Analyse de l’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T dans les lymphocytes T murins primaires par cytométrie en flux à spectre complet

Résumé

L’afflux de calcium, une mesure de la signalisation des lymphocytes T, est un moyen efficace d’analyser les réponses à la stimulation des récepteurs des lymphocytes T. Ce protocole de multiplexage d’Indo-1 avec des panels d’anticorps dirigés contre les molécules de surface cellulaire tire parti des capacités très flexibles de la cytométrie en flux à spectre complet.

Résumé

L’afflux de calcium en réponse à la stimulation des récepteurs des lymphocytes T est une mesure courante de la signalisation des lymphocytes T. Plusieurs colorants indicateurs de calcium ont été développés pour évaluer la signalisation du calcium par cytométrie en flux passe-bande. Ce protocole est conçu pour mesurer les réponses calciques dans les cellules T murines primaires en utilisant la cytométrie en flux à spectre complet. Les splénocytes totaux sont marqués avec le colorant indicateur de calcium ratiométrique Indo-1, ainsi qu’un panel d’anticorps conjugués au fluorochrome contre les molécules de surface cellulaire. L’exploitation des capacités de la cytométrie en flux à spectre complet fournit une plate-forme pour utiliser un large éventail de colorations de surface cellulaire en combinaison avec Indo-1. Les cellules sont ensuite analysées en temps réel à 37 °C avant et après l’ajout d’un anticorps anti-CD3 pour stimuler le récepteur des lymphocytes T. Après avoir démélangé les signaux spectraux, le rapport de l’Indo-1 lié au calcium et de l’Indo-1 sans calcium est calculé et peut être visualisé au fil du temps pour chaque population fermée de splénocytes. Cette technique peut permettre l’analyse simultanée des réponses calciques dans plusieurs populations cellulaires.

Introduction

L’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T (TCR) est une mesure utile de l’activation des lymphocytes T et est fréquemment utilisé pour déterminer si une population de lymphocytes T a des réponses altérées dans les étapes proximales de la voie de signalisation TCR¹. Les mesures de l’afflux de calcium sont généralement effectuées en pré-marquant les lymphocytes T avec un ou une paire de colorants indicateurs de calcium fluorescents, puis en examinant les signaux fluorescents en utilisant la cytométrie de flux en temps réel après réticulation ^TCR

Protocole

Les souris ont été maintenues sur le campus médical Anschutz de l’Université du Colorado conformément aux protocoles de l’IACUC. Toutes les souris ont été euthanasiées selon les normes AAALAC.

1. Préparation des cellules immunitaires de la rate de souris

NOTE: Euthanasier les souris naïves avec l’euthanasie au CO₂ . Les souris C57BL / 6 achetées aux laboratoires Jackson et élevées en interne sont utilisées pour des expériences à l’âge de 6 à 12 semaines. Les souris mâles et femelles sont utilisées pour des expériences.

1. Désinfectez la peau de souris avec de l’éthanol à 70% afi....

Résultats

Le flux de travail expérimental pour évaluer les réponses au calcium dans les cellules T murines primaires à l’aide d’un colorant ratiométrique Indo-1 avec des taches de surface multiplexantes est illustré à la figure 1. Après avoir récolté et traité les splénocytes de souris en une seule suspension cellulaire, les cellules sont colorées avec un ester Indo-1 AM et colorées en surface avec des anticorps liés au fluorochrome. Une fois la charge du colorant et la coloration des anticorps termin.......

Discussion

Ce protocole décrit un dosage optimisé conçu pour mesurer les réponses calciques dans les lymphocytes T murins primaires chargés de colorant indicateur ratiométrique Indo-1 titré en utilisant la cytométrie en flux^à spectre complet ^7,8. L’avantage d’effectuer des tests de flux de calcium à l’aide de la cytométrie en flux à spectre complet est la capacité de multiplexer la coloration des marqueurs cellulaires de surface en combinaison avec l’évaluation de la fluore.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
12 plaques traitées TC	Cell Treat	229111
50 mL conique	Greiner Bio1	41-12-17-03	50 mL Tubes à centrifuger en polypropylène avec bouchon
Tubes d’écoulement en polystyrène de 5 mL	Seringue Corning	352052
5 mL	Seringue BD	309646	piston seul est utilisé sheith est jeté
Filtre 70uM	Greiner bio1	542070
aCD3 (17A2)	Biolegend	100202
AKC lysis Buffer	Gibco	A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer	https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads	coleparmer	Article # UX-06274-52
CD19 PE	Tonbo	50-0193-U100
CD1d Tetramer APC	NIH
CD25 PECy7	ebioscience	15-0251
CD4 APC Cy7	Tonbo	25-0042-U100
CD8a FITC	ebioscience	11-0081-85
Incubateur	cellulaire Formel
Scientifique Dissection Outils Pince	McKesson	#487593	Pince à tissus McKesson Adson 4-3/4 pouce de longueur Acier inoxydable de bureau Non stérile Non verrouillable Poignée de pouce 1 x 2 dents
Outils de dissection Ciseaux	McKesson	#970135	Ciseaux opératoires McKesson Argent&trade ; 4-1/2 pouce de qualité chirurgicale Poignée annulaire en acier inoxydable Pointe pointue droite / Pointe pointue
DPBS 1x	Gibco	14190-136	DPBS  ;
EGTA	Fisher	NC1280093
FBS	Hyclond	SH30071.03	lot AE29165301
FlowJo Software	https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye	ebioscience	65-085-39	Calcium Loading Dye  ;
ionomycine	Millipore	407951-1mg
Live/Dead Ghost 540	Tonbo	13-0879-T100
Tubes de microcentrifugation 1,7 mL	Light Labs	A-7001
Pénicilline/Streptomycine/L-Glutamine	Gibco	10378-016
PRN694	Med Chem Express	Hy-12688
Anti-souris purifié CD16/CD32 (FC Shield) ( 2.4G2)	Tonbo	70-0161-M001	FC Bloc
RPMI	Gibco	1875093	;+ rouge phénol
RPMI sans phénol	Gibco	11835030	--phénol rouge
Centrifugeuse de table	Beckman Coulter	Allegra612
TCR&beta ; PerCP Cy5.5	ebioscience	45-5961-82
TCR&gamma ;/&delta ; Pe Cy5	ebioscience	15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack N		° de produit : C06019	Comprend Tripan
Vi-Cell Blu	Beckman Coulter
Waterbath	Fisher Brand Bain

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