Ce protocole décrit l’isolement des cellules souches musculaires et des progéniteurs fibro-adipogènes des muscles squelettiques individuels chez la souris. Le protocole implique la dissection musculaire unique, l’isolement des cellules souches par tri cellulaire activé par fluorescence, l’évaluation de la pureté par coloration par immunofluorescence et la mesure quantitative de l’entrée en phase S par test d’incorporation de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine.
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Article de méthode
Isolement de populations de cellules souches quiescentes à partir de muscles squelettiques individuels
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le muscle squelettique abrite des populations distinctes de cellules souches adultes qui contribuent à l’homéostasie et à la réparation des tissus. Les cellules souches du muscle squelettique (MuSC) ont la capacité de fabriquer de nouveaux muscles, tandis que les progéniteurs fibro-adipogènes (FAP) contribuent aux tissus de soutien stromaux et ont la capacité de fabriquer des fibroblastes et des adipocytes. Les MuSC et les FAP résident dans un état de sortie prolongée du cycle cellulaire réversible, appelé quiescence. L’état de repos est la clé de leur fonction. Les cellules souches quiescentes sont généralement purifiées à partir de plusieurs tissus musculaires regroupés dans un seul échantillon. Cependant, des études récentes ont révélé des différences distinctes dans les profils moléculaires et la profondeur de quiescence des MuSC isolés de différents muscles. Le présent protocole décrit l’isolement et l’étude des MuSC et des FAP à partir de muscles squelettiques individuels et présente des stratégies pour effectuer une analyse moléculaire de l’activation des cellules souches. Il détaille comment isoler et digérer les muscles de différentes origines développementales, épaisseurs et fonctions, tels que le diaphragme, triceps, gracilis, tibial antérieur (TA), gastrocnémien (GA), soléaire, extenseur digitorum longus (EDL) et les muscles masséters. Les MuSC et les FAP sont purifiés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et analysés par coloration par immunofluorescence et test d’incorporation de 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU).
Introduction
Le muscle squelettique a une grande capacité de régénération en raison de la présence de cellules souches musculaires (MuSC). Les MuSC sont situés sur les myofibres, sous la lame basale, et résident dans un état de repos de sortieprolongée et réversible du cycle cellulaire 1,2,3,4. En cas de blessure, les MuSCs s’activent et entrent dans le cycle cellulaire pour donner naissance à des progéniteurs amplificateurs qui peuvent se différencier et fusionner pour former de nouvelles myofibres 2,5
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Protocole
Le présent protocole a été exécuté conformément aux directives de soins aux animaux de l’Université d’Aarhus et aux réglementations locales en matière d’éthique.
NOTE: Assurez-vous de respecter les règlements du comité d’éthique local pour l’expérimentation animale et la manipulation d’échantillons post-mortem de rongeurs. Les souris sont une source potentielle d’allergènes; Si disponible, activez la ventilation par aspiration et placez-la sur l’espace de travail pour éviter une exposition excessive aux allergènes. Vous pouvez également porter un masque facial si l’expérience est effectuée régulièrement. Ce protocole implique de travailler ....
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Résultats
Conformément au protocole d’isolement individuel des muscles squelettiques (Figure 2), les muscles gracilis, TA, EDL, GA, soléus, triceps, masséter et diaphragme ont été isolés chez trois souris mâles suisses consanguines qui avaient été interrompues d’un programme de sélection local (Figure 2). Après dissociation tissulaire et coloration des anticorps, les MuSCs et les FAP des muscles individuels ont été purifiés par FACS (Figure 3.......
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Discussion
Plusieurs étapes sont essentielles dans l’exécution de ce protocole pour obtenir de bons rendements. Les muscles individuels ont un petit volume par rapport à la quantité de muscle utilisée dans les protocoles d’isolement en vrac. Il en résulte un risque de dessèchement musculaire pendant la dissection, ce qui réduit le rendement. Pour éviter cela, il est important d’ajouter du milieu aux muscles immédiatement après la dissection. De plus, si la dissection prend plus de temps, la peau peut être retirée d’un membre à la f.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents et pas de conflits d’intérêts.
Remerciements
Le tri cellulaire a été effectué au centre FACS de l’Université d’Aarhus (Danemark). Les figures ont été créées à l’aide de Biorender.com. Nous remercions le Dr J. Farup d’avoir partagé l’anticorps anti-PDGFRa du lapin. Ce travail a été soutenu par une subvention de démarrage AUFF à E.P. et des subventions Start Package de NovoNordiskFonden à E.P. (0071113) et à A.D.M. (0071116).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube de 1,5 mL (performance PCR testée, PP, 30 000 xg, sans ADN/DNase/RNase, faible liaison à l’ADN, stérile | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | Tube de 1,5 mL |
| Tube de 15 mL (PP/HD-PE, 20 000 xg, IVD/CE, IATA, sans ADN/DNase-/RNase, non cytotoxique, sans pyrogène, stérile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | Tube |
| de 15 mLTube à fond rond en polystyrène de 5 mL | Falcon, Fisher Scientific ; | 352054 | tube FACS sans capuchon de filtre |
| 5 mL en polystyrène Tube à fond rond avec capuchon de filtre à cellules | Falcon, Fisher Scientific ; ; | 352235 | tube FACS avec capuchon de crépine |
| Tube de 5 mL (PP, non stérile, autoclavable) | Collection VWR | 525.0946 | Tube de 5 mL |
| Tube de 50 mL( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNAD/DNase-/RNase-free, non cytotoxique, sans pyrogène, stérile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | Tube de 50 mL |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot : 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 âne-anti-souris IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot : 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Plateforme Aarhus | |
| University Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
| Click-iT EdU Kit de prolifération cellulaire pour l’imagerie, Alexa Fluor 488 colorant | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot : 2387287 (Cat# C10337) | Kit de prolifération cellulaire |
| Collagène de peau de veau ; | Bioréactif, Sigma Aldrich ; | Source : SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Collagénase de type II | Worthington, Fisher Scientific ; | Lot : 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific ; | Lot : 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Sérum d’âne (non stérile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot : 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Pince droite à pointes fines |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Pince courbe |
| F-10 Mélange nutritif (jambon) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific ; | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-souris CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-souris CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Acide acétique glacial (100 %) | EMSURE, Merck ; ; | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Rotateur de mini-tube tête sur tête ; | Fisher Scientific ; | 15534080 (Modèle n° 88861052) | Tête sur tête mini-tube rotateur |
| Sérum de cheval | Gibco, Fisher Scientific ; | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Bain-marie à secouer |
| MS2 mini-shaker ; | IKA ; | Unité vortex | |
| Aiguille 20 G (0,9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific ; | 304827 | aiguille 20G ; |
| Tampon neutre au formol 10 % | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot : 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Passoire cellulaire apyrogène (40 µ ; M) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Crépine à cellules ; |
| Bleu Pacifique anti-souris Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Anticorps primaire Pax7 | DSHB | Lot : 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x concentré en poudre | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-souris CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM. A) (Cat # 105720) | |
| Pen/streptocoque | Gibco, Fisher Scientific ; | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Pointes de pipette p10 | Pointes artistiques, barrière auto-obturante, Thermo Scientific | 2140-05 | Faible rétention, pré-stérilisées, pointes filtrantes |
| Pointes de pipette p1000 | Pointes artistiques, barrière auto-obturante, Thermo Scientific | 2279-05 | Faible rétention, pré-stérilisées, pointes filtrantes |
| Pointes de pipette p20 | Pointes artistiques, barrière auto-obturante, Thermo Scientific | 2149P-05 | Faible rétention, pré-stérilisé, pointes filtrantes |
| Pointes de pipette p200 | Pointes artistiques, barrière auto-obturante, Thermo Scientific | 2069-05 | Faible rétention, pré-stérilisé, pointes filtrantes |
| Sous-coussin de protection | Abena ; | ACTC-7712 | ; 60 x 40cm, 8 couches |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific ; | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Scalpel recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
| Lame de scalpel no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
| Scanlaf mars | Labogene | enceinte classe 2 : Mars | Flow bench |
| ScanR | Olympus | Microscope, Plateforme Aarhus University | |
| Ciseaux | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubateur |
| Pipette sérologique 10 mL | VWR | 612-3700 | stérile et apyrogène |
| 5 mL | VWR, Avantor délivré par VWR | 612-3702 | Seringue stérile, apyrogène |
| 5 mL, embout Luer (6 %), stérile ; | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Seringue |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Boîte de Pétri ; |
| Surface traitée par culture tissulaire (TC), polystyrène noir, fond plat, stérile, couvercle, paquet de 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | Demi-plaque inférieure 96 puits |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source : SLCJ6163 (Cat # T8787) |
Références
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692(2021).
- Cheung....
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Réimpressions et autorisations
