Automatisation du test du micronoyau à l’aide de la cytométrie en flux d’imagerie et de l’intelligence artificielle

Summary

Le test du micronoyau (MN) est un test bien établi pour quantifier les dommages à l’ADN. Cependant, la notation du test à l’aide de techniques conventionnelles telles que la microscopie manuelle ou l’analyse d’images basée sur des caractéristiques est laborieuse et difficile. Cet article décrit la méthodologie pour développer un modèle d’intelligence artificielle pour noter le test MN à l’aide de données de cytométrie de flux d’imagerie.

Abstract

Le test du micronoyau (MN) est utilisé dans le monde entier par les organismes de réglementation pour évaluer la toxicité génétique des produits chimiques. Le test peut être effectué de deux manières: en marquant MN dans des cellules binucléées une fois divisées, bloquées par cytocinèse ou des cellules mononucléées entièrement divisées. Historiquement, la microscopie optique a été la méthode de référence pour noter le test, mais elle est laborieuse et subjective. La cytométrie en flux a été utilisée ces dernières années pour évaluer le test, mais elle est limitée par l’incapacité de confirmer visuellement les aspects clés de l’imagerie cellulaire. La cytométrie de flux d’imagerie (IFC) combine la capture d’images à haut débit et l’analyse automatisée des images, et a été appliquée avec succès pour acquérir rapidement des images et marquer tous les événements clés du test MN. Récemment, il a été démontré que les méthodes d’intelligence artificielle (IA) basées sur des réseaux neuronaux convolutifs peuvent être utilisées pour évaluer les données de test MN acquises par IFC. Ce document décrit toutes les étapes d’utilisation d’un logiciel d’IA pour créer un modèle d’apprentissage en profondeur afin de noter tous les événements clés et d’appliquer ce modèle pour noter automatiquement des données supplémentaires. Les résultats du modèle d’apprentissage profond de l’IA se comparent bien à la microscopie manuelle, permettant ainsi une notation entièrement automatisée du test MN en combinant IFC et IA.

Introduction

Le test du micronoyau (MN) est fondamental en toxicologie génétique pour évaluer les dommages à l’ADN dans le développement de cosmétiques, de produits pharmaceutiques et de produits chimiques à usage humain 1,2,3,4. Les micronoyaux sont formés à partir de chromosomes entiers ou de fragments de chromosomes qui ne s’incorporent pas dans le noyau après la division et se condensent en petits corps circulaires séparés du noyau. Ainsi, MN peut être utilisé comme critère d’évaluation pour quantifier les dommages à l’ADN dans les essais de génotoxi....

Protocol

1. Acquisition de données par cytométrie de flux d’imagerie

REMARQUE : Se reporter à Rodrigues et ^al.16 avec les modifications suivantes, en notant que les régions d’acquisition utilisant IFC peuvent devoir être modifiées pour une capture d’image optimale :

1. Pour la méthode non-Cyt-B, effectuer une numération cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules disponible dans le commerce en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux) sur chaque culture immédiatement avant la culture et immédiatement après la période de récupération.
2. Si vous exéc....

Results

La figure 1 montre le flux de travail pour l’utilisation du logiciel d’IA afin de créer un modèle pour le test MN. L’utilisateur charge les fichiers .daf souhaités dans le logiciel d’IA, puis affecte des objets aux classes de modèles de réalité sur le terrain à l’aide des algorithmes de marquage de cluster assisté par l’IA (Figure 2) et de prédiction (Figure 3). Une fois que toutes les classes de modèles de vérité de terrain ont été.......

Discussion

Le travail présenté ici décrit l’utilisation d’algorithmes d’apprentissage profond pour automatiser la notation du test MN. Plusieurs publications récentes ont montré que des outils intuitifs et interactifs permettent la création de modèles d’apprentissage profond pour analyser les données d’images sans avoir besoin de connaissances informatiques approfondies^18,19. Le protocole décrit dans ce travail à l’aide d’un progiciel piloté par interface utilisateur a été .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube à centrifuger 15 mL	Nettoyant 352096
Falcon - Coulter Clenz ;	Beckman Coulter	8546931	Remplissez le récipient avec 200 ml de nettoyant.  ; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine	MilliporeSigma	64-86-8
Corning Filtre sous vide pour flacon  ;	MilliporeSigma	CLS430769	0,22 et micro ; Filtre m, flacon de 500 mL
Cytochalasine B	MilliporeSigma	14930-96-2	Flacon de 5 mg
Débulleur - 70 % d’isopropanol	MilliporeSigma	1.3704	Remplir le récipient avec 200 mL de débulleur. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)	MilliporeSigma	67-68-5
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1X	EMD Millipore	BSS-1006-B	PBS Ca++MG++ Gratuit  ;
Sérum fœtal de bovin	HyClone	SH30071.03
Formaldéhyde, 10 %, sans méthanol, Ultra Pure	Polysciences, Inc.	04018	C’est ce qui est utilisé pour le formol à 4 % et 1 %. ATTENTION : Formolo/Formaldéhyde toxique par inhalation et en cas d’ingestion. Irritant pour les yeux, les systèmes respiratoires et la peau. Peut provoquer une sensibilisation par inhalation ou par contact avec la peau. Risque de lésions oculaires graves. Risque potentiel de cancer. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Analyseur de cellules Guava Muse	Luminex	0500-3115	Une configuration standard L’analyseur de cellules Guava Muse a été utilisé.
Hoechst 33342	Thermo Fisher	H3570	10 mg/mL solution
Mannitol	MilliporeSigma	69-65-8
MEM Acides aminés non essentiels 100X	HyClone	SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II	Luminex, une société DiaSorin	100220	Une caméra ImageStreamX Mark II à 2 caméras a été équipée des lasers 405 nm, 488 nm et 642 nm.
Logiciel d’analyse MIFC - IDEAS	Luminex, a DiaSorin	company 100220	"Image analysis sofware" Le logiciel compagnon du MIFC (ImageStreamX MKII)
Logiciel MIFC - INSPIRE	Luminex, a DiaSorin	Company 100220	"Logiciel d’acquisition d’images" Il s’agit du logiciel qui exécute le logiciel MIFC (ImageStreamX MKII)
Logiciel Amnis AI	Luminex, une société	DiaSorin100221	"Logiciel d’IA" Il s’agit du logiciel qui permet la création de modèles d’intelligence artificielle pour analyser les données
Mitomycine C	MilliporeSigma	50-07-7
NEAA Mixture 100x	Lonza BioWhittaker	13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X	Gibco	15070063
Chlorure de potassium (KCl)	MilliporeSigma	P9541
Rinçage - Eau ultrapure ou eau déminéralisée	NA	NA Utilisez	de l’eau ultrapure ou de l’eau déminéralisée. Remplissez le récipient avec 900 ml de rinçage.
RNase	MilliporeSigma	9001-99-4
RPMI-1640 Moyen 1x	HyClone	SH30027.01
Gaine - PBS	MilliporeSigma	BSS-1006-B	C’est le même que le Saline tamponné au phosphate de Dulbecco 1x  ; Ca++MG++ gratuit.  ; Remplissez le récipient avec 900 mL de gaine.
Stérilisateur à eau stérile	HyClone	SH30529.01
- 0,4 %&ndash ; 0,7 % d’hypochlorite	VWR	JT9416-1	Il s’agit généralement d’un agent de blanchiment Clorox à 10 % qui peut être fabriqué en éluant l’eau de Javel Clorox avec de l’eau. Remplissez le récipient avec 200 ml de stérilisateur.
Gourde T25	Falcon	353109
Bouteille T75	Falcon	353136
cellules TK6	MilliporeSigma	95111735