Culture, congélation, traitement et imagerie d’organoïdes et de sphéroïdes entiers alors qu’ils sont encore dans un hydrogel

Résumé

La présente étude décrit des méthodologies pour la culture, la congélation, la décongélation, le traitement, la coloration, l’étiquetage et l’examen de sphéroïdes et d’organoïdes entiers sous divers microscopes, alors qu’ils restent intacts dans un hydrogel dans un dispositif polyvalent.

Résumé

Les organoïdes et les sphéroïdes, structures de croissance tridimensionnelles dans les laboratoires de culture cellulaire, sont de plus en plus reconnus comme des modèles supérieurs par rapport aux modèles de culture bidimensionnels, car ils imitent mieux le corps humain et présentent des avantages par rapport aux études animales. Cependant, ces études rencontrent souvent des problèmes de reproductibilité et de cohérence. Au cours des longs processus expérimentaux - avec les transferts d’organoïdes et de sphéroïdes entre différents vaisseaux de culture cellulaire, le pipetage et la centrifugation - ces structures de croissance 3D sensibles et fragiles sont souvent endommagées ou perdues. En fin de compte, les résultats sont considérablement affectés, car les structures 3D ne peuvent pas maintenir les mêmes caractéristiques et la même qualité. Les méthodes décrites ici minimisent ces étapes stressantes et assurent un environnement sûr et cohérent pour les organoïdes et les sphéroïdes tout au long de la séquence de traitement alors qu’ils sont encore dans un hydrogel dans un dispositif polyvalent. Les chercheurs peuvent cultiver, congeler, décongeler, traiter, colorer, étiqueter, puis examiner la structure des organoïdes ou des sphéroïdes sous divers instruments de haute technologie, des microscopes confocaux aux microscopes électroniques, à l’aide d’un seul dispositif polyvalent. Cette technologie améliore la reproductibilité, la fiabilité et la validité des études, tout en maintenant un environnement stable et protecteur pour les structures de culture 3D pendant le traitement. De plus, l’élimination des étapes stressantes minimise les erreurs de manipulation, réduit le temps nécessaire et diminue le risque de contamination.

Introduction

L’avenir de la recherche et de la thérapie cellulaires réside dans les cultures cellulaires 3D ^1,2,3. Les modèles organoïdes et sphéroïdes comblent l’écart entre les expériences in vitro et les modèles animaux en créant de meilleurs modèles qui imitent le développement du corps humain, la physiologie et les maladies 4,5,6,7,8,9. Cependant, la reproductibilité et la répéta....

Protocole

1. Culture d’organoïdes et de sphéroïdes

1. Placez l’hydrogel sur de la glace pendant la nuit (dans un réfrigérateur ou une chambre froide) pour le décongeler.
2. Placer l’appareil polyvalent disponible dans le commerce (DM; voir le tableau des matériaux) dans l’incubateur 1 jour avant l’expérience (37 °C, 5% CO₂) pour le réchauffer.
3. Placer les pointes de pipettes larges stériles au réfrigérateur à 4 °C.
   REMARQUE : Les étapes 1.1 à 1.3 doivent être effectuées le jour 0 et les étapes 1.4 à 1.11 doivent être effectuées le jour 1.
4. Placez l’hydrogel sur de la glace dans une hotte à écoulemen....

Résultats

Le présent article représente un dispositif polyvalent (DM) et des méthodologies complémentaires pour la culture, la congélation, la décongélation, la coloration histologique, la coloration immunohistochimique, le marquage par immunofluorescence, l’enrobage et le traitement d’organoïdes entiers ou de sphéroïdes tout en restant dans un hydrogel dans un seul environnement conçu de manière unique. La présente étude a été conçue pour préparer des sphéroïdes du cancer du foie HepG2 dans 35 gouttes d’hydrogel dans 35 MD. Les e.......

Discussion

Le MD, complétant les formulations et les protocoles décrits ici, facilite la croissance 3D rapide et spontanée des organoïdes et des sphéroïdes dans un environnement plus contrôlé et poursuit l’expérience dans les mêmes conditions. Le spécimen reste dans le même environnement pendant tout le processus, et près de 100% des architectures de culture 3D restent intactes dans le conteneur. Cela améliore l’homogénéité pendant les expériences séquentielles et permet une période de culture prolongée. En outre, le nombre d’étape.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Éthanol absolu (EtOH)	Merck	8187602500	Diluer dans du dH2O pour obtenir une solution à 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 96 % et à stocker chez RT
Acétone	Merck	8222512500	Stocker chez RT
Alexa fluor germe de blé agglutinine et Hoechst  ; dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS)   ;	Invitrogen	I34406	Image-IT LIVE Kit de marquage à membrane plasma et nucléaire, stocké à -20 ° ; C
alpha-1-fœtoprotéine (AFP) Anticorps polyclonal concentré et prédilué	Biocare Medical	CP 028 A	Se conserve à +4 ° ; C
Anticorps anti-albumine	Abcam	EPR20195	Conserver à +4 ° ; C, Dilution : 1:50
Anticorps anti-bêta-galactosidase, Poulet polyclonal	134435		Conserver à +4 ° ; C, dilution : 1:25
Anti-cytokératine 5	Abcam	53121	Conserver à +4 ° ; C, dilution : 1:100
Arginase-1 Anticorps monoclonal de lapin concentré et prédilué	Biocare Medical	ACI 3058 A, B	Conserver à +4 ° ; C, Dilution : 1:50
Chlorure de calcium (CaCl2)	Sigma	C1016-500G	Dissoudre dans le fixateur de Karnovsky pour produire 2 mM de CaCl2 ; stocker chez RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)	Abcam	ab228554
Tubes à centrifuger, 15 mL  ;	Nest	601051
Tubes à centrifuger, 50 mL  ;	Nest	602052
Classe II Enceinte de sécurité microbiologique Bio II Advance Plus	Telstar	EN12469
CO2 Incubateur	Panasonic	KM-CC17RU2
Grilles en cuivre	Microscopie	Sciences G100-Cu	Sections ultra-minces posées sur les grilles ; 100 lignes/pouce maille carrée
Sécheur à point critique	Leica	EM CPD300	Pour le séchage d’échantillons biologiques pour les applications MEB dans un mélange de
solution chromogène absolue d’acétone DAB/AEC	Sigma Aldrich	AEC101	Magasin à +4 ° ; C
Couteau	diamanté Diatome	Ultra 45° ;, 40-US	Utilisation pour les sections ultra-minces pour TEM
Diméthylsulfoxyde pour la biologie moléculaire	Biofroxx	67-68-5
Plastique jetable Pasteur Pippettes	Nest
DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	41966-029	Store à +4 ° ; C
Eosin Y Solution Alcoolique	Brillante Slide	2.BS01-105-1000
Résine Epon  ;	Sigma	45359-1EA-F	Kit moyen d’enrobage époxy, Stocké à +4 ° ; C
Sérum Fœtal Bovin avec Additive Fortifiant	Pan Biotech	P30-3304	Stocker à +4 ° ; C
Freezing Solution (FS)	Cellorama	CellO-F	Se conserve à +4 ° ; C
Fabricant de couteaux en verre	Leica	EM KMR3	Pour la fabrication de couteaux en verre de 8 mm d’épaisseur
Bandes de couteau en verre (taille 8 mm x 25,4 mm x 400 mm)	Leica	7890-08	Utilisation pour les sections ultra-minces ou semi-minces pour la
solution aqueuse de glutaraldéhyde TEM, grade EM, 25 %  ;	Sciences de la microscopie électronique	16210	Diluer dans dH2O pour obtenir une solution à 2,5 % et la conserver à +4 ° ; C
Solution de glycérol	Sigma Aldrich	56-81-5	Conserver à -20 °C, Dilution :1:100
Anticorps secondaire anti-IgY (H+L) de chèvre, Alexa, 647	Invitrogen	A32933	Stocker chez RT
Anticorps secondaires anti-IgG de souris (H+L), DyLight, 488	Invitrogen	35502	Stocker à +4 ° ; C,  ; Dilution :1:50
Anticorps secondaire anti-IgG de souris (H+L), DyLight, 550	Invitrogen	84540	Stocker à +4 ° ; C,  ; Dilution :1:50
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, DyLight, 488	Invitrogen	35552	Stocker à +4 ° ; C,  ; Dilution :1:50
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, DyLight, 550	Invitrogen	84541	Stocker à +4 ° ; C
Hématoxyline Harris  ;	Bright Slide	2.BS01-104-1000
Cellules HepG2	ATCC	HB-8065	Stocker dans un réservoir d’azote
Humain/Rat OV-6 Anticorps monoclonal souris IgG1 Clone # OV-6	R& D Systems	MAB2020	Stocker à -20 ° ; C
Hydrogel	Corning	354248	Matrigel, matrice de membrane basale haute concentration (HC), sans LDV, 10 mL, stockage à -20 ° ; C
Hydrogel	Corning	354234	Matrigel, Matrice de membrane basale, sans LDV, 10 mL, Stockage à -20 ° ; C
Hydrogel	ThermoFischer Scientific	A1413201	Geltrex, sans LDEV Facteur de croissance réduit Membrane basale
Matrice Hydrogel	Biotechne, R& D Systems	BME001-01	Cultrex Ultramatrix RGF BME, Magasin à -20 ° ; C
		de Karnovsky	%2 PFA, %2,5 Glutaraldéhyde dans un tampon de cacodylate 0,15 M, 2 mM de CaCl2 ; préparer frais ; utiliser pour TEM & Échantillons MEB
d’acide L-aspartique	Sigma	11189-100G	Stocker chez RT Solution d’aspartate
		de plomb	Dissoudre 40 mg d’acide aspartique dans 10 mL de ddH2O et ajouter 66 mg de nitrate de plomb. La solution se stabilise à 60 ° ; C et ajuster le pH à 5 ; préparer du
nitrate de plomb	Microscopie électronique Sciences	17900	Magasiner chez RT
Microscope confocal Leica	Leica	DMi8
LSM 700 Microscope confocal à balayage laser	Zeiss Lecteur de
microplaques	Biotek Synergy
Dispositif polyvalent (MD)	Cellorama CellO-M
Coloration à l’ADN nucléaire	Invitrogen	H3569	Hoechst 33258, Pentahydraté (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution dans l’eau, Conserver à +4 ° ; C
Coloration à l’ADN nucléaire	ThermoFischer Scientific	62248	solution DAPI, Conserver à +4 ° ; C
Tétroxyde d’osmium (OsO4) ,4 %	Microscopie électronique Sciences	19190	Diluer dans dH2O pour obtenir une solution à 2 %; stocker à +4 ° ; C et dans un contenant hermétique ; protéger la lumière Ov6
	anticorps R& D systems	MAB2020	Stocker à +4 ° ; C
Solution de paraformaldéhyde (PFA), 4 %  ;	Sigma	1.04005.1000	Dissoudre 4 % de PFA dans dH2O et faire bouillir, refroidir et aliquote ; conserver à -20 ° ; C
Solution de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS, 1 L	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Conserver à +4 ° ; C
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), comprimés	MP Biomedicals, LLC	2810305
Solution			%2 OsO4, %2,5 Ferrocyanure de potassium en dH2O ; préparer une
solution aqueuse fraîche de ferrocyanure de potassium, 5 %  ;	Microscopie électronique Sciences	26603-01	Store chez RT
Primovert - Microscope à champ clair inversé - ZEISS	Zeiss	N° d’article : 491206-0001-000
Tubes de microcentrifugation à fond rond, 2 mL	Nest	620611
Microscopie électronique à balayage avec embout STEM	Zeiss	GeminiSEM 500	Nous utilisons le détecteur d’électrons secondaires (SE) Inlens à 2-3 kV pour les micrographies électroniques à balayage et le détecteur aSTEM à 30 kV pour les micrographies électroniques à transmission.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack	ScyTek Laboratories	SHP125	Magasin à +4 ° ; C
Tampon cacodylate de sodium, 0,4 M, pH 7,2	Microscopie électronique Sciences	11655	Diluer dans dH2O pour faire 0,2 M et stocker à +4 ° ; C
Anticorps ATPase alpha 1 sodium/potassium [M7-PB-E9]	GeneTex	GTX22871	Se conserve à -20 ° ; C
Solution pour le marquage par immunofluorescence (S-IF)	Cellorama	CellO-IF	Conserver à +4 ° ; C
Solution pour l’immunohistochimie (S-IHC)	Cellorama	CellO-P	Se conserve à +4 ° ; C
Dispositif de coupe d’échantillon	Leica	EM TRIM2	Pour préparer un bloc d’échantillon épon à un ultramicrotome
Coucheuse par pulvérisation cathodique	Leica	EM ACE200	Enduire les échantillons MEB avec 6 nm d’or/palladium pour 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma	223220-5G	Diluer dans dH2O pour obtenir une solution à 0,5 % et filtrer avec 0,22 µ ; M filtre à membrane ; magasin chez RT ; préparer une
nouvelle solution de bleu de trypan, 0,4 %	Gibco	15250061
Super colle super gel	Pattex	PSG2C	Pour coller un bloc d’épon polymérisé avec l’échantillon au support du bloc d’épon
Ultramicrotome	Leica	EM UC7	Pour préparer des sections ultra- ou semi-minces de haute qualité pour la microscopie électronique à transmission (MET)
Pointes de pipette universelles, 10 & micro ; L	Nest	171215-1101
Pointes de pipette universelles, 1000 & micro ; L	Isolab	L-002
Pointes de pipette universelles, 200 & micro ; L  ;	Nest	110919HA01
Acétate d’uranyle	Microscopie électronique Sciences	22400	Diluer dans dH2O pour faire une solution à 2 % et filtrer avec 0,22 µ ; M filtre à membrane ; garder le magasin de conteneurs bien fermé chez RT