Évaluation des propriétés anticryptococciques présumées des extraits bruts et clarifiés de mollusques

Résumé

L’agent pathogène fongique humain Cryptococcus neoformans produit une variété de facteurs de virulence (p. ex. peptidases) pour favoriser sa survie au sein de l’hôte. Les niches environnementales représentent une source prometteuse de nouveaux inhibiteurs naturels de la peptidase. Ce protocole décrit la préparation d’extraits de mollusques et l’évaluation de leur effet sur la production de facteurs de virulence fongiques.

Résumé

Cryptococcus neoformans est un pathogène fongique humain encapsulé avec une distribution mondiale qui infecte principalement les personnes immunodéprimées. L’utilisation généralisée des antifongiques en milieu clinique, leur utilisation en agriculture et l’hybridation des souches ont entraîné une évolution accrue de la résistance. Ce taux croissant de résistance aux antifongiques est une préoccupation croissante parmi les cliniciens et les scientifiques du monde entier, et il est de plus en plus urgent de développer de nouvelles thérapies antifongiques. Par exemple, C. neoformans produit plusieurs facteurs de virulence, y compris des enzymes intracellulaires et extracellulaires (par exemple, les peptidases) qui jouent un rôle dans la dégradation des tissus, la régulation cellulaire et l’acquisition des nutriments. La perturbation de cette activité peptidase par des inhibiteurs perturbe la croissance fongique et la prolifération, ce qui suggère que cela pourrait être une stratégie importante pour lutter contre l’agent pathogène. Il est important de noter que les invertébrés tels que les mollusques produisent des inhibiteurs de peptidases ayant des applications biomédicales et une activité antimicrobienne, mais ils sont sous-explorés en termes d’utilisation contre les pathogènes fongiques. Dans ce protocole, une extraction globale à partir de mollusques a été réalisée pour isoler les inhibiteurs potentiels de la peptidase dans des extraits bruts et clarifiés, et leurs effets contre les facteurs de virulence cryptococcique classiques ont été évalués. Cette méthode soutient la priorisation des mollusques ayant des propriétés antifongiques et offre des possibilités de découverte d’agents antivirulents en exploitant les inhibiteurs naturels présents dans les mollusques.

Introduction

Cryptococcus neoformans est un pathogène fongique humain qui produit une maladie grave chez les hôtes immunodéprimés, comme les personnes vivant avec le VIH/sida¹, et entraîne environ 19 % des décès liés au sida². Le champignon est sensible à plusieurs classes d’antifongiques, y compris les azoles, les polyènes et la flucytosine, qui exercent une activité fongicide et fongistatique en utilisant des mécanismes distincts ^3,4. Cependant, l’utilisation intensive d’antifongiques dans des contextes cliniques et agricoles combinée à l’hybr....

Protocole

1. Extraction de protéines à partir de mollusques

1. Ramasser des mollusques dans une zone naturelle désignée et approuvée (p. ex. rivière Speed, Guelph, Ontario). Pour cette étude, des espèces indigènes et envahissantes ont été sélectionnées pour évaluer un large éventail d’effets antifongiques potentiels.
2. Casser délicatement la coquille des mollusques (p. ex. Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi et Cipangopaludina chinensis) à l’aide d’un pilon et d’un mortier, et retirer les morceaux solides avec une pince à épiler. Généralement, 10 mollusques sont regroupés pour être utilisés tout au long du protocole.....

Résultats

Le flux de travail décrit ici permet d’isoler des protéines et des peptides de mollusques ayant des propriétés anti-virulence potentielles contre C. neoformans. De même, l’évaluation de différentes formes d’extraits (bruts et clarifiés) permet la semi-purification des composés actifs potentiels et appuie l’évaluation en aval (p. ex. protéomique basée sur la spectrométrie de masse). En règle générale, le flux de travail d’extraction des protéines produit des solutions homogénéisées avec des concentrations de prot.......

Discussion

Le protocole d’extraction décrit ici décrit l’isolement de composés de mollusques prélevés en Ontario, au Canada, et démontre une nouvelle étude sur l’utilisation d’extraits de mollusques contre l’agent pathogène fongique humain, C. neoformans. Ce protocole s’ajoute à un nombre croissant de recherches sur l’activité des inhibiteurs de la peptidase chez les invertébrés¹³. Au cours de l’extraction, certains échantillons d’extraits étaient difficiles à filtrer-stériliser, peut-être en raison.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,2 &mu ; m Filters	VWR	28145-477 (Amérique du Nord)
Tubes de 1,5 mL (Safe-Lock)	Eppendorf	0030120086
Tubes de 2 mL (Safe-Lock)	Eppendorf	0030120094
3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA)	Sigma-Aldrich	D9628-5G	CAS # : 59-92-7
Plaques à 96 puits	Costar (Corning)	3370
Bullet Blender Storm 24	NEXT ADVANCE	BBY24M
Centrifugeuse 5430R	Eppendorf	5428000010
Chelex 100 Résine	BioRad	142-1253
CO2 Incubateur (Statique)	SANYO	Non disponible
Cryptococcus neoformans H99	ATCC	208821
Microscope DIC	Logiciel
	Zeiss
DMEM	Corning	10-013-CV
Glucose (D-Glucose, Anhydre, Qualité Réactif)	BioShop	GLU501	CAS # : 50-99-7
Glycine	Fisher Chemical	G46-1	CAS # : 56-40-6
GraphPad Prism 9	Dotmatics
Hémocytomètre	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4.7 H2O)	Honeywell	M1880-500G	CAS # : 10034-99-8  ;
Peptone	BioShop	PEP403
Sel tampon phosohate pH 7.4	BioShop	PBS408	SKU : PBS408.500
Lecteur de plaques (Synergy-H1)	BioTek (Agilent)	Non disponible
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)	Fisher Chemical	P285-500	CAS # : 7778-77-0
Subtilisin A	Sigma-Aldrich	P4860	CAS # : 9014-01-01
Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide	Sigma-Aldrich	573462	CAS # : 70967-97-4
Bain thermal	VWR	76308-834
Chlorhydrate de thiamine	Fisher-Bioreagents	BP892-100	CAS # : 67-03-8
Extrait de levure	BioShop	YEX401	CAS # : 8013-01-2
Levure base azotée (avec acides aminés)	Sigma-Aldrich	Y1250-250G	YNB  ;

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