Isolement de gouttelettes lipidiques de plastoglobule à partir de tissus foliaires végétaux et de cyanobactéries

Résumé

Un protocole rapide et efficace est présenté pour l’isolement des gouttelettes lipidiques plastoglobules associées à divers organismes photosynthétiques. La préparation réussie de plastoglobules isolés est une première étape cruciale qui précède les investigations moléculaires détaillées telles que les analyses protéomiques et lipidomiques.

Résumé

Les gouttelettes lipidiques de Plastoglobule sont un sous-compartiment dynamique des chloroplastes et des cyanobactéries des plantes. Présents partout parmi les espèces photosynthétiques, on pense qu’ils jouent un rôle central dans l’adaptation et le remodelage de la membrane thylakoïde dans des conditions environnementales en évolution rapide. La capacité d’isoler des plastoglobules de haute pureté a grandement facilité leur étude grâce à des méthodologies protéomiques, lipidomiques et autres. Avec des plastoglobules de grande pureté et de rendement, il est possible d’étudier leur composition lipidique et protéique, leur activité enzymatique et leur topologie protéique, entre autres caractéristiques moléculaires possibles. Cet article présente un protocole rapide et efficace pour l’isolement des plastoglobules à partir de chloroplastes de tissus foliaires végétaux et présente des variations méthodologiques pour l’isolement des plastoglobules et des structures de gouttelettes lipidiques apparentées à partir de feuilles de maïs, du tissu foliaire desséché de la plante de résurrection, Eragrostis nindensis, et de la cyanobactérie, Synechocystis . sp. PCC 6803. L’isolement repose sur la faible densité de ces particules riches en lipides, ce qui facilite leur purification par flottation de densité saccharose. Cette méthodologie s’avérera utile dans l’étude des plastoglobules de diverses espèces.

Introduction

La compréhension actuelle de la composition et de la fonction des plastoglobules a émergé grâce à des études protéomiques et lipidomiques détaillées 1,2,3,4,5. De telles études ont été grandement facilitées par une méthode d’isolement rapide et efficace qui repose sur leur très faible densité pour une séparation efficace à l’aide de gradients de saccharose. Les méthodes initiales d’isolement des plastoglobules ont été réalisées à partir d’espèces telles que le hêtre (Fagus sylvatica), le genêt à ba....

Protocole

1. Isolement brut de plastoglobules

1. Extraction brute de plastoglobule à partir de tissus foliaires de maïs non stressés
   1. Acquérir six plants de maïs sains âgés d’environ 3 semaines et presque au stade de croissance V5, pesant environ 120 g.
   2. Coupez toutes les feuilles à la base de la tige, plongez-les rapidement dans un bain de glace et transportez-les dans la chambre froide.
   3. En travaillant sous une lampe de sécurité verte, retirez les feuilles de maïs du bain de glace et coupez-les en morceaux plus petits (environ 5 cm x 5 cm) à l’aide de ciseaux.
   4. Broyer délicatement mais soigneusement la moitié du tiss....

Résultats

À la fin de l’étape 1 du protocole, on devrait être en mesure de voir facilement une quantité considérable de plastoglobules/gouttelettes lipidiques flottant sur (ou à proximité) de la couche supérieure du coussin de saccharose (figure 1B-C). D’autres fractions pourraient également être collectées à ce stade. Par exemple, les thylakoïdes seront granulés et pourront être remis en suspension avec un milieu R 0,2 pour des analyses ultérieures. Après centrifugat.......

Discussion

Pour minimiser les changements physiologiques / biochimiques du matériau et protéger certains pigments prényl-lipidiques photo- et thermo-labiles qui sont un composant riche des plastoglobules, il est essentiel d’effectuer l’isolement à 4 ° C et à l’abri de la lumière. Comme indiqué ci-dessus, les étapes initiales sont effectuées en chambre froide sous une lampe de sécurité à l’aide d’une ampoule à émission verte. Les étapes suivantes effectuées en laboratoire sont sous des lumières tamisées et utilisent de la glace ou u.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AEBSF	Milipore Sigma	P7626
Antipain.2HCl	Bachem	H-1765.0050BA
Aprotinine	Milipore Sigma	A6106
Ascorbate	BDH	BDH9242
Bestatin	Sigma Aldrich	B8385
Bêta-Glycérophosphate. 2Na5H2O	EMD Millipore	35675
Sérum bovin	Albumine proliante biologique	68700
Chymostatine	Sigma Aldrich	C7268
Eragrostis nindensis	N/A	N/A
E-64	Milipore Sigma	E3132
Cellule de pression française (modèle FA-079)	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Leupeptin	Sigma Aldrich	L2884
Chlorure de magnésium	Sigma Aldrich	M8266
Incubateur à secousses Multitron	Infors HT	N/A
Phospho-ramidon.2 Na	Sigma Aldrich	R7385
Hydroxyde de potassium	Fisher Chemicals	M16050
Réduit Cysteine	MP Biochemicals	101444
Fluorure de sodium	Sigma Aldrich	S7920
Ortho-vanadate de sodium	Sigma Aldrich	450243
; 10H2O	Sigma Aldrich	3850
Sorbitol	Sigma Aldrich	S3889
Saccharose	Sigma Aldrich	S9378
Sylvania 15 W Ampoule fluorescente à tube Gro-Lux, 18"	Walmart	N/A
Synechocystis sp. PCC 6803	N	/A N/A
Optima MAX-TL Ultracentrifugeuse	Beckman Coulter	A95761
Mélangeur Waring (1,2 L)	VWR	58977-227	Mélangeur professionnel
Zea mays	N/A	N/A

Pyrophosphate de sodium ·