Imagerie par autofluorescence pour évaluer la physiologie des algues rouges

Résumé

Le présent protocole décrit l’imagerie par autofluorescence étape par étape et l’évaluation des changements phycobiliprotéiques dans les algues rouges sur la base d’une analyse spectrale. Il s’agit d’une méthode non marquée et non destructive pour évaluer l’adaptation cellulaire à des habitats extrêmes, lorsque seul du matériel rare est disponible et que les cellules se développent lentement, voire pas du tout, dans des conditions de laboratoire.

Résumé

Les algues rouges (Rhodophyta) contiennent des phycobiliprotéines et colonisent les habitats avec une faible lumière, mais certaines (par exemple, certaines espèces de Chroothece ) peuvent également se développer en plein soleil. La plupart des rhodophytes sont rouges, mais certains peuvent apparaître bleutés, selon la proportion de biliprotéines bleues et rouges (phycocyanine et phycoérythrine). Différentes phycobiliprotéines peuvent capturer la lumière à différentes longueurs d’onde et la transmettre à la chlorophylle a, ce qui rend possible la photosynthèse dans des conditions lumineuses très différentes. Ces pigments réagissent aux changements de l’habitat dans la lumière, et leur autofluorescence peut aider à étudier les processus biologiques. En utilisant Chroothece mobilis comme organisme modèle et le mode spectral lambda scan dans un microscope confocal, l’adaptation des pigments photosynthétiques à différentes lumières monochromatiques a été étudiée au niveau cellulaire pour deviner les conditions de croissance optimales de l’espèce. Les résultats ont montré que, même lorsque la souche étudiée était isolée d’une grotte, elle s’adaptait à des intensités lumineuses faibles et moyennes. La méthode présentée est particulièrement utile pour étudier les organismes photosynthétiques qui ne se développent pas ou se développent très lentement dans des conditions de laboratoire, ce qui est généralement le cas pour ceux qui vivent dans des habitats extrêmes.

Introduction

Les algues rouges, comme le genre Chroothece, peuvent pousser dans des habitats extrêmes, où elles doivent souvent faire face à des changements environnementaux marqués¹. Les inondations et les sécheresses sont fréquentes dans les régions semi-arides où ce genre peut être trouvé, et certaines espèces ont été signalées dans les ruisseaux, les falaises, les grottes, ou même les eaux thermales². Cependant, la plupart du temps, des variables biologiques, telles que la compétition ou le pâturage, relèguent les espèces à des conditions non optimales pour leur croissance. Comme ces organismes sont souvent difficiles à cultiver et qu’ils ne se développent pas ou se développent très lentement dans des conditions de laboratoire, une limitation majeure est la taille de l’échantillon disponible. Par conséquent, il est très important de suivre des méthodes non destructives ou des méthodes qui impliquent une manipulation minimale des échantillons ^3,4.

Les compétences physiologiques nécessaires pour survivre dans ces environnements difficiles peuvent être surveillées en suivant les changements dans leurs systèmes photosynthétiques. Les mécanismes métaboliques, l’efficacité photosynthétique et la sensibilité à la lumière ou aux conditions de culture peuvent être révélés par les profils d’émission de fluorescence pigmentaire, en raison de changements précis dans leur transfert d’énergie ou piégeage 5,6,7,8.

L’autofluorescence des composés cellulaires peut être utilisée comme marqueur pour le cytodiagnostic ou comme indicateur naturel de l’état cellulaire ou du métabolisme en réponse à des signaux externes et internes par des changements dans l’émission⁹. Il peut également être utilisé pour discriminer taxonomiquement différents groupes d’organismes photosynthétiques¹⁰. Selon la position phylogénétique des microorganismes phototrophes, on peut trouver différentes caractéristiques de fluorescence in vivo. Par conséquent, une identification taxonomique basée sur les caractéristiques in vivo de la fluorescence phototrophique (y compris les spectres d’absorption et d’émission de fluorescence) a été tentée à plusieurs reprises^11,12. En raison de la diversité des pigments accessoires parmi les taxons de phytoplancton, les différences dans les longueurs d’onde auxquelles la fluorescence de la chlorophylle a (Chl a) est stimulée, ou les différences dans les spectres d’émission, peuvent être utilisées pour déduire la taxonomie¹³. L’excitation de fluorescence in vivo et les spectres d’émission de ces spécimens reposent non seulement sur les phylums des algues, mais aussi sur l’adaptation du photosystème¹⁴. L’efficacité du transfert d’énergie à Chl a, ou le rapport de Chl a aux pigments accessoires, et la teneur en pigments cellulaires sont sensibles aux conditions de croissance⁵.

Les algues rouges, en particulier Chroothece, ont plusieurs pigments fluorescents accessoires - phycobiliprotéines et caroténoïdes; Les premiers se concentrent dans des phycobilisomes attachés aux thylakoïdes des chloroplastes. Les phycobiliprotéines (phycocyanine, phycoérythrine et allophycocyanine) peuvent capter la lumière à différentes longueurs d’onde et la transmettre à Chl a, ce qui rend possible la photosynthèse dans des conditions de lumière et de culture très différentes¹⁵. Par exemple, les espèces de Chroothece peuvent pousser à l’intérieur des grottes ou presque émerger dans des cours d’eau calcaires légèrement salins².

Les lumières monochromatiques affectent la croissance et la composition pigmentaire des organismes photosynthétiques et ont été étudiées pour prévenir ou contrôler la croissance des organismes photosynthétiques dans les grottes. Mulec et al. ont montré que l’éclairage enrichi en rouge favorise la croissance des cyanobactéries, des algues et des plantes¹⁶. Des études antérieures ont également rapporté que la lumière verte affecte la composition pigmentaire des cyanobactéries¹⁷, tandis que d’autres ont révélé que la lumière verte empêche la croissance de la plupart des organismes photosynthétiques et que certaines cyanobactéries présentent une réduction des thylakoïdes et une intensité de fluorescence moyenne^{plus faible 18}.

Pour comprendre la capacité de Chroothece en tant qu’organisme modèle à surmonter des conditions difficiles, des cellules en culture ont été exposées à des intensités lumineuses croissantes et à une lumière monochromatique (verte ou rouge)¹⁵, pour voir comment elle fait face aux conditions sombres des grottes (où la lumière rouge prédomine). Le protocole présenté ici reproduit l’effet des variables susmentionnées sur les phycobiliprotéines de Chroothece au niveau cellulaire en utilisant sa propre autofluorescence.

De nos jours, la fluorescence est couramment utilisée comme outil pour étudier les réponses physiologiques des plantes vasculaires, des microalgues, des macroalgues et des cyanobactéries^13,14,16. La microscopie confocale spectrale à fluorescence est un excellent outil pour les études in vivo visant à évaluer la physiologie des échantillons photosynthétiques au niveau de la cellule unique 10,17,18,19,20^, en évitant les problèmes liés au faible taux de croissance en laboratoire et les difficultés à obtenir suffisamment de biomasse pour les méthodes d’extraction et biochimiques associées⁸ . Une fois que les cellules sont traitées dans différentes conditions de culture pendant 2 semaines, le profil de scintigraphie lambda peut être mesuré in vivo. Bien qu’il existe plusieurs publications dans lesquelles différentes longueurs d’onde d’excitation par imagerie confocale ont été utilisées 3,4,10,17, la plupart des phycobiliprotéines et Chl a peuvent être détectées à l’aide d’une raie d’excitation de longueur d’onde de 561 nm^, et l’émission détectée varie de 570 à ⁷⁶⁰ nm de longueur d’onde. Ces critères ont été basés sur une analyse préalablement réalisée¹⁰ avec des pigments purs commerciaux (Tableau 1) par imagerie confocale et les résultats obtenus chez différentes espèces d’algues20,21,22.

Pigments	λFLMAX (nm)	λ exc (nm)
		351	364	458	476	488	514	543	633
Chl a	660.9-678.1	43,4 ± 1,8	11,2 ± 0,2	1,8 ± 0,05	2,0 ± 0,08	12,2 ± 0,7	6,0 ± 0,3	4,2 ± 0,16	80,7 ± 1,5
R-PE	569.2-583.3	5,9 ± 0,6	5,9 ± 0,16	11,1 ± 0,04	42,2 ± 0,3	100,0 ± 0	90,0 ± 0,3	99,2 ± 0,08	-
	652.1-668.6	-	-	1,5 ± 0,01	3,7 ± 0,04	26,7 ± 0,5	8,7 ± 0,16	11,1 ± 0,16	11,3 ± 0,2
C-PC	636.2-676.4	2,3 ± 0,04	1,0 ± 0,01	0,6 ± 0,004	0,7 ± 0,008	2,0 ± 0,08	2,0 ± 0,04	3,3 ± 0,16	33,6 ± 0,9
APC-XL	667.3-683.8	15,1 ± 1,5	9,6 ± 0,98	1,0 ± 0,04	1,2 ± 0,08	5,9 ± 0,7	4,1 ± 0,5	23,2 ± 3,5	91,4 ± 2,3

Tableau 1 : informations sur les pigments purs utilisées pour exécuter l’analyse lambda. Ce tableau montre les pics d’émission et les maxima épaules/bande de fluorescence de différents fluorochromes/pigments par spectrophotométrie d’imagerie confocale pour toutes les longueurs d’onde d’excitation, et le pourcentage d’émission lumineuse par les pigments/fluorochromes. Les valeurs ont été calculées par la formule: = MFI*100/255. Chaque valeur est la moyenne ± SE (moyenne ± erreur-type par rapport à la moyenne). Des pigments purs ont été utilisés pour étalonner le microscope laser à balayage confocale comme suit ^1,2,10. La chlorophylle a a été obtenue à partir de Spinacia oleracea, la R-phycoérythrine (R-PE) de Porphyra tenera et la C-phycocyanine (C-PE) à partir de Spirulina sp. Toutes les espèces ont été dissoutes dans de l’eau distillée filtrée. L’allophycocyanine-XL (APC-XL) a été obtenue à partir de Mastigocladus laminosus, qui a été dissous dans du sulfate d’ammonium (60%) et du phosphate de potassium (pH = 7) pour atteindre une concentration de 38 mM. Les scans ont été effectués avec 400 μL de chaque solution pigmentaire (concentration de 1 mg/mL) en utilisant une chambre de fond en verre recouverte de 8 puits.

L’étude d’une seule longueur d’onde d’excitation est une première approximation très utile. Dans ce cas, cependant, il est nécessaire d’élucider la contribution relative des différents complexes dans le signal de fluorescence, ce qui est recommandé pour effectuer un rapport de fluorescence ou une analyse du spectre à plusieurs longueurs d’onde, entre autres méthodes.

Protocole

L’espèce d’algue Chroothece mobilis a été utilisée pour la présente étude. L’espèce a été obtenue à partir de la collection de culture Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. Une vue d’ensemble du protocole est présentée à la figure 1.

Figure 1 : Aperçu de l’étude. Chroothece mobilis est incubé dans des conditions d’habitat extrêmes, telles que différentes lumières monochromatiques, pendant 2 semaines. L’effet sur la physiologie de Chroothece est évalué par autofluorescence des protéines contenues dans les phycobilisomes et les photosystèmes à l’aide d’un microscope confocale à balayage laser. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Préparation de l’échantillon

1. Préparer l’inoculum de Chroothece mobilis à partir de la culture de gélose de la collection en le transférant dans le milieu liquide SWES (tableau 2).
   NOTE: SWES « Seewasser + Erddekokt + Salze » = milieu d’eau de mer²³.
2. Maintenir toutes les cultures pendant 2 semaines avec une photopériode lumière/obscurité 16:8 à 20 °C dans des conditions de faible intensité de lumière blanche (LL : 80 μM/m²/s) et sans agitation, jusqu’à l’obtention de la densité cellulaire souhaitée (voir étape 1.3).
   NOTE: Les conditions de lumière de croissance sont de 80 μM / m² / s intensité lumineuse (rayonnement photosynthétique actif, PAR). Ces conditions sont utilisées comme conditions de faible luminosité (contrôle). La composition du milieu SWES est présentée dans le tableau 2.
3. Effectuer des inoculations pour les différentes expériences en phase de culture exponentielle avec une densité cellulaire de 5 x 10³ cellules/mL dans une plaque de 24 puits, en utilisant 1 mL par puits.
   NOTE: Effectuer le comptage des cellules avec une chambre de Neubauer²⁴ et diluer la culture avec SWES chaque fois que nécessaire.

Composition du milieu SWES
Composant	Concentration
KNO3	1,98 mM
K2HPO4	115 μM
MgSO4	81 μM
ZnSO4, 7H2O	17 nM
MnSO4, 7H2O	45 nm
H3 BO3, 4H2O	3,1 mM
Co(NO3)2	17 mM
Na 2 MoO4, 6H2O	21 nM
CuSO4, 2H2O	0,1 nM
FeSO4, 5H2O	13 μM
EDTA, 7H2O	11 μM
Vit B12	5 μg
Extrait de sol	30 mL
Eau de rivière filtrée	455 mL

Tableau 2 : Composition moyenne du SWES.

2. Reproduire des conditions extrêmes d’habitat des algues : effet de lumière monochromatique verte et rouge

1. Ajouter 1 mL de la culture cellulaire provenant de la culture mère préparée à la densité cellulaire susmentionnée (étape 1.2) pour inoculer chaque puits d’une plaque de 24 puits.
2. Gardez la culture cellulaire couverte pendant 2 semaines pour reproduire l’effet de lumière monochromatique.
   1. Utilisez le filtre vert qui laisse passer la lumière verte de 470 à 570 nm avec un pic à la longueur d’onde de 506 nm (selon les spécifications du fabricant; voir Tableau des matériaux) et exposez-le à la culture²⁵.
   2. Utilisez le filtre rouge qui laisse passer la lumière rouge entre 590 et 720 nm et culmine à 678 nm (selon les spécifications du fabricant; voir Tableau des matériaux) pour l’exposer à la culture²⁵.
      NOTE: La condition de faible intensité de lumière blanche (LL: 80 μM^{/ m 2} / s; voir le tableau des matériaux) est utilisée comme contrôle de l’intensité lumineuse pour comparer les effets obtenus. Les unités d’intensité lumineuse utilisées sont le micromole par seconde et le mètre carré (μmol ^{m-2 s-1}) ou la densité de flux de photons photosynthétiques (PPFD).

3. Imagerie par autofluorescence

REMARQUE : La configuration du logiciel d’imagerie (voir le tableau des matériaux) est illustrée à la figure 2.

1. Allumez tous les composants du microscope confocale inversé à balayage laser (CLSM; voir Tableau des matériaux), y compris le laser.
2. Monter les cellules de chaque puits expérimental de la plaque de 24 puits dans le milieu de croissance SWES sur une antenne à fond en verre de 35 mm (voir le tableau des matériaux) pour l’imagerie.
3. Choisissez l’objectif d’immersion glycérol 63x/1,30 NA et placez le glycérol sur la lentille (voir le tableau des matériaux).
4. Placez la plaque de puits sur l’étage du microscope et assurez-vous que l’échantillon ne bouge pas pendant l’acquisition de l’image.
5. Centrez l’échantillon dans le trajet lumineux et concentrez-vous sur le centre de la cellule en sélectionnant le plan avec l’intensité de fluorescence la plus élevée.
6. Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images et choisissez xyλ dans la liste déroulante du mode^{d’acquisition 26}.
7. Sélectionnez la ligne d’excitation du laser à 561 nm DPSS, 8 bits de plage dynamique et 1024 x 1024 pixels.
   REMARQUE: Assurez-vous que le microscope confocal dispose d’un laser DPSS de 561 nm ou d’un laser à lumière blanche (WLL).
8. Collectez les spectres d’émission de fluorescence dans la bande passante de 10 nm et la taille de pas lambda de 4 nm dans la plage de 570 à 760 nm.
9. Définissez le trou d’épingle sur 1 unité Airy et exécutez l’acquisition par balayage lambda.
10. Répétez ce processus autant de fois que possible dans différents champs de vision pour recueillir une quantité acceptable de données pour l’analyse statistique (généralement un écart-type inférieur à 10 %²²).
11. Répétez la dernière étape dans les différentes conditions (sous les voyants rouge et vert) et enregistrez les données.
    REMARQUE : Utilisez les mêmes paramètres d’acquisition pour les différents échantillons et conditions afin de comparer et d’effectuer l’analyse statistique.

Figure 2 : Configuration du logiciel. Interface utilisateur du logiciel d’imagerie pour configurer les paramètres de balayage lambda. (A) De gauche à droite, sélectionner le mode d’acquisition xyλ dans la liste déroulante, qui correspond à l’étape 3.6 du protocole, et sélectionner le type de lentille d’immersion droite, correspondant à l’étape 3.3 du protocole. Assurez-vous de retirer tout filtre du trajet lumineux à l’étape 3.9. (B) Le panneau de configuration des paramètres de balayage lambda correspond à l’étape 3.8 du protocole. (C) Exécutez l’analyse lambda à l’étape 3.10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Paramètres pour évaluer la physiologie de Chroothece

1. Une fois le lambda scan acquis, cliquez sur la fenêtre de quantification en haut du logiciel (comme illustré à la figure 3) pour évaluer les spectres d’émission de fluorescence collectés. Accédez à la fenêtre Ouvrir le projet et sélectionnez un fichier xyλ (Figure 3).
2. Sélectionnez Analyse du profil de la pile dans le logiciel d’imagerie.
3. Définir une région d’intérêt (ROI) de 4^μm2 au centre d’une cellule pour analyser l’intensité moyenne de fluorescence (IMF). Exportez les données au format CSV.
   REMARQUE: Il est important d’éviter la présence de pixels noirs (pour s’assurer que les pixels sélectionnés contiennent des valeurs positives) et de toujours maintenir un retour sur investissement de même taille.
4. Répétez ce processus avec différentes cellules dans différentes conditions pour produire suffisamment de données pour effectuer une analyse statistique.
5. Ouvrez les fichiers CSV pour sélectionner les différents pics d’émission de fluorescence des phycobiliprotéines et des chlorophylles de tous les ROI mesurés.
   1. Sélectionnez les données de fluorescence de la phycoérythrine-phycocyanobiline (PE-PCB; 620 nm), de la C-phycocyanine (CPC; 648 nm), de l’allophycocyanine (APC; 660 nm) et de la chlorophylle a (Chl a; 680 nm), respectivement, dans le fichier csv.
6. Créez un nouveau tableau avec toutes les valeurs de fluorescence maximales obtenues à partir de chaque pic de phycobiliprotéine et de chlorophylle et tracez les données sur un graphique.
7. Effectuer des analyses statistiques.
   1. Analyser si les données obtenues répondent à la normalité et à l’homoscédasticité²⁷.
   2. Passez à l’analyse du test t^27,28 si la première condition est vraie. Si ce n’est pas le cas, exécutez un test Mann-Whitney U²⁹.
   3. Considérez les différences significatives aux valeurs p <0,05.

Figure 3 : Évaluation de l’autofluorescence de Chroothece. Pour effectuer l’analyse d’autofluorescence, assurez-vous de sélectionner la fenêtre de quantification et un fichier xyλ dans la fenêtre des projets ouverts (étape 4.1); Sélectionnez Visualisation du profil de la pile (étape 4.2) ; sélectionnez un ROI de 4 μm² au centre d’une cellule et cliquez sur le bouton Rapport pour exporter les données de numérisation lambda au format CSV (étape 4.3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

La chlorophylle a absorbe généralement les longueurs d’onde bleues et rouges de la lumière visible, tandis que les phycobiliprotéines utilisent les longueurs d’onde verte, jaune et orange⁷. L’autofluorescence de ces pigments rend possible la première approche pour étudier les phycobiliprotéines et le comportement de la chlorophylle dans des conditions expérimentales et sur le terrain.

En comparant les données obtenues et en traçant sur différents graphiques, les changem...

Discussion

Certaines algues rouges unicellulaires ou coloniales, telles que Chroothece, poussent lentement in vitro, mais contiennent plusieurs composés autofluorescents qui peuvent être analysés par analyse spectrale au microscope confocal, où les différences dans les pics d’émission pigmentaire peuvent être détectées. La microscopie confocale spectrale à fluorescence nous a permis de mener des études in vivo pour évaluer l’adaptation ou l’acclimatation des organismes photosynthétiques 8,10,17,18,19,20.<...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
µ ;-Plat 35 mm, haut fond en verre	Ibidi  ;	81158-24
plaque de puits noir	Ibidi	82406	; fond plat et transparent pour la microscopie à haut débit
Incubateur d’algues	Panasonic	MLR-352-PE
Microscope confocal à balayage laser	Leica Microsystems	SP8 TCS-Flask
	Fisher Scientific	15380591	Peut être acheté dans un dépanneur local ou dans des magasins en ligne.
filtre vert	PNTA, filtres LEE	-	Peut être acheté dans un dépanneur local ou dans des magasins en ligne.
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2	Leica Microsystems	506353	Lentille d’immersion au glycérol
Logiciel d’acquisition d’images. LAS X	Leica Microsystems	SP8	TCS-Source
lumineuse	Panasonic	FL40SSENW/37MLR-352-PE
Photoradiomètre quantique	DeltaOhm  ;	DO 9721-R
software	R Core Team, 2020	4.0.2.	-
filtre rouge	PNTA, filtres LEE	-	Peut être acheté dans un dépanneur local ou dans des magasins en ligne.
SWES medium	Université de Murcie	-	-
Type G Liquide	d’immersion Leica Microsystems	11513910	Glycérol  ;