation des enzymes digestives (collagénase D et DNase Ι) avec les tissus, la filtration à travers une passoire cellulaire de 70 μm, l’ultracentrifugation différentielle et la filtration à travers un filtre à membrane de 0,22 μm. Grâce à l’optimisation de l’étape d’ultracentrifugation différentielle et à l’ajout d’une étape de filtration, la pureté des sEV obtenus par cette méthode est supérieure à celle obtenue par l’ultracentrifugation différentielle classique. Il fournit une méthodologie importante et des données à l’appui pour l’étude des EV dérivés de tissus.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) mesurent environ 30 nm à 150 nm de diamètre et sont sécrétées par diverses cellules1. Ils peuvent communiquer avec les cellules tissulaires et réguler le microenvironnement local ou distant en transportant des molécules biologiques importantes telles que les lipides, les protéines, l’ADN et l’ARN vers divers organes, tissus, cellules et parties intracellulaires. Ainsi, ils peuvent également modifier le comportement des cellules receveuses 2,3. L’isolement et la purification de sEVs spécifiques est une condition préalable essentielle à l’étude de leur comportement biologique au cours du développement et de l’évolution de la maladie. L’ultracentrifugation différentielle, considérée comme l’étalon-or, est couramment utilisée pour séparer les sEV des tissus dans lesquels ils résident normalement4. Les débris tissulaires, les débris cellulaires, les grandes vésicules et les corps apoptotiques peuvent être éliminés par cette technique, ne laissant que les sEV.

Il a été démontré que la collagénase D et la DNase I n’affectent pas les caractéristiques moléculaires des cellules ou des vésicules, les propriétés des deux enzymes contribuant à la libération de vésicules dans la matrice extracellulaire 5. Ces enzymes ont été utilisées pour extraire les sEV du tissu de mélanome métastatique humain, du tissu cancéreux du côlon et du tissu de la muqueuse colique 5,6,7. Cependant, la concentration et le temps de digestion de la collagénase D et de la DNase I dans ces méthodes diffèrent, ce qui conduit à des conclusions incohérentes. Pour éviter la coprécipitation d’autres sous-types de SEV, les chercheurs ont retiré des vésicules extracellulaires plus grandes (0,1 μm ou 0,2 μm de diamètre) par filtration et/ou centrifugation différentielle8. Selon le tissu source, différentes méthodes d’isolement et de purification peuvent être nécessaires 9,10.

L’utilisation de la méthode traditionnelle d’ultracentrifugation différentielle pour extraire les sEV du tissu hépatique entraîne une couche de substance blanche à la surface du surnageant, sans aucun moyen de déterminer ses propriétés. Dans une étude précédente11, cette couche de substance blanche affectait la pureté des sEV. Bien que le nombre de particules et la concentration en protéines des échantillons isolés par la méthode traditionnelle soient plus élevés que ceux de la méthode actuelle, le coefficient de variation était important, peut-être parce que de nombreux polluants peuvent entraîner une mauvaise répétabilité des résultats. C’est-à-dire qu’en utilisant un détergent (c’est-à-dire en détectant la solubilité des particules dans 1% Triton X-100), nous avons constaté que la pureté des sEV obtenus par cette méthode était plus grande. Par conséquent, nous utilisons cette méthode pour isoler et purifier les sEV dérivés du tissu du cancer colorectal pour la recherche protéomique.

À l’heure actuelle, la recherche sur les sEV dans le cancer du foie se concentre principalement sur le sérum, le plasma et le surnageant de la culture cellulaire12,13,14. Cependant, les sEV dérivés du tissu cancéreux du foie peuvent refléter plus précisément la pathologie physiologique et le microenvironnement environnant du cancer du foie et éviter efficacement la dégradation et la pollution d’autres VE15,16. Avec l’utilisation de l’ultracentrifugation différentielle, cette méthode peut enrichir le rendement et obtenir des EVE de haute qualité, fournissant une base importante pour l’étude ultérieure du cancer du foie. Cette méthode permet de séparer le tissu cancéreux du foie par séparation nette et d’être dissocié par la collagénase D et la DNase I. Ensuite, les débris cellulaires, les grandes vésicules et les corps apoptotiques sont éliminés par filtration et ultracentrifugation différentielle. Enfin, les sEV sont isolés et purifiés pour des études ultérieures.

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Protocole

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Le tissu cancéreux du foie humain a été recueilli chez des patients atteints de malignité hépatique au premier hôpital affilié de l’Université médicale de Gannan. Tous les patients ont signé un formulaire de consentement éclairé et la collecte d’échantillons de tissus humains a été approuvée par le comité d’éthique du premier hôpital affilié de l’Université médicale de Gannan. Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.

1. Préparation

  1. Placez l’agitateur décolorant de transfert dans l’incubateur et réglez la température à 37 °C. Voir la figure 1 pour tous les autres équipements nécessaires.
  2. Nettoyez le scalpel et les forceps en les aspergeant avec de l’alcool à 75%.
  3. Préparer la solution digestive en mesurant 6 mg de collagénase D (4 mg/mL) et 24 μL de DNase Ι (80 U/mL) et en les ajoutant à 1,5 mL de milieu basique RPMI-1640. Mélanger par inversion douce jusqu’à dissolution complète des additifs.
  4. Au préalable, humidifiez les crépines cellulaires de 70 μm et 0,22 μm avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  5. Placer une boîte de culture cellulaire stérile de 100 mm sur la glacière pour retenir les tissus hépatiques après la décongélation.
  6. Dans les 15 minutes suivant l’isolement du tissu du carcinome hépatocellulaire, rincer le sang à la surface du bloc tissulaire avec du PBS, transférer le tissu dans un tube congelé stérile et le conserver à -80 °C jusqu’à l’expérience pendant 2 semaines au maximum.

2. Dissociation tissulaire

  1. Retirer l’échantillon de tissu du congélateur à −80 °C et placer environ 400 mg du tissu - coupé en fragments de 2 mm x 2 mm x 2 mm - dans la boîte de culture cellulaire de 10 cm sur la glacière.
  2. Déplacer le tissu dans une plaque à 6 puits avec 1,5 mL de solution digestive; puis placer la plaque sur l’agitateur décolorant de transfert (20 tr/min) pour incuber pendant 20 min à 37 °C pour une dissociation complète du tissu cancéreux du foie et la libération des sEVs.
  3. Retirez la plaque à 6 puits de l’incubateur et placez-la sur la glacière. Ajouter 80 μL d’inhibiteur de phosphatase et 200 μL de solution complète d’inhibiteur de protéase pour arrêter la digestion.
  4. Transférer la solution digestive dans la passoire cellulaire de 70 μm et la filtrer lentement pour éliminer les gros débris tissulaires. Recueillir le filtrat et le placer dans un tube à centrifuger de 2 mL.

3. Ultracentrifugation différentielle

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes de centrifugation à 4 ° C.

  1. Centrifuger le filtrat à 500 × g pendant 10 min et recueillir le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger de 2 mL. La plupart des petits débris tissulaires peuvent alors être enlevés.
  2. Centrifuger le surnageant à 3 000 × g pendant 20 min pour éliminer les débris cellulaires. Transférer délicatement le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger jusqu’à ce que l’extrémité de la pipette soit sur le point de toucher la substance blanche à la surface.
  3. Centrifuger le liquide restant à 3 000 × g pendant 3 min; Ensuite, aspirez le surnageant pour faciliter la collecte des vésicules. Pour assurer la pureté des sEV, assurez-vous que la substance blanche n’est pas aspirée.
  4. Centrifuger le surnageant recueilli à 12 000 × g pendant 20 minutes et transférer 900 μL du surnageant dans un tube à ultracentrifuger de 4,7 mL. Centrifuger le liquide restant à 12 000 × g pendant 3 minutes, puis recueillir et mélanger les deux surnageants dans le même tube à ultracentrifugation. Remplissez complètement le tube avec du PBS.
  5. Centrifuger les surnageants à 100 000 × g pendant 60 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille en remplissant le tube à ultracentrifugeuses de PBS et en centrifugeant à nouveau à 100 000 × g pendant 60 min. Remettez la pastille en suspension avec 50 μL de PBS.
  6. Aspirez la suspension sEV à l’aide d’une seringue stérile de 1 mL et filtrez-la à travers un filtre à membrane de 0,22 μm. Recueillir le filtrat dans un tube à centrifuger de 600 μL et le conserver à −80 °C pour une analyse plus approfondie.

4. Évaluation de la qualité de l’enrichissement

  1. Observer la morphologie des sEV au microscope électronique à transmission.
    1. Ensuite, déposez 10 μL de l’échantillon de sEV sur un filet en cuivre, incuber à température ambiante pendant 10 minutes et nettoyez-le avec de l’eau distillée stérile, en utilisant du papier absorbant pour éliminer l’excès de liquide.
    2. Déposer 10 μL d’acétate d’uranyle à 2 % sur le filet de cuivre pour une coloration négative pendant 1 min. Utilisez du papier filtre pour absorber le liquide à la surface du filet de cuivre et séchez-le pendant 2 min sous une lampe à incandescence.
    3. Observez le treillis de cuivre sous un microscope électronique à transmission et imagez à 80 kV.
  2. Utilisez un cytomètre à flux de nanoparticules pour déterminer la distribution granulométrique et la pureté des sEV.
    1. Avant le démarrage de la machine, préparez des tubes contenant 200 μL de contrôle qualité, 200 μL de nanosphères de silice, 2 x 200 μL d’eau ultrapure, 2 x 200 μL de solution de nettoyage et 200 μL de PBS.
      NOTE: Avant de tester les échantillons sEV, il est nécessaire d’effectuer un contrôle de qualité sur l’instrument et de tester l’étalon granulométrique (la distribution granulométrique doit être calculée à l’aide de courbes étalons générées avec plusieurs nanomicrosphères de diamètres différents [68-155 nm] dans les mêmes conditions de détection). Des billes de QC et des nanosphères de silice ont été diluées 100x avec de l’eau ultrapure dans un volume total de 200 μL.
    2. Vérifiez le volume de la solution de nettoyage (>10 mL) et notez la différence entre les niveaux du liquide de la gaine et du liquide usagé (20-30 cm).
    3. Coupez l’alimentation principale de l’instrument; Après 20 s, allumez l’ordinateur et attendez les bips indiquant que l’instrument est correctement connecté pour exécuter le logiciel.
    4. Cliquez sur Démarrer pour allumer la caméra, le laser et la pompe à air.
    5. Cliquez sur Sheath Flow-Start Up et placez de l’eau ultrapure sur la plate-forme de chargement. Après 4 min (compte à rebours de l’instrument), cliquez sur Sample-Boosting | Échantillon-déchargement.
    6. Après 30 s, placez le tube vierge sur la plate-forme de chargement et cliquez sur Sample-Boosting | Échantillon-déchargement. Ensuite, placez le tube retenant l’eau ultrapure sur la plate-forme de chargement et, simultanément, cliquez sur Sample-Boosting | Purge d’écoulement de gaine.
    7. Cliquez sur Fonctionnement manuel et placez le tube de concentration de particules sur la plate-forme de chargement. Ensuite, cliquez sur Sample-Boosting pendant 1 min et sélectionnez simultanément le contrôle qualité 250 nm Std FL SiNPs dans « SAMP. Inf. »
    8. Cliquez sur Sample-Sampling et allumez le détecteur en cliquant sur SPCM.
      REMARQUE: À ce stade, la forme d’onde du signal en temps réel peut être vue.
    9. Cliquez sur Auto Sampling et entrez 1.0 dans Sampling SET pour fixer la pression à 1 KPa. Cliquez sur la barre d’outils et sélectionnez Large Signal.
    10. Ajustez la position horizontale du laser et réglez le laser à 2 μm; Ensuite, cliquez sur L ou R pour vous assurer que le signal est fort et uniforme.
    11. Cliquez sur Time to Record pour collecter les données, qui passeront automatiquement à Buffer une fois terminé. Ensuite, enregistrez les données dans un fichier Naf et cliquez sur Sample-Unload.
    12. Placez le tube de solution de nettoyage sur la plate-forme de chargement, cliquez sur Sample-Boosting, et après 1 min, cliquez sur Sample-Unload. Utilisez de l’eau ultrapure pour éliminer la solution de nettoyage résiduelle de l’extrémité capillaire.
    13. Placez le tube standard granulométrique sur la plate-forme de chargement et cliquez sur Sample-Boosting pendant 1 min.
    14. Sélectionnez le contrôle qualité 68-155 nm Std FL SiNPs dans « SAMP. Inf » et cliquez sur Sample-Sampling. Ensuite, cliquez sur la barre d’outils et sélectionnez Petit signal.
    15. Cliquez sur Time to Record pour collecter les données, qui passeront automatiquement à Buffer une fois terminé. Ensuite, enregistrez les données dans un fichier Naf et cliquez sur Sample-Unload.
    16. Placez le tube de solution de nettoyage sur la plate-forme de chargement, cliquez sur Sample-Boosting, puis cliquez sur Sample-Unload après 1 min. Utilisez de l’eau ultrapure pour éliminer la solution de nettoyage résiduelle de l’extrémité capillaire.
    17. Placez le tube PBS sur la plate-forme de chargement; cliquez sur Sample-Boosting pendant 1 min.
    18. Sélectionnez le contrôle qualité 68-155 nm Std FL SiNPs dans « SAMP. Inf » et cliquez sur Sample-Sampling. Ensuite, cliquez sur la barre d’outils et sélectionnez Petit signal.
    19. Cliquez sur Time to Record pour collecter des données, qui passeront automatiquement à Buffer une fois terminé. Enregistrez les données dans un fichier Naf et cliquez sur Sample-Unload.
    20. Placez le tube de solution de nettoyage sur la plate-forme de chargement, cliquez sur Sample-Boosting et Sample-Unload après 1 min. Utilisez de l’eau ultrapure pour éliminer la solution de nettoyage résiduelle de l’extrémité capillaire.
    21. Vérifier les informations de l’échantillon comme décrit précédemment aux étapes 4.2.17-4.2.20; remplacer le PBS (étape 4.2.17) par l’échantillon sEV et analyser les données.
  3. Identifiez davantage les sEV par transfert western.
    1. Déterminez les concentrations de protéines des sEV et des tissus à l’aide du kit de quantification des protéines BCA conformément aux instructions du fabricant.
    2. Calculer le volume de charge des EV (p. ex., pour 5 μg de protéines par puits) en fonction de ces résultats quantitatifs. Ajouter un tampon de chargement dans un rapport de 1:4 et vortex le mélange.
    3. Après dénaturation dans un bain métallique à 100 °C (thermostat sec) pendant 10 min, séparer la protéine sur un gel de polyacrylamide à 12% à 60 V pendant 80 min.
    4. Transférer le gel sur une membrane de difluorure de polyvinylidène de 0,22 μm à 220 mA pendant 2 h à l’aide d’un tampon de transfert (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% méthanol).
    5. Bloquer la membrane avec du lait en poudre écrémé à 5 % dans du Tween salin tamponné Tris (TBST) pendant 1 h à température ambiante et incuber avec un anticorps primaire (anticorps monoclonal anti-humain CD9 de lapin, anticorps monoclonal anti-humain CD63 de lapin, anticorps monoclonal anti-humain TSG101 de lapin, anticorps monoclonal monoclonal anti-humain GM130 de souris) pendant une nuit à 4 °C. Diluer les anticorps primaires dans du lait écrémé à 5 % à 1:1 000.
    6. Après trois lavages avec TBST, incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) à température ambiante pendant 1 h.
    7. Détectez l’anticorps lié au HRP à l’aide d’un substrat de transfert ECL, puis collectez et analysez les images.

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Résultats

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Les sEV des tissus cancéreux du foie humain ont joué un rôle crucial dans le diagnostic, le traitement et le pronostic des patients atteints d’un cancer du foie. Cette méthode utilisait des instruments de laboratoire courants pour isoler et purifier les sEV dérivés des tissus cancéreux du foie; cela peut fournir un soutien méthodologique pour l’étude des EV. La figure 2 illustre le processus général d’enrichissement des EV à partir des tissus cancéreux du foie. Les sEVs dans les espaces inte...

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Discussion

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Ce protocole décrit une méthode reproductible pour extraire les sEV du tissu cancéreux du foie. Les sEVs de haute qualité sont obtenus par isolation nette des tissus, traitement avec des enzymes digestives, ultracentrifugation différentielle et filtration et purification de la membrane filtrante de 0,22 μm. Pour l’analyse en aval, il est extrêmement important de garantir la haute pureté des sEV. Dans le processus de centrifugation différentielle, une couche de substances blanches (composition inconnue) apparaîtra à la su...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs remercient le premier hôpital affilié de l’Université médicale de Gannan pour son soutien à ce travail. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 82260422).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 et micro ; m Unité de filtration à membraneMillexSLGPR33RB
1 mL Seringue stérileHubei Xianming Medical Instrument CompanyYL01329
2 % Acétate d’uranyleMicroscopie électronique Sciences22400-2
4,7 mL Tube à centrifugerBeckman Coulter361621
6 puits Plaque de cuture cellulaireLABSELECT11110
50 mL BécherTianjin Kangyiheng Société de vente d’instruments expérimentauxCF2100800
70 & micro ; m Passoire cellulaireBiosharpBS-70-XBS
100 mm Boîte de culture cellulaireCELL TERCS016-0128
600 µ ; L Tube à centrifugerAxygenMCT060C
BCA kit de quantification des protéinesThermo FisherRJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TLBeckman  ;A95761
BioRad Mini trans-blotBio-Rad1703930
BioRad Mini-ProteanBio-Rad1645050
CD63 AnticorpsAbcamab134045
CD9 AnticorpsAbcamab263019
Centrifugeuse 5430REppendorf5428HQ527333
Solution de nettoyageNanoFCMC1801
Collagénase DRoche11088866001
Filet de cuivreHenan Zhongjingkeyi Technology CompanyDJZCM-15-N1
Thermostat secHangzhou allsheng instruments companyAS-01030-00
FITC Anti Human CD9Antibody Elabscience E-AB-F1086C
GlycineSolarbioG8200
Anticorps anti-souris secondaire couplé à la peroxydase de raifort de chèvre (HRP)  ;ProteintechSA00001-1
Anticorps anti-lapin secondaire couplé à la peroxydase de raifort (HRP)  ;ProteintechSA00001-2
MéthanolShanghai Zhenxing Chemical Company
Cytomètre en flux de nanoparticulesNanoFCM INCFNAN30E20112368
inhibiteurs de la phosphatase (PhosSTOP)Roche4906845001
Phosphate Buffered Saline (PBS)ServicebioG4202
Membrane de difluorure de polyvinylidèneSolarbioISEQ00010
QC PerlesNanoFCMQS2502
RPMI-1640 support de baseBiological Industries  ;
ScalpelGuangzhou Kehua Trading CompanyNN-0623-1
Nanosphères de siliceNanoFCMS16M-Exo
Transfert Décolorant Shaker TS-8Kylin-BellE0018
Microscope électronique à transmissionThermo ScientificTalos L120C
TrisSolarbioT8060
TSG101Anticorps Proteintech28283-1-AP
Guangzhou Lige Technology CompanyLG01-105-4X
C11875500BT Pince à épiler

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  14. Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513(2018).
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Mots-clés

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