Le présent travail décrit un nouveau protocole expérimental qui utilise un support imprimé en 3D pour permettre l’imagerie de cellules vivantes à haute résolution de globes énucléés. Grâce à ce protocole, l’activité de signalisation cellulaire du calcium dans l’épithélium cornéen blessé des globes ex vivo peut être observée en temps réel.
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Article de méthode
Imagerie de cellules vivantes de globes ex vivo intacts à l’aide d’un nouveau support imprimé en 3D
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes est un processus migratoire initié par l’activation des récepteurs purinergiques exprimés sur les cellules épithéliales. Cette activation entraîne des événements de mobilisation du calcium qui se propagent de cellule en cellule, ce qui est essentiel pour initier la motilité cellulaire dans le lit de la plaie, favorisant une cicatrisation efficace de la plaie. Le laboratoire Trinkaus-Randall a développé une méthodologie pour imager la réponse de cicatrisation des plaies cornéennes dans des globes murins ex vivo en temps réel. Cette approche consiste à énucléer un globe intact d’une souris qui a été euthanasiée selon les protocoles établis et à incuber immédiatement le globe avec un colorant indicateur de calcium. Une contre-coloration qui colore d’autres caractéristiques de la cellule peut être appliquée à ce stade pour aider à l’imagerie et montrer les points de repère cellulaires. Le protocole a bien fonctionné avec plusieurs colorants de cellules vivantes utilisés pour la contre-coloration, y compris l’actine SiR pour colorer l’actine et la coloration de membrane plasmique rouge foncé pour colorer la membrane cellulaire. Pour examiner la réponse à une plaie, l’épithélium cornéen est blessé à l’aide d’une aiguille de 25 G et les globes sont placés dans un support imprimé en 3D. Les dimensions du support imprimé en 3D sont calibrées pour assurer l’immobilisation du globe pendant toute la durée de l’expérience et peuvent être modifiées pour accueillir des yeux de différentes tailles. L’imagerie cellulaire vivante de la réponse de la plaie est réalisée en continu à différentes profondeurs dans tout le tissu au fil du temps à l’aide de la microscopie confocale. Ce protocole nous permet de générer des images haute résolution et de qualité publication à l’aide d’un objectif d’air 20x sur un microscope confocal. D’autres objectifs peuvent également être utilisés pour ce protocole. Il représente une amélioration significative de la qualité de l’imagerie des cellules vivantes dans les globes murins ex vivo et permet l’identification des nerfs et de l’épithélium.
Introduction
Cornée
La cornée est une structure avasculaire claire recouvrant la surface antérieure de l’œil qui réfracte la lumière pour permettre la vision et protéger l’intérieur de l’œil contre les dommages. Comme la cornée est exposée à l’environnement, elle est sensible aux dommages causés à la fois par des causes mécaniques (rayures) et par une infection. Une lésion cornéenne chez un patient par ailleurs en bonne santé guérit généralement en 1 à 3 jours. Cependant, chez les patients atteints de maladies sous-jacentes, notamment un déficit en cellules souches limbiques et un diabète de type II, le processus de cicatrisation des plaies cornéennes peut être....
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Protocole
Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par l’Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic Care and Vision Research et le protocole IACUC de l’Université de Boston (201800302).
1. Conception des supports imprimés en 3D et de la barre de couverture
- Concevoir les supports imprimés en 3D et la barre de couverture en tenant compte du diamètre moyen des globes de souris et imprimer la conception en 3D (Figure 1A, B).
- Gardez le diamètre de la paroi interne du support légèrement plus grand que le ....
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Résultats
Ce protocole a été utilisé pour produire systématiquement des données et des images de qualité publication10. Les images obtenues représentent une amélioration significative par rapport aux approches précédentes (Figure 2). À l’aide du support imprimé en 3D, des images peuvent être capturées à travers les couches de la cornée, et la mobilisation du calcium dans différents plans z peut être observée (Figure 3). Cette approche a été utilisé.......
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Discussion
Ce protocole décrit une technique d’imagerie de cellules vivantes qui utilise un support imprimé en 3D pour stabiliser et immobiliser les yeux intacts des animaux. Il est conçu pour contourner plusieurs inconvénients importants reconnus avec les protocoles précédents d’imagerie de cellules vivantes du tissu cornéen ex vivo . Ce protocole offre de nombreux avantages pour l’imagerie de cellules vivantes de globes intacts. Il réduit considérablement les dommages tissulaires inutiles qui pourraient interférer avec l.......
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Déclarations de divulgation
Nous n’avons aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier les NIH pour le soutien de subvention suivant: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) et 5T32GM008541-24 (KS). Nous tenons également à remercier le Massachusetts Lions Eye Research Fund et le New England Corneal Transplant Fund.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1.75 plastique bleu à l’acide polylactique (PLA) | Creality (Shenzen, Chine) | N/A | Matériau pour support |
| Plat de 35 mm, n° 1.5 lamelle, diamètre du verre de 14 mm, revêtement en poly-D-Lysine | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Puits pour l’imagerie. ; |
| Logiciel Autodesk Fusion 360 | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Logiciel utilisé pour l’impression des supports. |
| BD 25 G 7/8 aiguilles stériles à usage unique 100 aiguilles/boîte | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | Pour les plaies induites expérimentalement aux globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Contre-coloration de la membrane cellulaire. Indicateur de calcium. Concentration de 1:10 000 avec une concentration finale de 1 % (v/v) de DMSO et de 0,1 % (p/v) d’acide pluronique |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | Pour fixer le support au puits d’imagerie |
| Imprimante 3D Ender 3 Pro ; | Creality (Shenzen, Chine) | N/A | Pour l’impression du support |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | Numéro de licence : GPL2 | Logiciel utilisé pour confirmer la cohérence de la profondeur et du diamètre de la plaie entre des globes indépendants à l’aide de l’analyse de la région d’intérêt |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Indicateur de calcium. Concentration 1:100 avec une concentration finale de 1 % (v/v) de DMSO et 0,1 % (p/v) d’acide pluronique |
| Kératinocytes Sans sérum moyen | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL d’extrait hypophysaire bovin, 0,02 nM d’EGF, 0,3 mM de CaCl2 et de pénicilline-streptomycine (100 unités/mL, 100 & micro ; g/mL, respectivement) ajoutés à une |
| solution saline tamponnée au phophate (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Utilisé pour éliminer l’excès de coloration des cornées avant l’imagerie |
| Microscope Zeiss Confocal 880 avec AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | objectif de grossissement 20x a été utilisé |
Références
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al.
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Réimpressions et autorisations
