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Article de méthode

Analyse de l’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T dans les lymphocytes T murins primaires par cytométrie en flux à spectre complet

5.1K vues

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DOI :

10.3791/64526

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16 décembre 2022

 ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado-Anschutz School of Medicine

Dans cet article

Résumé

L’afflux de calcium, une mesure de la signalisation des lymphocytes T, est un moyen efficace d’analyser les réponses à la stimulation des récepteurs des lymphocytes T. Ce protocole de multiplexage d’Indo-1 avec des panels d’anticorps dirigés contre les molécules de surface cellulaire tire parti des capacités très flexibles de la cytométrie en flux à spectre complet.

Résumé

L’afflux de calcium en réponse à la stimulation des récepteurs des lymphocytes T est une mesure courante de la signalisation des lymphocytes T. Plusieurs colorants indicateurs de calcium ont été développés pour évaluer la signalisation du calcium par cytométrie en flux passe-bande. Ce protocole est conçu pour mesurer les réponses calciques dans les cellules T murines primaires en utilisant la cytométrie en flux à spectre complet. Les splénocytes totaux sont marqués avec le colorant indicateur de calcium ratiométrique Indo-1, ainsi qu’un panel d’anticorps conjugués au fluorochrome contre les molécules de surface cellulaire. L’exploitation des capacités de la cytométrie en flux à spectre complet fournit une plate-forme pour utiliser un large éventail de colorations de surface cellulaire en combinaison avec Indo-1. Les cellules sont ensuite analysées en temps réel à 37 °C avant et après l’ajout d’un anticorps anti-CD3 pour stimuler le récepteur des lymphocytes T. Après avoir démélangé les signaux spectraux, le rapport de l’Indo-1 lié au calcium et de l’Indo-1 sans calcium est calculé et peut être visualisé au fil du temps pour chaque population fermée de splénocytes. Cette technique peut permettre l’analyse simultanée des réponses calciques dans plusieurs populations cellulaires.

Introduction

L’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T (TCR) est une mesure utile de l’activation des lymphocytes T et est fréquemment utilisé pour déterminer si une population de lymphocytes T a des réponses altérées dans les étapes proximales de la voie de signalisation TCR1. Les mesures de l’afflux de calcium sont généralement effectuées en pré-marquant les lymphocytes T avec un ou une paire de colorants indicateurs de calcium fluorescents, puis en examinant les signaux fluorescents en utilisant la cytométrie de flux en temps réel après réticulation TCR 2,3,4. Indo-1, un colorant calcique proportionnel, est excité par le laser UV avec des émissions de pointe à deux longueurs d’onde différentes en fonction de la liaison au calcium5, et est un colorant indicateur couramment utilisé pour l’analyse par cytométrie en flux des réponses calciques dans les lymphocytes vivants. Comme le profil d’émission d’Indo-1 est assez large, il peut être difficile de combiner l’évaluation de l’Indo-1 avec l’analyse simultanée de plusieurs marqueurs de surface cellulaire par cytométrie en flux passe-bande. Cette limitation limite l’utilisation de l’analyse par cytométrie en flux des réponses calciques aux populations pré-purifiées de lymphocytes T ou aux populations identifiées par un ensemble limité de molécules de surface cellulaire.

Pour remédier aux limites de la mesure des réponses calciques sur des populations hétérogènes de lymphocytes primaires à l’aide de la cytométrie en flux passe-bande, un protocole a été développé pour mesurer la fluorescence Indo-1 à l’aide de la cytométrie en flux à spectre complet. Cette méthode permet de multiplexer Indo-1 avec des panels d’anticorps dirigés contre les molécules de surface cellulaire, en tirant parti des capacités très flexibles de la cytométrie en flux à spectre complet. L’avantage de l’utilisation de la cytométrie en flux à spectre complet par rapport à la cytométrie en flux conventionnelle est sa capacité à distinguer les signaux fluorescents des colorants qui se chevauchent fortement, augmentant ainsi le nombre de marqueurs de surface qui peuvent être évalués simultanément dans chaque échantillon. La cytométrie de flux conventionnelle utilise des filtres passe-bande et est limitée à un fluorochrome par système de détection6. La cytométrie en flux à spectre complet recueille des signaux sur tout le spectre du fluorochrome à l’aide de 64 détecteurs sur un système de cytométrie spectrale en fluxà cinq lasers 7,8. De plus, la cytométrie en flux à spectre complet tire parti des détecteurs APD (Avalanche Photo Diode) qui ont une sensibilité accrue par rapport aux détecteurs à tube photomultiplicateur présents sur les cytomètres en flux conventionnels8. Par conséquent, cette approche est idéale pour les populations cellulaires hétérogènes, telles que les cellules mononucléées du sang périphérique ou les suspensions de cellules d’organes lymphoïdes secondaires murins, car elle élimine le besoin d’isoler des populations spécifiques de lymphocytes T avant le marquage du colorant calcique. Au lieu de cela, les profils d’expression des marqueurs de surface cellulaire et la cytométrie en flux après la collecte de données peuvent être utilisés pour évaluer les réponses au calcium dans chaque population d’intérêt. Comme le montre ce rapport, Indo-1 peut facilement être combiné avec huit anticorps conjugués au fluorochrome, ce qui donne un total de 10 signatures spectrales uniques. En outre, cette méthode peut être facilement appliquée à des mélanges de cellules de lignées de souris congéniquement distinctes, permettant l’analyse simultanée des réponses calciques dans les cellules T de type sauvage par rapport à celles d’une lignée de souris ciblant un gène.

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Protocole

Les souris ont été maintenues sur le campus médical Anschutz de l’Université du Colorado conformément aux protocoles de l’IACUC. Toutes les souris ont été euthanasiées selon les normes AAALAC.

1. Préparation des cellules immunitaires de la rate de souris

NOTE: Euthanasier les souris naïves avec l’euthanasie au CO2 . Les souris C57BL / 6 achetées aux laboratoires Jackson et élevées en interne sont utilisées pour des expériences à l’âge de 6 à 12 semaines. Les souris mâles et femelles sont utilisées pour des expériences.

  1. Désinfectez la peau de souris avec de l’éthanol à 70% afin de réduire la possibilité que des contaminants externes pénètrent dans l’échantillon.
  2. Disséquez la rate de la souris à l’aide d’outils de dissection, de ciseaux chirurgicaux et de forceps. Prélever la rate et placer la rate détachée dans un tube conique de 50 ml avec ~5 mL de milieu RPMI complet (cRPMI) sur de la glace.
    REMARQUE : L’IMRP complète est composée de 10 % de FBS, de 2 mM de L-glutamine et de 1 % de pénicilline/streptomycine.
    1. Pour récolter la rate de la souris, faites une incision de 5 cm dans la fourrure et la peau le long du côté gauche de la souris à mi-chemin entre les pattes avant et arrière avec des ciseaux. Ouvrez la cavité corporelle ~5 cm et retirez la rate à l’aide d’une pince. La rate a la couleur d’un haricot et est plus longue et plus plate que le rein voisin.
  3. Verser le contenu de l’étape 1.2 sur un filtre stérile de 70 μm fixé à un nouveau tube conique de 50 mL. Séparer mécaniquement la rate en une suspension unicellulaire en poussant la rate à travers le filtre à l’aide d’un piston de seringue de 5 ml jusqu’à ce qu’il ne reste plus de pulpe de rate sur la surface du filtre.
  4. Enduire les splénocytes à l’aide d’une centrifugeuse à rotor pivotant à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
  5. Décanter soigneusement le surnageant. Les splénocytes granulés restent au fond du tube conique de 50 mL.
  6. Pour éliminer les globules rouges, remettre en suspension les splénocytes granulés dans 1 mL de tampon de lyse ACK pendant 3 minutes selon les instructions du fabricant. Bien mélanger.
  7. Éteignez le tampon de lyse ACK avec 15 ml de cRPMI.
  8. Enduire les lymphocytes comme indiqué à l’étape 1.4.
  9. Resuspendre la suspension cellulaire dans 5 mL de cRPMI dans un tube conique de 50 mL. Placez les échantillons sur de la glace.
    1. Pour compter les cellules, transférer 10 μL de la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 0,6 mL et diluer à un rapport de 1:1 avec une solution de bleu de trypan. Ensuite, transférez-le vers un hémocytomètre ou un système automatisé de comptage cellulaire.
  10. Après comptage, en fonction de la concentration de la cellule dans la suspension cellulaire comme à l’étape 1.9, enduire les cellules dans une centrifugeuse de table à 500 x g à 4 °C pendant 5 minutes pour préparer l’ajout de milieu cRMPI contenant un colorant ester Indo-1 AM.
  11. Calculer le volume de remise en suspension des cellules pour atteindre 10-12 x 106 cellules/mL. Il s’agit d’une concentration de 2x du nombre total de cellules requis.
  12. Re-suspendre les cellules dans le volume de cRPMI calculé à l’étape 1.11. Placer les cellules à 37 °C contenant 5 % de CO2 dans un tube conique de 50 mL dont le couvercle est ventilé ou dans une plaque de culture tissulaire.

2. Colorant ratiométrique Indo-1 et marquage des anticorps fluorescents

  1. Selon les instructions du fabricant, ajouter 50 μL de DMSO dans un flacon contenant 50 μg d’Indo-1 AM. La concentration de la solution mère est de 1 μg/μL.
    REMARQUE: Le DMSO est fourni en micro-flacons avec le kit pour éviter toute oxydation du DMSO.
  2. Diluer l’aliquote mère (1 μg/μL) dans le volume expérimental approprié (établi au point 1.11) de cRPMI à une concentration de 6 μg/mL, soit une concentration de 2x. Ne conservez pas Indo-1 dans une solution aqueuse.
    REMARQUE: D’autres tampons contenant du calcium ajouté peuvent être utilisés en fonction des besoins cellulaires.
  3. Mettre de côté le média complet avec Indo-1 au bain-marie à 37 °C.
    REMARQUE: Utilisez la concentration minimale d’ester Indo-1 AM nécessaire pour obtenir un signal adéquat. Cela doit être titré pour différents types de cellules. En règle générale, une concentration comprise entre 3 et 5 μM est suffisante. Pour les lymphocytes T primaires, charger des cellules avec de l’Indo-1 à une concentration de >5 μg/mL augmente l’intensité fluorescente moyenne (ICM) au-dessus d’un log de 6 sur les cytomètres de flux spectral. Si cela se produit, diminuez l’intensité du laser UV et titrez l’Indo-1 à une concentration plus faible.
  4. Diluer la suspension cellulaire préalablement préparée (à l’étape 1.12), 1:1 dans cRPMI, y compris les 2x milieux Indo-1 fabriqués à l’étape 2.2. Assurez-vous que les cellules sont à une concentration comprise entre 5-6 x 106/mL.
    REMARQUE: Ne chargez pas de colorant les contrôles de contrôle de tache unique non colorés ou de cellules de coloration simples de marqueur de surface avec Indo-1. L’ajout d’Indo-1 à des contrôles d’anticorps à coloration unique créera un échantillon multicolore en raison de l’Indo-1 ajouté aux cellules colorées uniques. Inclure indo-1 (sans calcium) EGTA contrôle ajouté à la plaque d’échantillonnage créée à l’étape 2.6.
  5. Ajouter 1 mL de cellules/puits/état expérimental dans une plaque de culture tissulaire de 12 puits.
  6. Créer un seul témoin coloré pour l’échantillon d’Indo-1 (sans calcium) en utilisant des cellules précédemment chargées de colorant Indo-1 et ajouter de l’EGTA à une concentration finale de 2 mM. L’EGTA chélate le calcium dans la suspension cellulaire, ce qui donne un échantillon témoin plus propre.
    1. Créer un témoin positif Indo-1 (Indo-1 lié au calcium) en ajoutant 50 μM d’ionomycine à la suspension cellulaire chargée de colorant au cytomètre en flux. L’ionomycine est un ionophore de calcium perméable à la membrane qui lie les ions calcium et facilite le transfert des ions calcium dans les cellules.
  7. Créer un puits pour le contrôle biologique négatif sans fluorophores ni colorant Indo-1.
  8. Créer un puits pour les contrôles de coloration unique pour toute population cellulaire supplémentaire d’intérêt (anticorps définis par l’utilisateur) en utilisant des fluorophores conjugués d’anticorps dans une conception de panel de cytométrie en flux. Ceux-ci n’incluront pas le colorant ratiométrique Indo-1.
  9. Ajouter l’anticorps bloquant le récepteur Fc (~2 μg/1 x 106 cellules), conformément aux instructions du fabricant, avant d’ajouter des anticorps conjugués au fluorochrome supplémentaires pour la coloration de surface.
  10. Incuber la plaque pendant 45 min à 37 °C avec 5% de CO2.
  11. Remettez les cellules en suspension dans une plaque de 12 puits en tapotant doucement la plaque toutes les 15 minutes.
  12. Mélanger et retirer tout le volume de cellules en suspension dans le média de la plaque à 12 puits. Ajoutez ensuite la suspension cellulaire à des tubes microcentrifugés de 1,7 mL.
  13. Enduire les cellules dans une microcentrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à température ambiante. Décanter le surnageant et laver les cellules en ajoutant 1 mL de cRPMI préchauffé. Pelleter à nouveau et décanter le surnageant.
    REMARQUE: Le lavage des cellules élimine tout anticorps bloquant le FC restant.
  14. Resuspendre les cellules dans 1 mL de cRPMI dans des tubes microcentrifugeuses de 1,7 mL et incuber chaque tube à 37 °C pendant 30 minutes supplémentaires à 5 % de CO2, en laissant le haut du tube légèrement ouvert pour permettre l’échange gazeux. Cela permet une estérification complète des esters AM intracellulaires.
  15. Transférez les cellules dans une plaque de culture tissulaire à 12 puits, si nécessaire. D’autres anticorps conjugués fluorochromes titrés définis par l’utilisateur peuvent être ajoutés lors d’une phase de repos.
    REMARQUE : Les marqueurs utilisés dans le panneau des méthodes sont les suivants : Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 et CD1d/α-galcer tetramer. Les marqueurs sont choisis pour analyser les sous-ensembles de lymphocytes T.
    1. Créer un mélange principal de tous les anticorps conjugués au fluorochrome définis par l’utilisateur en fonction des types de cellules d’intérêt à un volume précédemment titré dans un tube microcentrifuge de 1,7 mL.
    2. Ajouter un mélange maître calculé pour 1 mL du volume cellulaire, en fonction des anticorps titrés dirigés contre les cellules au repos.
      NOTE: L’avantage de la coloration à l’étape 2.15 au lieu de l’étape 2.18 ultérieure est que la coloration à l’étape 2.15 réduira le temps d’incubation global de l’expérience. Cependant, la coloration dans un volume total de 1 mL à l’étape 2.15 augmente l’utilisation d’anticorps.
  16. Après repos, pelleter les cellules à 500 x g pendant 5 min à température ambiante.
    REMARQUE: Les cellules d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits peuvent être granulées dans la plaque avec un accessoire de centrifugeuse à plaque. Sinon, enfouissez les cellules dans un tube microcentrifuge de 1,7 mL.
  17. Laver les cellules en remettant la pastille en suspension dans 1 mL de cRPMI froid à 4 °C et granuler à nouveau les cellules comme à l’étape 2.16. Placez les cellules sur de la glace.
    REMARQUE: Si les cellules de coloration de surface séparément, post-deestérification à l’étape 2.18, moins de volume d’anticorps est nécessaire. La coloration de surface à cette étape peut être effectuée après la phase de repos dans un tampon d’écoulement à froid (1x DPBS avec ajout de 1% FBS), en utilisant des anticorps définis par l’utilisateur, sur glace pendant 30 min. Lavez les cellules après la coloration dans cRPMI comme à l’étape 2.17.
    1. Ajouter la coloration de viabilité Ghost540 diluée 1:7,500 dans DPBS aux échantillons conformément aux instructions du fabricant. La chaleur tue les cellules à 55 °C sur un bloc chauffant pour un contrôle vivant / mort non coloré.
      REMARQUE: La coloration fonctionnelle de viabilité pour éliminer les cellules mortes dans l’analyse cytométrique en flux est effectuée sans FBS. FBS peut interagir avec les colorants amines selon les instructions du fabricant.
  18. Resuspendre les échantillons individuels dans 500 μL de cRPMI (phénol rouge) à l’aide d’un tube d’écoulement en polystyrène de 5 mL muni d’un bouchon.
    REMARQUE: Les cellules peuvent être laissées à 4 ° C jusqu’à une heure.
  19. Réchauffer chaque tube de 5 mL contenant des cellules, individuellement, à 37 °C à l’aide d’un bain de billes pendant 7 minutes avant l’analyse sur le cytomètre en flux en maintenant un temps constant entre les échantillons. Utilisez une minuterie.

3. Tube de bain de perles: maintien de la température pendant l’analyse du flux de calcium

  1. Ajouter des perles de bain à un petit bain-marie, sans ajouter d’eau; chauffer à 37 °C.
  2. Couper soigneusement un tube conique de 50 ml en deux, à la marque de 25 ml, avec une lame de rasoir; Jetez le haut du tube.
  3. Remplissez le tube coupé en deux aux 3/4 du chemin avec des perles de bain.
  4. Placez le tube créé à l’étape 3.2 dans le bain de billes créé à l’étape 3.1. Porter le tube et les perles à 37 °C.
  5. Branchez le bain de billes dans une prise électrique à côté du cytomètre en flux afin de maintenir la température en préparation de l’analyse de l’échantillon.
  6. Ajouter une grille conique en polystyrène coupé de 50 ml pour maintenir un tube afin de positionner le tube en place pendant qu’il fonctionne sur le cytomètre en flux. Cela éliminera le besoin de maintenir manuellement le tube pendant toute la durée de l’analyse de la courbe.

4. Acquisition de l’afflux de calcium par analyse cytométrique en flux

  1. Connectez-vous au logiciel de cytomètre en flux sur un analyseur de flux.
  2. Cliquez sur l’onglet Bibliothèque pour ajouter des étiquettes fluorescentes Indo-1 (liées au calcium) et Indo-1 (sans calcium). Sélectionnez Étiquettes fluorescentes dans le menu du logiciel à gauche. Sélectionnez Laser UV sous les groupes de balises fluorescentes et cliquez sur +ajouter pour ajouter un nom d’étiquette fluorescente (Indo-1 (lié au calcium)/Indo-1 (sans calcium)) à la bibliothèque. Choisissez la longueur d’onde d’excitation laser et la longueur d’onde d’émission, puis cliquez sur Enregistrer. Passez à la configuration expérimentale.
    REMARQUE: Indo-1 est excité par le laser UV à une longueur d’onde de 355 nm. La longueur d’onde d’émission d’Indo-1 (liée au calcium) est de 372 nm. La longueur d’onde d’émission d’Indo-1 (sans calcium) est de 514 nm.
  3. Cliquez sur l’onglet Acquisition. Ouvrir/créer une nouvelle expérience et ajouter les étiquettes fluorescentes souhaitées à l’expérience.
  4. Créez un groupe de référence et un ou plusieurs nouveaux groupes d’échantillons pour l’expérience. Étiquetez à la fois les échantillons et les groupes de référence au besoin.
  5. Sous l’onglet Acquisitions , définissez les événements à enregistrer au maximum : 10 000 000.
  6. Réglez le volume d’arrêt au volume maximal : 3 000 μL.
  7. Réglez le temps d’arrêt sur le temps maximum : 36 000 s.
  8. Acquérir des contrôles à coloration unique pour des anticorps conjugués définis inclus dans le panneau multicolore.
  9. Acquérir des commandes colorées simples pour le colorant fonctionnel Indo-1.
    1. Ajouter 50 μM d’ionomycine au témoin positif Indo-1 lié au calcium. Vortex à mélanger. Ajoutez le tube d’écoulement au port d’injection de l’échantillon et cliquez sur Enregistrer.
    2. Ajoutez le contrôle négatif Indo-1 sans calcium au cytomètre en flux et cliquez sur Enregistrer. EGTA a été ajouté à l’étape 2.6.
    3. Démélangez les commandes colorées simples en cliquant sur le bouton Unmix .
      REMARQUE : Tous les témoins colorés de tous les anticorps conjugués et colorants fonctionnels doivent être enregistrés avant le démélange des échantillons. Pour que le bouton Dissocier fonctionne, tous les contrôles de référence doivent d’abord être enregistrés. Le démélange peut être effectué avant ou après le prélèvement de l’échantillon.
  10. Une fois le démixage terminé, créez des tracés séquentiels à l’aide de la feuille de calcul non mélangée. SSC-A versus FSC-A enlevant les débris de l’échantillon, SSC-A versus SSC-H pour enlever les doublets. Cette étape est suivie d’une barrière de nettoyage de la viabilité ainsi que d’autres points de contrôle sur les populations d’intérêt. Pour créer des portes, cliquez sur Plot. Ajoutez un graphique à la feuille de calcul et double-cliquez à l’intérieur de la porte pour créer une population fermée en aval. Continuez jusqu’à ce que toutes les populations d’intérêt soient prises en compte.
  11. Échantillons témoins chauds à coloration unique (des étapes 2.6-2.9 de la section Colorant ratiométrique indo-1 et marquage des anticorps fluorescents) à 37 °C pour analyse séquentielle. Configurez le logiciel de cytométrie en flux.
  12. Faites couler de l’eau DI sur le cytomètre pendant 2-3 minutes pour assurer la stabilité fluidique du cytomètre en flux.
  13. Configurez des tracés séquentiels sur la feuille de calcul non mélangée en créant des portes à l’aide des boutons de porte Polygone, Rectangle ou Ellipse. Point de contrôle pour inclure la population d’intérêt (c.-à-d. lymphocytes utilisant SSC-A vs FSC-A [discrimination de taille/lymphocytes ]). Les populations négatives apparaissent regroupées autour de zéro alors que les populations positives peuvent être visualisées en augmentant l’IMF. Les populations d’intérêt seront définies par l’utilisateur en fonction de la question biologique.
  14. Double-cliquez à l’intérieur de la porte créée et remplacez les paramètres de l’axe Y et de l’axe X par SSC-A par rapport à SSC-H (discrimination singulet). Terminez la définition des paramètres de l’axe en cliquant avec le bouton gauche de la souris sur les mots de l’axe.
  15. Créez un tracé avec le signal SSC-A par rapport au colorant de viabilité (paramètres de la porte de viabilité). Porte sur les cellules vivantes, qui sont négatives pour la coloration au colorant amine. Les cellules vivantes, négatives pour la coloration vivante morte, se regrouperont à la marque 0 sur les axes Y et X.
  16. Double-cliquez sur le graphique intérieur pour créer un nouveau graphique contenant uniquement des lymphocytes vivants unicellulaires. Changez l’axe des Y en Indo-1 (calcium-lié) (V1) et/ou Indo-1 (calcium libre) (V7) en fonction du temps sur l’axe des X pour visualiser l’afflux de calcium.
  17. Placer l’échantillon biologique chauffé sur le SIT de la machine et exécuter les échantillons à 2 500-3 000 événements/s sur un milieu pour permettre la visualisation de l’afflux de calcium dans des populations à nombre limité de cellules (par exemple, iNKT).
    REMARQUE : En remettant les cellules en suspension à une concentration de 1 x 106/mL, les événements cellulaires recueillis à un débit moyen devraient être égaux à 2 500-3 000 événements/s. Réduisez le débit sous contrôle d’acquisition en cliquant sur le menu déroulant ou diluez l’échantillon si la suspension cellulaire a une concentration accrue. L’exécution des échantillons à un débit élevé peut augmenter la propagation du signal d’un fluorophore à d’autres fluorophores dans le panneau.
  18. Ajouter le tube suivant au bain de perles pour le réchauffer à 37 °C.
  19. Dans le contrôle d’acquisition, appuyez sur Enregistrer pour enregistrer les données initiales pendant 30 s afin d’obtenir un niveau basal de signalisation calcique dans l’échantillon.
  20. Dans le contrôle d’acquisition, cliquez sur Arrêter et retirez le tube du port d’injection d’échantillon (SIP).
  21. Ajouter 30 μg d’anti-CD3 non conjugué directement dans le tube à échantillon pour initier l’afflux de calcium. La concentration finale par tube est de 60 μg/mL.
    REMARQUE: Il n’y a pas d’étape de lavage après l’ajout d’anti-CD3.
  22. Replacez le tube sur la machine SIP le plus rapidement possible et appuyez sur Enregistrer dans le logiciel.
  23. Enregistrer les données pendant 7 min, en observant le temps écoulé sous les contrôles d’acquisition dans le logiciel, pour observer l’évolution temporelle de l’afflux de calcium dans les populations échantillons.
  24. Après 7 min, appuyez sur Arrêter dans le logiciel et ajoutez 1 μg/mL d’ionomycine. Enregistrer pendant 30 s pour obtenir le signal maximum de calcium dans les cellules d’intérêt. Pour limiter le transfert de l’ionomycine dans l’échantillon suivant, effectuez deux rinçages SIT sur l’instrument entre les échantillons.
  25. Passez à l’échantillon suivant et répétez le workflow jusqu’à ce que tous les échantillons aient été collectés.
  26. Enregistrez l’expérience et cliquez sur le fichier zip d’exportation . Les fichiers non mélangés (.fsc) sont téléchargés vers un logiciel externe d’analyse de cytométrie en flux.

5. Analyse de la courbe calcique

  1. À l’aide d’un logiciel d’analyse6 pour la cytométrie en flux, convertissez les signaux fluorescents Indo-1 en un rapport pour les mesures de calcium en accéléré. Dérivez des paramètres sous l’onglet Outils en insérant les références Indo-1 (lié au calcium)/Indo-1 (calcium libre) à l’aide d’une échelle linéaire. Réglez le minimum à zéro et le maximum en fonction du rapport d’afflux de calcium, généralement autour de 10. Le rapport maximum varie selon le type de cellule et l’IMF d’Indo-1.
  2. Mettez en surbrillance le paramètre sélectionné. Sous outils, ajoutez l’analyse cinétique pour choisir le paramètre en cliquant sur l’onglet Cinétique . Définissez l’axe Y sur dérivé.
  3. Sélectionnez MFI (intensité fluorescente moyenne) dans l’onglet Cinétique.
  4. Ajoutez un lissage gaussien, si vous le souhaitez. Pour ajouter un lissage gaussien, sélectionnez l’option dans le menu déroulant des statistiques du logiciel d’analyse de flux. Un lissage gaussien peut être ajouté pour lisser la visualisation de la courbe d’afflux de calcium de l’analyse.
  5. Créer plusieurs plages pour les statistiques le long du flux de calcium pour les comparaisons biologiques dans les échantillons.
  6. Faites glisser les exemples dans l’éditeur de mise en page et ajoutez les statistiques comme vous le souhaitez. L’analyse statistique varie en fonction de la question biologique. À des fins de publication, plusieurs répétitions sont analysées à l’aide du test t ou de l’ANOVA.
  7. Pour une analyse de moment de temps, placez la porte sur un moment précis dans le temps le long du flux de calcium. Examiner les marqueurs de surface souhaités et la porte sur la population d’intérêt; Ensuite, évaluez un diagramme de points bidimensionnel d’Indo-1 (sans calcium) par rapport à Indo-1 (lié au calcium) pour les cellules fermées à ce moment dans la région temporelle.

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Résultats

Le flux de travail expérimental pour évaluer les réponses au calcium dans les cellules T murines primaires à l’aide d’un colorant ratiométrique Indo-1 avec des taches de surface multiplexantes est illustré à la figure 1. Après avoir récolté et traité les splénocytes de souris en une seule suspension cellulaire, les cellules sont colorées avec un ester Indo-1 AM et colorées en surface avec des anticorps liés au fluorochrome. Une fois la charge du colorant et la coloration des anticorps termin...

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Discussion

Ce protocole décrit un dosage optimisé conçu pour mesurer les réponses calciques dans les lymphocytes T murins primaires chargés de colorant indicateur ratiométrique Indo-1 titré en utilisant la cytométrie en fluxà spectre complet 7,8. L’avantage d’effectuer des tests de flux de calcium à l’aide de la cytométrie en flux à spectre complet est la capacité de multiplexer la coloration des marqueurs cellulaires de surface en combinaison avec l’évaluation de la fluore...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à déclarer.

Remerciements

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Un grand merci à nos collègues de Cytek pour les discussions continues sur l’analyse cytométrique spectrale complète sur les logiciels Aurora et SpectroFlo. Les figurines ont été créées avec BioRender.com.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
12 plaques traitées TCCell Treat229111
50 mL coniqueGreiner Bio141-12-17-0350 mL Tubes à centrifuger en polypropylène avec bouchon
Tubes d’écoulement en polystyrène de 5 mLSeringue Corning352052
5 mLSeringue BD309646piston seul est utilisé sheith est jeté
Filtre 70uMGreiner bio1542070
aCD3 (17A2)Biolegend100202
AKC lysis BufferGibcoA1049201
Aurora Spectral Flowcytometerhttps://cytekbio.com/pages/aurora
Bath BeadscoleparmerArticle # UX-06274-52
CD19 PETonbo50-0193-U100
CD1d Tetramer APCNIH
CD25 PECy7ebioscience15-0251
CD4 APC Cy7Tonbo25-0042-U100
CD8a FITCebioscience11-0081-85
Incubateurcellulaire Formel
Scientifique Dissection Outils PinceMcKesson#487593Pince à tissus McKesson Adson 4-3/4 pouce de longueur Acier inoxydable de bureau Non stérile Non verrouillable Poignée de pouce 1 x 2 dents
Outils de dissection CiseauxMcKesson#970135Ciseaux opératoires McKesson Argent&trade ; 4-1/2 pouce de qualité chirurgicale Poignée annulaire en acier inoxydable Pointe pointue droite / Pointe pointue
DPBS 1xGibco14190-136DPBS  ;
EGTAFisherNC1280093
FBSHyclondSH30071.03lot AE29165301
FlowJo Softwarehttps://www.flowjo.com/
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Vi-Cell Blu Reagent Pack N° de produit : C06019Comprend Tripan
Vi-Cell BluBeckman Coulter
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Références

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