Un test de fluorescence calcique « à double addition » pour le criblage à haut débit de récepteurs couplés à la protéine G recombinante

Summary

Dans ce travail, un test de fluorescence calcique intracellulaire à haut débit pour des plaques à 384 puits afin de cribler de petites banques de molécules sur des récepteurs couplés aux protéines G recombinantes (RCPG) est décrit. La cible, le récepteur kinine de la tique de la fièvre bovine, Rhipicephalus microplus, est exprimée dans les cellules CHO-K1. Ce test identifie les agonistes et les antagonistes utilisant les mêmes cellules dans un test de « double addition ».

Abstract

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande superfamille de récepteurs et sont la cible de nombreux médicaments humains. Le criblage à haut débit (HTS) de bibliothèques aléatoires de petites molécules par rapport aux RCPG est utilisé par l’industrie pharmaceutique pour la découverte de médicaments spécifiques à la cible. Dans cette étude, un HTS a été utilisé pour identifier de nouveaux ligands à petites molécules de RCPG neuropeptidiques spécifiques aux invertébrés comme sondes pour des études physiologiques de vecteurs d’agents pathogènes humains et vétérinaires mortels.

Le récepteur kinin spécifique aux invertébrés a été choisi comme cible parce qu’il régule de nombreux processus physiologiques importants chez les invertébrés, y compris la diurèse, l’alimentation et la digestion. De plus, la pharmacologie de nombreux RCPG invertébrés est mal caractérisée ou pas caractérisée du tout; par conséquent, la pharmacologie différentielle de ces groupes de récepteurs par rapport aux RCPG apparentés chez d’autres métazoaires, en particulier chez les humains, ajoute des connaissances aux relations structure-activité des RCPG en tant que superfamille. Un test HTS a été développé pour des cellules dans des plaques de 384 puits pour la découverte de ligands du récepteur kinine de la tique de la fièvre bovine, ou tique du bétail du sud, Rhipicephalus microplus. Le récepteur de la kinine à tiques était exprimé de manière stable dans les cellules CHO-K1.

Le récepteur des kinines, lorsqu’il est activé par des neuropeptides de kinine endogènes ou d’autres agonistes de petites molécules, déclenche la libération de Ca²⁺ des réserves de calcium dans le cytoplasme. Ce test de fluorescence calcique combiné à une approche de « double addition » peut détecter des molécules « hit » agonistes et antagonistes fonctionnelles dans la même plaque de dosage. Chaque essai a été réalisé à l’aide de plaques médicamenteuses portant un réseau de 320 petites molécules aléatoires. Un facteur Z' fiable de 0,7 a été obtenu, et trois molécules d’agonistes et deux molécules d’antagoniste ont été identifiées lorsque le HTS était à une concentration finale de 2 μM. Le test de fluorescence calcique rapporté ici peut être adapté pour dépister d’autres RCPG qui activent la cascade de signalisation Ca²⁺ .

Introduction

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), qui sont présents de la levure à l’homme, représentent la plus grande superfamille de récepteurs dans de nombreux organismes¹. Ils jouent un rôle essentiel dans la régulation de presque tous les processus biologiques chez les animaux. Il y a 50 à 200 RCPG dans le génome des arthropodes, ce qui signifie qu’ils représentent la plus grande superfamille de récepteurs membranaires². Ils sont classés en six classes principales, A-F, en fonction de leur similitude de séquence et de leurs fonctions³. Les RCPG transduisent divers signaux extracellulaires, tels....

Protocol

1. Entretien des cellules

REMARQUE : UNE LIGNÉE CELLULAIRE CHO-K1 qui exprime de façon stable le récepteur des kinines de R. microplus, nommée BMLK₃, a été développée par Holmes et ^al.16. Les détails du développement de la lignée cellulaire sont présentés ailleurs¹⁴. Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans des conditions stériles dans une enceinte de biosécurité de classe II.

1. Cultiver la lignée cellulaire recombinante dans un milieu sélectif (milieu F-12K contenant 10 % de sérum fœtal bovin [FBS] et 800 μg/mL de sulfate G418) pour assurer....

Results

Une plaque médicamenteuse interne (SAC2-34-6170) composée de 320 petites molécules aléatoires a été utilisée pour démontrer ce test HTS à titre d’exemple. Le HTS avait une excellente qualité de dosage avec un facteur Z' de 0,7 (tableau 1). Ce facteur Z' reflète la qualité du dosage indépendamment des composés testés³⁴. Un facteur Z de 0,5 ou plus indique une bonne plage dynamique du signal de test entre les UFR des témoins positifs et des témoins négatifs. Le.......

Discussion

L’objectif de HTS est d’identifier les molécules frappées en criblant un nombre massif de petites molécules. Par conséquent, les résultats de cet exemple ne représentent qu’une petite partie d’une expérience HTS conventionnelle. De plus, les molécules hit, identifiées, doivent être validées dans des essais en aval tels qu’un dosage dose-dépendant sur la même lignée cellulaire recombinante et sur une lignée cellulaire CHO-K1 ne portant que le vecteur vide, qui peut être réalisé simultanément pour sauver de petites molécul.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % trypsine-EDTA	Gibco Invitrogen	15050-065	avec rouge de phénol
0,4 % de bleu trypan	MilliporeSigma	T8154	liquide,
stérile 1,5 mL microcentrifuge Thermo	Fisher	AM12400	sans RNase
Pipette sérologique de 5 mL	Corning	29443-045	Corning Costar Stripette emballée individuellement.
Pipette sérologique de 10 mL	Corning	29443-047	Corning Costar Stripette emballée individuellement.
Tubes coniques de 15 mL	Falcon	352196	stériles
20 & micro ; L filtres embouts	USA Scientifc Inc.	stérile P1121	barrière
de 25 mL	Corning	29443-049	Corning Costar Stripette emballée individuellement.
Tubes coniques de 50 mL	Corning	430828	gradué, stérile
Réserve auto-friendly de 150 mL	Integra Bioscience	6317	stérile, emballé individuellement pour l’ensemencement cellulaire au jour 1
Réserve auto-friendly de 150 mL	Integra Bioscience	6318	stérile, empilée, pour le chargement du colorant au jour 2
384/ 12.5 µ ; L embouts à faible rétention	Integra Bioscience	6405	long, filtre stérile
384/ 12.5 µ ; L tips	Integra Bioscience	6404	filtre long et stérile
plaque 384 puits	Greiner	781091	CELLSTAR, polystyrène transparent, & micro ; Transparent, noir/plat
Plaques d’étanchéité en aluminium	Axygen Scientific	PCR-AS-200	base de polyester
Feuille d’aluminium	Walmart
Biosafty armoire II	NuAire	NU-540-300
Compteur de cellules	Nexcelom	AutoT4
lames de comptage de cellules	Nexcelom	SD-100	20 µ ; Chambre L
CO2 incubateur humidifié	Thermo Fisher	Forma Series II
Lampe de bureau	SunvaleeyTEK	RS1000B
Dimethyl sulfoxyde	MilliporeSigma	276855	anhydous, >99.9 %
Plaque de médicament	Corning	3680
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco	Corning	21-031- CV	DPBS, 1x sans calcium et magnésium
Éthanol	Koptec	2000
F-12K Mélange de nutriments  ;	Corning	45000-354	(Kaighn’s Mod.) avec L-glutamine
Sérum fœtal bovin	Equitech-Bio	SFBU30
Kit de dosage du calcium fluorescent	ENZO Lifescience	ENZ-51017	10x96 tests
G418	sulfate Gibco Invitrogen	10131-027	Geneticin antibiotique sélectif 50 mg/mL
Tampon de Hank	MilliporeSigma	55037C	HBSS modifié, avec calcium, avec magnésium, sans phénol lire
tampon HEPES	Gibco Invitrogen	15630-080	1 molaire
HTS plateforme de stockage de données	CDD vault  ;		https://www.collaborativedrug.com/
Système de manipulation de liquides	Integra Bioscience	Viaflo	384/12.5 µ ;
L Centrifugeuse à plaques	Thermo Fisher	Sorvall ST8
Lecteur de plaques	Technologie BMG Clariostar
Poly-D-lysine	MilliporeSigma	P6407
Rhimi-K-1 agonist peptide	Genscript	commande personnalisée	QFSPWGamide
T-75 flacon	Falcon	353136