Ce protocole décrit une méthode efficace pour différencier les CSPhi en groupes de champs oculaires et générer des organoïdes neuro-rétiniens en utilisant des conditions de culture simplifiées impliquant à la fois des systèmes de culture adhérents et en suspension. D’autres types de cellules oculaires, telles que l’EPR et l’épithélium cornéen, peuvent également être isolés à partir de champs oculaires matures dans des cultures rétiniennes.
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Article de méthode
Génération d’organoïdes rétiniens à partir de cellules souches pluripotentes saines et spécifiques à une maladie rétinienne
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules souches pluripotentes peuvent générer des organoïdes tissulaires complexes qui sont utiles pour les études de modélisation in vitro des maladies et pour le développement de thérapies régénératives. Ce protocole décrit une méthode plus simple, robuste et progressive de génération d’organoïdes rétiniens dans un système de culture hybride composé de cultures monocouches adhérentes pendant les 4 premières semaines de différenciation rétinienne jusqu’à l’émergence d’amas primordiaux (EFP) distincts et auto-organisés. De plus, les îlots neuro-rétiniens circulaires et translucides en forme de beignet dans chaque EFP sont cueillis manuellement et cultivés sous suspension à l’aide de boîtes de culture non adhérentes dans un milieu de différenciation rétinienne pendant 1 à 2 semaines pour générer des ventouses optiques 3D multicouches (OC-1M). Ces organoïdes rétiniens immatures contiennent des précurseurs rétiniens multipotents proliférants PAX6+ et ChX10+. Les cellules précurseurs sont auto-assemblées linéairement dans les organoïdes et apparaissent comme des stries radiales distinctes. 4 semaines après la culture en suspension, les progéniteurs rétiniens subissent un arrêt post-mitotique et une différenciation de la lignée pour former des organoïdes rétiniens matures (OC-2M). La lignée photoréceptrice a commis des précurseurs dans les couches les plus externes des organoïdes rétiniens. Ces cellules photoréceptrices CRX+ et RCVRN+ mûrissent morphologiquement pour afficher des extensions de type segment interne. Cette méthode peut être adoptée pour générer des organoïdes rétiniens à l’aide de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Toutes les étapes et procédures sont clairement expliquées et démontrées pour assurer la reproductibilité et pour des applications plus larges en science fondamentale et en recherche translationnelle.
Introduction
La rétine est un tissu sensible à la lumière présent à l’arrière de l’œil des vertébrés qui convertit les signaux lumineux en impulsions nerveuses par un phénomène biochimique connu sous le nom de voie de photo-transduction. Les impulsions nerveuses initiales générées dans les cellules photoréceptrices de la rétine sont transduites à d’autres interneurones rétiniens et cellules ganglionnaires de la rétine (RGC) et atteignent le cortex visuel du cerveau, ce qui aide à la perception de l’image et à la réponse visuelle.
Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), environ 1,5 million d’enfants sont aveugles, dont 1 million en Asie. La dyst....
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Protocole
Toutes les expériences impliquant des CSPh ont été réalisées de manière aseptique, conformément aux pratiques de laboratoire standard, aux lignes directrices en matière d’éthique et de biosécurité, et avec l’approbation d’organismes de réglementation tels que le Comité d’éthique institutionnel (CEI), le Comité institutionnel pour la recherche sur les cellules souches (IC-SCR) et le Comité institutionnel de biosécurité (IBSC).
1. Préparation de la culture iPSC et du milieu de différenciation rétinienne et des réactifs
- Culture iPSC et support de maintenance
- Cultiver et maintenir la lignée hiPSC
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Résultats
La différenciation des CSPh en lignées oculaires est obtenue en cultivant les cellules dans différents cocktails de milieu de culture contenant des suppléments et des facteurs de croissance par étapes séquentielles à différents moments, comme décrit à la figure 1. Les cultures hiPSC sont maintenues dans le milieu Essential 8, le milieu de maintien des cellules souches pluripotentes. Une fois qu’ils atteignent une confluence de 70 % à 80 % (Figure 2A), le milieu .......
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Discussion
Les CSPhi sont un outil puissant pour étudier le développement des organes et des tissus in vitro. Récapituler le phénotype de la maladie en différenciant les CSPh saines des CSP spécifiques à la maladie vers la lignée rétinienne peut aider à mieux comprendre la physiopathologie des différentes formes de dystrophies rétiniennes héréditaires. Plusieurs protocoles ont été décrits et adoptés pour la différenciation in vitro des CSP en types de cellules rétiniennes. La plupart d’entre eux impliquent l’utili.......
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Déclarations de divulgation
Tous les auteurs n’ont pas de conflit d’intérêts ou de divulgation financière.
Remerciements
Les auteurs remercient la Dre Chitra Kannabiran, généticienne, pour son soutien scientifique et technique; Dr Subhadra Jalali, consultant en rétine; Dr Milind Naik, chirurgien oculoplastique; et le Dr Swathi Kaliki, oncologue oculaire au LV Prasad Eye Institute, Hyderabad, vers la génération de lignées iPSC normales et spécifiques au patient. Les auteurs remercient les subventions de R&D du Science and Engineering Research Board, Department of Science and Technology (IM), (SB/SO/HS/177/2013), Department of Biotechnology (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) et les bourses de recherche senior de l’ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) et CSIR (V.K.P.), gouvernement de l’Inde.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,22 et micro ; m Filtres à seringue | TPP | 99722 ; | |
| Tube à centrifuger 15 mL | TPP | 91015 | |
| Tube à centrifuger 50 mL | TPP | 91050 | |
| Plaques à 6 puits | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 ; Anticorps anti-CRX monoclonal | de souris Santa Cruz | SC365519 | dilution 1:50 |
| ; Lapin monoclonal | Abcam | ab140603 | dilution 1:300 |
| Anticorps anti-MiTF, Souris monoclonal | Abcam | ab3201 | dilution 1:250 |
| Anticorps anti-récupérine ; Lapin polyclonal ; ; ; ; ; | Millipore | AB5585 | dilution 1:300 |
| (50x), sans sérum | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) | Centrifugeuse Sigma Aldrich | F0291 | |
| 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC Matrix Corning | |||
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, supplément GlutaMAX (milieu basal) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymérase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco' s Phosphate salin tamponné | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 kit moyen | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Éthylène diamine tétraacétique sel disodique dihydraté (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Non traité TC Boîte de Pétri traitée, 60 mm ; | Corning | 351007 | |
| fœtal ; Bovins ; Sérum, qualifié, États-Unis ; | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ avec le logiciel de laboratoire d’images | Système de documentation BIO-RAD | Agarose Gel ; | |
| Supplément GlutaMAX | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Chèvre anti-Souris IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | dilution 1:300 |
| Chèvre anti-Souris IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | dilution 1:300 |
| Chèvre anti-Lapin IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | dilution 1:300 |
| Chèvre anti-IgG Lapin (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution 1:300 |
| HistoCore MULTICUT | Leica | Pour la coupe | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 supplément (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | Pour quantifier l’ARN | |
| Paraformaldéhyde | Qualigènes | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 pouces, Non Stérile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Pénicilline-Streptomycine ; | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Anticorps recombinant anti-Otx2, Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | dilution 1:300 |
| Anticorps recombinant anti-PAX6 ; Lapin Monoclonal | Abcam | ab195045 | Dilution 1:300 |
| Anticorps recombinant Anti-RPE65, Lapin Monoclonal | Abcam | ab231782 | Dilution 1:300 |
| Recombinant Protéine de Noggin Humaine | R& D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Pipettes sérologiques 10 mL | TPP | 94010 | |
| Pipettes sérologiques 5 mL | TPP | 94005 | |
| Chlorure | de sodium Sigma Aldrich | S7653 | |
| Citrate de sodium Tribasique dihydraté | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost ( lames microscopiques Knittel | |||
| SuperScript III Système de synthèse premier brin | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III Système de synthèse premier brin pour RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol ; Réactif | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Milieu de montage anti-effacement avec DAPI ; | Laboratoires Vecteurs | H-1200 ; | |
| Vitronectine | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dichlorhydrate (inhibiteur de la rho-kinase) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Microscope confocal | Zeiss |
Références
- Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Sen....
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Réimpressions et autorisations
