Culture, congélation, traitement et imagerie d’organoïdes et de sphéroïdes entiers alors qu’ils sont encore dans un hydrogel

L’avenir de la recherche et de la thérapie cellulaires réside dans les cultures cellulaires 3D ^1,2,3. Les modèles organoïdes et sphéroïdes comblent l’écart entre les expériences in vitro et les modèles animaux en créant de meilleurs modèles qui imitent le développement du corps humain, la physiologie et les maladies 4,5,6,7,8,9. Cependant, la reproductibilité et la répétabilité de ces modèles restent difficiles. De plus, la manipulation, la récolte, le transfert et la centrifugation de ces structures avec les technologies actuelles entraînent la perte ou l’endommagement des organoïdes et des sphéroïdes dans de nombreuses conditions, ce qui affecte considérablement les résultats.

Malgré de nombreux protocoles de coloration histologique, de coloration immunohistochimique, de marquage par immunofluorescence et de cryoconservation, il n’existe pas d’approche universelle liée à la normalisation des conditions expérimentales, à la manipulation et au traitement de ces structures délicates sans les perdre ou les endommager. Les protocoles actuels sont également incroyablement longs, alternant de quelques jours à plusieurs semaines, et comprennent des procédures complexes avec divers réactifs 10,11,12,13,14. De plus, la récolte, le pipetage, la centrifugation et le transfert de structures de culture 3D entre les récipients de culture cellulaire et les cryoviales provoquent des changements dans le positionnement des structures et des forces mécaniques, et affectent finalement la différenciation et la maturation des organoïdes et des sphéroïdes. Il a été rapporté que la topologie des tissus, le positionnement des cellules et les forces mécaniques ont un impact significatif sur la différenciation et la maturation cellulaires 6,15,16,17.

Par conséquent, il est souhaitable d’améliorer les technologies conventionnelles actuelles pour générer des organoïdes et des sphéroïdes de qualité stable. Une méthode/un dispositif qui sautera la centrifugation et les autres étapes décrites ci-dessus et fournira le matériau dans un seul environnement sûr du début à la fin des multiples processus serait bénéfique pour obtenir les données les plus cohérentes et les plus fiables. De plus, cela réduira les contraintes de temps, de main-d’œuvre et de coûts.

Le dispositif polyvalent (DM) décrit ici fournit un environnement sûr unique pour de multiples processus d’organoïdes et de sphéroïdes (Figure supplémentaire 1). Ce dispositif et les protocoles complémentaires éliminent les étapes de récolte, de pipetage, de transfert et de centrifugation. Les organoïdes et les sphéroïdes restent dans leur environnement in vitro pendant les processus séquentiels. Cet environnement comprend principalement des composants naturels ou synthétiques de la matrice extracellulaire, comme les hydrogels disponibles dans le commerce. En d’autres termes, les méthodes décrites ici permettent de traiter, d’examiner et de congeler un échantillon entier d’organoïdes / sphéroïdes tout en restant dans une goutte d’hydrogel.

Le dispositif biocompatible résiste à des températures comprises entre 60 °C et -160 °C, ce qui permet de restaurer les organoïdes/stéroïdes dans un réservoir d’azote liquide à -160 °C ou de préparer des blocs de résine pour la microscopie électronique à 60 °C. La niche du dispositif a été conçue pour définir un espace limité pour les structures de croissance 3D et stimuler la formation de sphéroïdes ou d’organoïdes sur la base des études précédentes 18,19,20,21,22,23. Cette partie de l’appareil est transparente et contient un plastique spécifique qui offre une qualité optique élevée (indice de réfraction : 1,43 ; valeur abbe : 58 ; épaisseur : 7,8 mil [0,0078 in ou 198 μm]). La niche et la partie « latérale » environnante provoquent une autofluorescence. La niche transparente au centre a une surface de 80 mm 2, tandis que la partie latérale est de 600 mm². La profondeur du conteneur est de 15 mm et l’épaisseur est de 1,5 mm. Ces caractéristiques, outre la taille et la conception de l’appareil, permettent de réaliser des observations sous différents types de microscopes de haute technologie et de préparer les échantillons pour des examens au microscope électronique (Figure 2). Le système de fermeture de l’appareil fournit deux positions, l’une scellée dans le congélateur et l’autre permettant l’écoulement du gaz dans l’incubateur. Les essais de prolifération et de cytotoxicité CCK8 démontrent des effets similaires sur les cellules par rapport aux boîtes de culture cellulaire traditionnelles (figure supplémentaire 2). Le test d’exclusion du bleu de trypan démontre une viabilité cellulaire élevée (94%) lors de la culture cellulaire dans la DM (Figure 3).

Les processus qui peuvent être effectués pour un échantillon dans le dispositif unique comprennent (1) la culture, (2) la coloration histologique, (3) l’immunomarquage, y compris le marquage immunohistochimique et immunofluorescence, (4) la congélation, (5) la décongélation, (6) l’examen au microscope optique, tel que les microscopes à fond clair, à fond noir, à fluorescence, confocaux et à superrésolution, (7) le revêtement et l’examen directement sous un microscope électronique à balayage, ou (8) la préparation à la microscopie électronique à transmission ( Graphique 2).

Différentes méthodologies existent pour la coloration histologique, le marquage immunohistochimique ou le marquage fluorescent des organoïdes et des sphéroïdes 10,11,12,13,14,24,25. Les récolter à partir de l’hydrogel est la première et principale étape de la technologie actuelle. Après cette étape, certaines méthodes permettent l’immuno-marquage à montage entier. Les organoïdes récoltés sont incorporés dans de la paraffine, sectionnés et étiquetés pour la coloration et l’immunomarquage chez les autres. Cependant, les sections peuvent ne pas présenter l’échantillon complet et ne fournir que des données limitées liées à l’architecture 3D de la structure. De plus, les dommages causés à ces structures 3D et la perte d’antigénicité sont des effets secondaires bien connus de ces technologies.

Les nouveaux protocoles complémentaires pour les examens microscopiques de cet article permettent une analyse d’échantillons entiers encore dans un hydrogel. Les protocoles décrits ici comprennent deux formulations nouvellement développées : solution pour immunohistochimie (S-IHC) et solution pour marquage par immunofluorescence (S-IF). Les méthodes avec ces solutions permettent aux chercheurs d’obtenir des données plus précises, car il n’y a pas d’effets néfastes des flux de travail traditionnels, tels que la centrifugation, le pipetage et le transfert des structures délicates. Le protocole décrit ici élimine également le besoin d’étapes de prélèvement, de blocage, de défrichage et de récupération de l’antigène, et raccourcit l’ensemble de la procédure à 6-8 heures. De plus, la méthodologie permet d’ajouter simultanément un à trois anticorps au même S-IF. Par conséquent, il est possible d’obtenir les résultats le même jour même après les multiples expériences d’étiquetage, ce qui est un autre avantage du protocole décrit ici; Les protocoles traditionnels d’étiquetage par immunofluorescence à montage entier prennent généralement entre 3 jours et plusieurs semaines 10,11,12,13,14.

L’incorporation de paraffine, une autre étape néfaste qui réduit l’antigénicité, est également omise. La structure 3D reste dans son environnement in vitro du début à la fin de l’examen microscopique. Étant donné que la structure 3D reste dans ses conditions de croissance, les données d’expression et de localisation des protéines imitent mieux les conditions in vivo . Des résultats plus précis sont attendus, car la méthodologie élimine les étapes affectant l’expression de l’antigène de l’échantillon. Les tableaux 1 et 2 montrent comment ces nouveaux protocoles éliminent les étapes, permettent d’économiser du temps et de la main-d’œuvre en laboratoire et de réduire les coûts et les déchets par rapport aux flux de travail traditionnels.

En plus des étapes cruciales décrites ci-dessus, un autre problème est de fournir un milieu de cryoconservation et une méthode pour préserver la structure 3D de l’échantillon avec des taux de viabilité cellulaire plus élevés 26,27,28,29,30,31. La cryoconservation est essentielle pour créer un système modèle stable et permettre la biobanque d’organoïdes et de sphéroïdes^32,33. La biobanque de l’ensemble de la structure 3D originale permettra une récapitulation plus fidèle de l’état naturel de santé ou de maladie. Les considérations clés sont la commodité et la fiabilité de la cryoconservation et la décongélation des organoïdes / sphéroïdes. La récupération des organoïdes post-dégel est très faible dans la plupart des technologies actuelles, souvent inférieure à 50%. Cependant, des études récentes ont montré des résultats prometteurs avec des taux de survie améliorés^26,27,28,29. Lee et al. ont démontré que 78% des cellules sphéroïdes ont survécu après la cryoconservation lorsqu’ils ont utilisé la solution de l’Université du Wisconsin contenant 15% de DMSO²⁸. Le rapport de survie cellulaire a augmenté à 83% dans l’étude d’Arai et ^al.29. Cependant, les résultats après cryoconservation sont considérablement affectés car les structures 3D ne peuvent pas maintenir les mêmes caractéristiques et qualités. En outre, des réactifs sans sérum sont nécessaires pour les bonnes pratiques de fabrication dans les environnements pharmaceutiques et diagnostiques. Les flux de travail traditionnels utilisent un milieu contenant du sérum bovin fœtal (FBS) et du diméthylsulfoxyde (DMSO) pour la méthode de congélation lente, qui sont tous deux associés à des handicaps. FBS est un produit d’origine animale et peut avoir des variations de lot. Le DMSO est un cryoprotecteur très efficace, mais une exposition à long terme, en particulier lors de la décongélation, peut provoquer des effets cytotoxiques^30,31.

Cet article décrit également la méthodologie de congélation / décongélation d’organoïdes entiers ou de sphéroïdes encore dans un hydrogel. Deux formules pour congeler des organoïdes et des sphéroïdes sont utilisées dans l’étude : (1) 10% de DMSO contenant une solution de congélation traditionnelle (FS) et (2) un milieu de cryoconservation sans sérum et DMSO. Ce milieu de cryoconservation contient des composants de matrice extracellulaire, qui sont différents des formules actuelles. La matrice extracellulaire comprend deux classes principales de macromolécules, les protéoglycanes et les protéines fibreuses, qui sont essentielles pour l’échafaudage physique des constituants cellulaires, mais qui initient également les processus nécessaires à la morphogenèse, à la différenciation et à l’homéostasie tissulaires 34,35,36,37,38,39,40 . Les collagènes fournissent une résistance à la traction, régulent l’adhésion cellulaire, soutiennent la chimiotaxie et la migration, et dirigent le développement tissulaire³⁷. De plus, les fibres d’élastine assurent le recul des tissus qui subissent des étirements répétés³⁸. Une troisième protéine fibreuse, la fibronectine, dirige l’organisation de la matrice extracellulaire interstitielle et joue un rôle crucial dans la médiation de la fixation cellulaire et fonctionne comme un mécano-régulateur extracellulaire³⁹. Du et al. ont démontré l’effet cryoprotecteur de l’hydrolysat de collagène de poulet sur le système modèle naturel d’actomyosine⁴¹. Leurs résultats suggèrent que l’hydrolysat de collagène peut inhiber la croissance des cristaux de glace, réduire la dénaturation et l’oxydation des protéines de la même manière que les cryoprotecteurs commerciaux et fournir une meilleure structure de gel après les cycles de gel-dégel. Par conséquent, l’ajout de composants de matrice extracellulaire au milieu de cryoconservation fournit un environnement plus sûr et protecteur pour l’échantillon et favorise la guérison des structures vivantes après congélation-décongélation.

De plus, la présente étude décrit un protocole simple pour marquer les membranes cytoplasmiques et les noyaux d’organoïdes et de sphéroïdes vivants alors qu’ils sont encore dans l’hydrogel.

1. Culture d’organoïdes et de sphéroïdes

1. Placez l’hydrogel sur de la glace pendant la nuit (dans un réfrigérateur ou une chambre froide) pour le décongeler.
2. Placer l’appareil polyvalent disponible dans le commerce (DM; voir le tableau des matériaux) dans l’incubateur 1 jour avant l’expérience (37 °C, 5% CO₂) pour le réchauffer.
3. Placer les pointes de pipettes larges stériles au réfrigérateur à 4 °C.
   REMARQUE : Les étapes 1.1 à 1.3 doivent être effectuées le jour 0 et les étapes 1.4 à 1.11 doivent être effectuées le jour 1.
4. Placez l’hydrogel sur de la glace dans une hotte à écoulement laminaire pendant 15 min.
   1. Facultatif : Diluer l’hydrogel dans un milieu de culture cellulaire froid conformément aux recommandations du fabricant.
5. Placer le tube contenant une pastille de cellules HepG2 (lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire obtenue commercialement; voir le tableau des matériaux) sur de la glace.
6. Plaque 30-35 μL d’hydrogel 100% dans la niche de l’appareil préchauffé pour créer une goutte de gel.
7. Placer 10 000 cellules HepG2 au milieu du haut de chaque goutte d’hydrogel (Figure 2) et incuber pendant 15 min à 37 °C.
8. Couvrir la goutte d’hydrogel avec 200 μL de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10% de sérum bovin fœtal.
9. Couvrez le couvercle du MD dans la bonne position pour permettre l’écoulement du gaz et placez l’appareil dans l’incubateur.
10. Alimentez les cellules avec 200 μL de DMEM avec 10% FBS tous les deux jours.
11. Vérifiez la croissance des sphéroïdes au microscope inversé (Figure 3). La formation sphéroïde commence après le^{3ème jour.} La vidéo 1 montre l’emplacement des sphéroïdes à différents niveaux dans un dôme d’hydrogel.
    NOTES: Il est fortement recommandé d’aspirer doucement le liquide entourant l’hydrogel et d’ajouter lentement le nouveau liquide à l’environnement pour éviter d’endommager les gouttes d’hydrogel.

2. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine d’organoïdes/sphéroïdes entiers dans un hydrogel

1. Réchauffer le fixateur (4% de paraformaldéhyde; PFA), PBS et hématoxyline (voir le tableau des matières) jusqu’à 37 °C.
2. Aspirer le milieu entourant la goutte d’hydrogel avec une pipette, ajouter 100-200 μL de PFA à 4% à fixer, et incuber pendant 15-20 min à 37 °C.
3. Aspirer le PFA à 4 % et ajouter 200 μL de PBS pour laver 3x pendant 5 min chacun à 37 °C. Ensuite, aspirer le PBS et incuber avec 200 μL de solution d’hématoxyline pendant 15-20 min à 37 °C.
4. Aspirer l’hématoxyline et ajouter 200 μL de_dH2Opour laver 3x pendant 10 min chacun à 37 °C. Aspirer le_dH2Oet incuber avec 200 μL d’éthanol pendant 5-10 min à 37 °C.
5. Aspirer l’éthanol et incuber avec 200 μL d’éosine (voir tableau des matériaux) pendant 10 min à 37 °C. Aspirer l’éosine et ajouter 200 μL de_dH2Opour laver pendant 5 min à température ambiante (RT).
6. Aspirer le_dH2Oet ajouter 100 μL de glycérol pour couvrir la goutte d’hydrogel comme support de montage.
7. Facultatif : Montez la niche avec un couvercle. Cette étape peut être omise pour éviter de presser des organoïdes / sphéroïdes de taille considérable.
8. Fermez fermement le couvercle de MD pour éviter le séchage jusqu’à l’examen. L’échantillon est stable pour examen pendant au moins 6 mois.

3. Immunohistochimie d’organoïdes/sphéroïdes entiers dans un hydrogel

1. Réchauffer la solution commercialement obtenue pour l’immunohistochimie (S-IHC; voir le tableau des matériaux) à 37 °C.
2. Incuber les organoïdes ou sphéroïdes dans l’hydrogel avec 3% de peroxyde d’hydrogène (_H2O2) dans 200 μL de_dH2O pendant 5 min à 37 °C.
3. Aspirer la solution de peroxyde d’hydrogène et laver en_dH2Opendant 5 min à 37 °C. Aspirer le_dH2Oet incuber deux fois avec 100 μL de S-IHC à 37 °C pendant 10 min chacun.
4. Aspirer le S-IHC et incuber avec 100 μL d’anticorps primaire (voir le tableau des matériaux) dilué dans du S-IHC pendant 1-2 h à 37 °C (en suivant les recommandations du fabricant concernant la dilution de travail).
5. Aspirer la solution d’anticorps primaires et incuber avec 100 μL de S-IHC 3x pendant 5 min chacun à 37 °C.
6. Aspirer 100 μL de S-IHC et incuber avec un anticorps secondaire biotinylé (voir le tableau des matières) pendant 10 min à 37 °C.
7. Aspirer la solution d’anticorps secondaires et incuber avec 100 μL de S-IHC 3x pendant 5 min chacun à 37 °C. Aspirer le S-IHC et incuber avec 100 μL de streptavidine marquée peroxydase de raifort (HRP) (voir le tableau des matériaux) pendant 10 min à 37 °C.
8. Aspirer la streptavidine marquée HRP et incuber avec 100 μL de S-IHC 3x pendant 5 min chacun à 37 °C.
9. Aspirer le S-IHC et incuber avec 100 μL de mélange de solution chromogène DAB/AEC (voir le tableau des matières) pendant 5-10 min à 37 °C.
10. Surveillez l’intensité de la coloration au microscope optique.
11. Laver avec_dH2O3x pendant 2 min chacun.
12. Facultatif : Incuber avec 100 μL d’hématoxyline (voir le tableau des matières) pour la contre-coloration nucléaire pendant 5 min à 37 °C.
13. Aspirer l’hématoxyline et laver en_dH2Opendant 5 min.
14. Aspirer le_dH2Oet couvrir la goutte d’hydrogel avec 100 μL de glycérol comme support de montage.
15. Fermez fermement le couvercle du MD jusqu’à l’examen microscopique.
    NOTES: Les étapes de récupération d’antigènes et de blocage des protéines sont omises dans ce protocole puisque S-IHC élimine ces étapes.

4. Marquage par immunofluorescence d’organoïdes/sphéroïdes entiers dans un hydrogel

1. Réchauffer les matières suivantes à 37 °C : PFA à 4 %, PBS, S-IF, solution d’anticorps primaires dans S-IF, solution d’anticorps secondaires dans S-IF, coloration nucléaire et glycérol (voir le tableau des matières).
2. Aspirer le milieu de culture cellulaire et fixer avec 200 μL de PFA à 4% pendant 15-30 min à 37 °C. Aspirer le fixateur et laver en S-IF 3x pendant 10 min chacun à 37 °C.
3. Ajouter dH₂O sur le côté entourant la niche pour fournir de l’humidité pendant les étapes suivantes.
4. Aspirer le S-IF entourant la goutte d’hydrogel et incuber la goutte d’hydrogel avec 100 μL de solution d’anticorps primaires (voir le tableau des matériaux) dans du S-IF pendant 30-60 minutes à 37 °C.
5. Aspirer la solution d’anticorps primaire et laver en S-IF 3x pendant 10 min chacun à 37 °C.
6. Aspirer le S-IF et incuber avec 100 μL de solution d’anticorps secondaires (voir Tableau des matériaux) dans S-IF pendant 30-60 min à 37 °C dans l’obscurité.
7. Aspirer la solution d’anticorps secondaires et laver avec du PBS 3x pendant 10 min chacun à 37 °C dans l’obscurité.
8. Aspirer le PBS et incuber avec 100 μL de coloration d’ADN nucléaire contenant un milieu de montage ou du glycérol à 37 °C dans l’obscurité.
9. Remplissez la niche avec du glycérol pour éviter le dessèchement.
10. Facultatif : Couvrez la niche avec un bordereau de couverture. Cette étape peut être omise pour éviter de presser les organoïdes/sphéroïdes.
11. Fermez bien le MD. Les échantillons en DM peuvent être conservés à 4 °C dans l’obscurité pendant au moins 6 mois avec une perte minimale de fluorescence.
12. Utilisez les paramètres suivants pour l’examen microscopique confocal : réglez la valeur du sténopé de tous les canaux sur 20,1, maintenez la constante du gain maître à 550 pour 488 nm, 485 pour 550 nm et 450 pour 594 nm, maintenez la puissance laser constante pour toutes les expériences et le pourcentage le plus bas à 2,0.
    NOTES: Anticorps primaires: Anti-Na-K ATPase (1:100), Anti-Arginase (1:50), Anti-Albumine (1:50), Anti-Bêta-galactosidase (1:25), Anticorps antimitochondrial (1:100), Anti-Golgi Antibody (1:50), Anti-Cytokeratin 5 (1:100), Ov6 anticorps (1:100). Anticorps secondaires : IgG (H+L)-488 de chèvre, IgG (H+L)-550 de chèvre anti-lapin, IgG (H+L)-488 de chèvre anti-souris, IgG (H+L)-550 de chèvre, IgY(H+L)-647 de chèvre. La dilution pour tous les anticorps secondaires est de 1:100. De plus, la FITC-phalloïdine (1:100), un anticorps conjugué, est également utilisée (voir le tableau des matières).

5. Marquage de la membrane plasmique et du noyau d’organoïdes vivants et de sphéroïdes dans un hydrogel

1. Préparer une solution d’étiquetage contenant de l’agglutinine de germe de blé fluor Alexa (5,0 μg/mL) et Hoechst (2 μM) dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS), conformément aux recommandations du fabricant (voir le tableau des matériaux), et chauffer à 37 °C.
2. Aspirer le milieu de culture cellulaire et ajouter 100 μL de solution de marquage pour couvrir la goutte d’hydrogel. Incuber pendant 15-30 min à 37 °C.
3. Retirer la solution d’étiquetage et laver deux fois dans du PBS 2x pendant 10 min chacun à 37 °C. Facultatif : Fixer avec 200 μL de formaldéhyde à 4 % pendant 15 min à 37 °C.
4. Couvrir la goutte d’hydrogel avec du glycérol comme support de montage. Facultatif : Montez la niche avec un verre de couverture.
5. Fermez hermétiquement le couvercle du MD et conservez-le au réfrigérateur dans l’obscurité jusqu’à l’examen microscopique confocale/fluorescent. Il est stable pendant au moins 6 mois.

6. Congélation et décongélation d’organoïdes/sphéroïdes entiers dans un hydrogel

1. Congelez les organoïdes en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Réchauffer la solution de congélation obtenue commercialement (FS; voir tableau des matières) à 37 °C.
   2. Aspirez doucement le milieu de culture cellulaire entourant le dôme d’hydrogel.
   3. Ajouter délicatement 200 μL de FS. Incuber l’échantillon avec FS à 37 °C pendant 1 h.
   4. Fermez hermétiquement le couvercle de l’appareil et placez-le dans une boîte en mousse. Placez cette boîte en mousse dans une autre boîte en mousse, comme illustré à la figure supplémentaire 3. Fermez hermétiquement les deux boîtes en mousse. Deux boîtes en mousse l’une à l’intérieur de l’autre fournissent une plage de gradient de refroidissement de température de 1 à 2 ° C / min de l’échantillon dans un congélateur de -20 ° C.
   5. Placez la boîte à -20 °C pendant 2 h. Transférer la boîte dans un congélateur à -80 °C et la laisser toute la nuit.
   6. Sortez l’échantillon des boîtes. L’échantillon dans le MD peut être conservé dans le congélateur à -80 °C pendant 6 mois.
   7. Transférer le DM qui contient l’échantillon dans le réservoir d’azote liquide pour un stockage à plus long terme.
2. Décongeler les organoïdes en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Sortez le MD contenant l’échantillon du congélateur/réservoir d’azote et placez-le directement dans un incubateur à 37 °C. Incuber pendant 1 h à 37 °C.
   2. Ajouter 200 μL de milieu de culture chaud à la niche (le rapport FS/milieu de culture cellulaire est de 1:1) et incuber pendant 30 min à 37 °C.
   3. Ajouter plus de milieu de culture chaud à la niche (le rapport FS/milieu de culture cellulaire est de 1:2) et incuber pendant 30 min à 37 °C.
   4. Aspirer doucement le milieu et le mélange FS. Procéder à l’imagerie par microscopie électronique à balayage (étape 7) et par microscopie électronique à transmission (étape 8) des organoïdes/sphéroïdes montés sur l’ensemble dans l’hydrogel.

7. Microscopie électronique à balayage d’organoïdes/sphéroïdes entiers

1. Réchauffez la solution fixatrice et post-fixative de Karnovsky (voir le tableau des matériaux) à température ambiante (RT).
2. Aspirer le milieu de culture cellulaire entourant l’hydrogel dans le MD. Placer l’échantillon dans le MD sur de la glace dans la hotte à flux laminaire pendant 15 min.
3. Aspirez très doucement l’hydrogel liquéfié entourant les organoïdes/sphéroïdes. Une quantité limitée de matrigel peut rester dans la niche pour éviter d’endommager et de perdre l’échantillon.
4. Fixer avec le fixateur de Karnovsky (PFA à 2 %, 2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate 0,15 M et 2 mM de CaCl₂; voir le tableau des matériaux) à TA pendant 1 h.
5. Aspirer doucement le fixateur et laver à l’eau distillée (_dH2O) 3x pendant 15 min chacun.
6. Aspirer doucement le_dH2Oet fixer avec une solution post-fixatrice (tétroxyde d’osmium aqueux à 1 % [OsO₄]; voir tableau des matériaux) à TA pendant 1 h.
7. Aspirer doucement le post-fixateur et laver à l’eau distillée (_dH2O) 3x pendant 15 min chacun.
8. Déshydrater dans une série graduée d’éthanol (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 96 %, 100 %), mélange d’éthanol/acétone (1:1; 1:2) et d’acétone absolue à TA pendant 15 minutes chacun.
9. Sécher avec un séchoir à point critique.
10. Enduire l’échantillon de l’appareil avec de l’or/palladium de 6 nm à l’aide d’une pulvérisation (voir le tableau des matériaux) pendant 90 s.
11. Observer au microscope électronique à balayage avec un détecteur d’électrons secondaire intégré à la lentille à 2-3 kV en mode vide (5 x ^10-6 mA). Prenez des images avec une distance de travail de 8,1 à 8,2 mm et à des grossissements de 675x, 1050x et 1570x.
    NOTES: Toutes les étapes sont effectuées dans le MD. Utilisez 200-250 μL de solution pour chaque étape.

8. Microscopie électronique à transmission d’organoïdes/sphéroïdes entiers dans un hydrogel

1. Réchauffer le fixateur de Karnovsky à 37 °C. Aspirer le milieu de culture cellulaire entourant l’hydrogel dans le MD.
2. Fixez l’échantillon avec le fixateur de Karnovsky à RT pendant 1 h. Laver avec dH₂O 3x pendant 15 min chacun.
3. Post-fixation avec 2% d’OsO₄ aqueux et 2,5% de ferrocyanure de potassium à TA pendant 45 min. Laver avec dH₂O 3x pendant 10 min chacun.
4. Incuber dans 0,5 % de thiocarbohydrazide (TCH; voir tableau des matières) à TA pendant 30 min. Laver avec dH₂O 3x pendant 10 min chacun.
5. Incuber dans 2% d’OsO₄ aqueux à TA pendant 30 min. Laver avec dH₂O 3x pendant 10 min chacun.
6. Incuber dans une solution d’acétate d’uranyle à 2 % (voir tableau des matières) à TA pendant 1 h.
   REMARQUE: Dans cette étape, les sphéroïdes peuvent être maintenus à 4 ° C pendant la nuit.
7. Incuber dans une solution d’aspartate de plomb (voir tableau des matières) à 60 °C pendant 45 min. Laver avec dH₂O 3x pendant 10 min chacun.
8. Déshydrater dans une série graduée d’éthanol (50 %, 70 %, 90 %, 100 % [x2]) et d’acétone absolue à TA pendant 15 min chacun.
9. Traiter avec un mélange de (1:1; 1:2) d’acétone/résine Epon et de résine Epon pure (voir tableau des matériaux) à TA pendant 2 h chacun.
10. Polymériser la résine à 60 °C pendant une nuit (minimum 16 h). Après la polymérisation, retirer le bloc de résine du MD, comme indiqué à la figure supplémentaire 4.
11. Fixez le bloc de résine à un plus grand avec une colle à résine. Coupez le bloc et atteignez l’emplacement des organoïdes ou des sphéroïdes.
12. Obtenez des sections semi-minces (1 000 nm) et ultra-minces (60 nm) à l’aide d’un ultramicrotome (voir le tableau des matériaux).
13. Placez les sections ultra-minces sur des grilles de cuivre à 100 mailles et observez-les au microscope électronique à balayage avec un détecteur STEM à une tension d’accélération de 30 kV. Capturez des images avec une distance de travail de 44 mm et des grossissements de 2580x, 5020x et 6060x.
    NOTES: Utilisez 200-250 μL de solution pour chaque étape. Les étapes 8.1 à 8.10 sont effectuées dans le DM.

Le présent article représente un dispositif polyvalent (DM) et des méthodologies complémentaires pour la culture, la congélation, la décongélation, la coloration histologique, la coloration immunohistochimique, le marquage par immunofluorescence, l’enrobage et le traitement d’organoïdes entiers ou de sphéroïdes tout en restant dans un hydrogel dans un seul environnement conçu de manière unique. La présente étude a été conçue pour préparer des sphéroïdes du cancer du foie HepG2 dans 35 gouttes d’hydrogel dans 35 MD. Les expériences ont été menées en triple exemplaire pour assurer la précision. De plus, les organoïdes pulmonaires dans les DM ont été marqués immunofluorescents à titre d’exemple pour démontrer les résultats des méthodologies actuelles pour les études organoïdes.

La figure 1 montre un examen attentif de l’appareil contenant un dôme d’hydrogel. La taille et la forme de la niche sont conçues pour fournir un environnement protecteur pour l’hydrogel contenant les organoïdes / sphéroïdes et économiser les réactifs utilisés au cours de divers processus. De plus, la partie latérale du dispositif qui entoure la niche peut être utilisée comme chambre d’humidité lors d’expériences d’immunomarquage. Le milieu pour alimenter l’échantillon peut varier entre 100 et 200 μL, en fonction de la hauteur de la goutte d’hydrogel. La présente étude se concentre sur la méthode à base de dôme, car de nombreux hydrogels, composants commerciaux de la matrice extracellulaire et extraits de membrane basale permettent à l’utilisateur de préparer des gouttes. Cependant, il est également possible de remplir la niche du MD avec l’hydrogel, puis d’ensemencer les cellules à l’intérieur pour générer des organoïdes / sphéroïdes. Cette méthode peut être préférée si la viscosité de la matrice ne permet pas la préparation de dômes ou si l’expérience comprend de grands volumes d’organoïdes. Le type d’hydrogel et le rapport hydrogel/milieu pour la préparation des gouttes peuvent varier selon le type de cellule, la conception expérimentale et le milieu. Graphique 1  représente également la conception du dispositif qui permet d’étudier les organoïdes / sphéroïdes sous des microscopes électroniques à fond clair, confocaux et à balayage alors que les organoïdes / sphéroïdes sont encore dans leur environnement in vitro natif.

La figure 2 montre comment ensemencer des cellules dans un hydrogel et examiner le développement de sphéroïdes ou d’organoïdes. La conception et les dimensions de l’appareil polyvalent ont également été présentées dans cette figure. La vidéo 1 montre l’emplacement de sphéroïdes en croissance 3D dans un hydrogel. La figure 3 représente des images en direct de sphéroïdes en croissance du jour 3 au jour 21. Le temps de formation des sphéroïdes et des organoïdes peut varier en fonction de la nature de l’échantillon. Par exemple, les sphéroïdes des cellules HepG2 et des cellules HEK se sont formés en 3 jours, tandis que la formation d’organoïdes hépatiques et biliaires a duré 2 semaines pendant les expériences.

Des sphéroïdes colorés à l’hématoxyline et à l’éosine sont observés à la figure 4. L’image représente des sphéroïdes bien conservés et colorés de manière homogène de différentes tailles et fusions de sphéroïdes. Les cellules vivantes au centre des sphéroïdes sont remarquables. L’image montre également les connexions délicates entre les cellules de différents sphéroïdes. Ces connexions fragiles ne pouvaient pas être visualisées après les flux de travail traditionnels, car le transfert, le pipetage ou la centrifugation les endommagerait. Graphique 5  démontre l’immunocoloration des sphéroïdes avec l’anticorps spécifique de l’arginase, l’un des marqueurs les plus courants pour le diagnostic et le pronostic du carcinome hépatocellulaire42,43. Les micrographies révèlent des cellules cancéreuses du foie différenciées et indifférenciées dans les mêmes sphéroïdes. Cette figure contient des images avec et sans contre-coloration à l’hématoxyline. Les chercheurs pourraient choisir d’omettre la contre-coloration avec de l’hématoxyline dans les cas où il serait difficile de différencier les zones marquées dans une structure 3D.

La figure 6 représente un autre protocole simple pour la visualisation à montage entier d’organoïdes/sphéroïdes vivants dans un hydrogel : la coloration de la membrane cellulaire vivante et du noyau. La méthodologie permet la même densité de marquage à la périphérie et au centre, montrant une pénétration complète du réactif. Les figures 7, 8 et 9 montrent des images représentatives de sphéroïdes marqués avec un, deux ou trois anticorps, respectivement. Un à trois anticorps primaires sont dilués simultanément dans S-IF. De même, un à trois anticorps secondaires correspondants adaptés à l’expérience sont dilués simultanément dans S-IF. Le protocole d’immunomarquage permet aux chercheurs de marquer les structures 3D en 4 à 6 heures sans les perdre ou les endommager. Le contexte est transparent et la technologie utilisée ici ne nécessite pas de méthodes / solutions supplémentaires de nettoyage, de récupération d’antigènes ou de blocage. La méthode permet également aux chercheurs d’étiqueter l’échantillon avec plusieurs anticorps en une seule étape. En d’autres termes, l’utilisateur prépare une solution contenant un à trois anticorps primaires et une autre solution correspondant à un à trois anticorps secondaires. Le protocole décrit ici élimine les étapes de marquage séquentielles avec différents anticorps dans les méthodologies conventionnelles.

La figure 10 représente des images de microscopie électronique à balayage et à transmission des sphéroïdes. La première rangée montre des images de sphéroïdes entiers dans le MD sous un microscope électronique à balayage. La deuxième rangée contient des images de microscopie électronique à transmission de sphéroïdes après préparation des blocs de résine contenant des sphéroïdes entiers dans le MD, ainsi que des images de sphéroïdes sectionnés et colorés. Des organites cytoplasmiques bien conservés et d’autres caractéristiques ultrastructurales des cellules démontrent l’efficacité de ce protocole simple, qui protège la structure 3D de l’ensemble de l’échantillon. Le MD permet également aux chercheurs de congeler et de décongeler les échantillons entiers dans un hydrogel. Graphique 11  Démontre les dômes d’hydrogel et les sphéroïdes à un grossissement plus élevé avant et après la congélation. L’irrégularité aux limites du dôme d’hydrogel est notable. Cependant, la rondeur des sphéroïdes cryoconservés est presque stable après décongélation par rapport aux sphéroïdes avant congélation. Des méthodes de marquage de la membrane cellulaire vivante et du noyau sont également appliquées 48 heures après la décongélation pour démontrer comment la procédure de congélation / décongélation a affecté l’architecture 3D, la membrane cellulaire et la viabilité cellulaire. La solution de congélation traditionnelle contenant du diméthylsulfoxyde et la solution nouvellement formulée actuelle, le SF, donnent des résultats similaires. Plus de 75% des structures 3D pourraient survivre dans ce protocole. Cependant, d’autres expériences sont nécessaires pour révéler les effets secondaires à long terme de chaque formulation sur les organoïdes et les sphéroïdes.

Les tableaux 1 et 2 comparent les flux de travail traditionnels avec ceux décrits ici en fonction du nombre d’étapes, de la durée et de la production de déchets (c.-à-d. le nombre total de gants en plastique, d’embouts de pipettes, de pipettes sérologiques, de tubes de centrifugation, de tubes de microcentrifugeuses, de récipients de culture cellulaire, de cryoviales, etc. pour chaque flux de travail).

La figure supplémentaire 1 représente les étapes séquentielles qui peuvent être effectuées dans un seul DM schématiquement. La figure supplémentaire 2 montre les résultats des expériences conçues pour comparer la viabilité cellulaire, la toxicité et les taux de prolifération des cellules HepG2 dans un MD ou un plat traditionnel à fond de verre. La figure supplémentaire 3 montre les boîtes en mousse qui ont été utilisées pour congeler les échantillons dans les DM. La figure supplémentaire 4 résume les étapes pour retirer un bloc de résine d’un DM. La figure supplémentaire 5 comprend des images d’organoïdes des voies respiratoires qui ont été marqués par immunofluorescence puis visualisés alors qu’ils étaient encore dans des DM. De même, la vidéo 2 montre deux organoïdes des voies respiratoires marqués par immunofluorescence dans un MD. Enfin, la figure supplémentaire 6 est un graphique comparant l’intensité moyenne de l’intensité du marquage de la membrane cellulaire chez les sphéroïdes vivants avant et après la congélation en utilisant le flux de travail traditionnel et le flux de travail décrit ici. Le logiciel Image J a été utilisé pour l’analyse.

Figure 1 : Le dispositif de culture cellulaire polyvalent (DM). (A) La niche (N), la partie centrale du dispositif, est conçue pour créer un environnement protecteur pour les organoïdes/sphéroïdes cultivés dans une goutte d’hydrogel (D) au cours des processus séquentiels. Le côté (S), la partie environnante de la niche, peut être utilisé comme chambre d’humidification lors d’expériences d’immunomarquage. (B) Le centre transparent dans le couvercle permet à l’utilisateur d’observer les organoïdes/sphéroïdes lorsque l’appareil est fermé. (C) Le dôme d’hydrogel contenant des organoïdes dans le MD peut être coloré ou incorporé dans un bloc de résine pour la microscopie électronique à transmission. Le couvercle comprend également la niche (N) pour la méthodologie de la goutte suspendue. La taille et la conception du dispositif permettent à l’utilisateur d’examiner les organoïdes/sphéroïdes sous (D) microscopes électroniques à fond clair, (E) confocaux et (F) microscopes électroniques à balayage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Ensemencement des cellules à l’intérieur d’un hydrogel. (A) La pastille de cellule dans la pipette est insérée dans le haut du dôme. Après 3-5 jours, les sphéroïdes deviennent visibles dans le dôme, en particulier à la périphérie de la goutte. (B) Quatre images vivantes de sphéroïdes en croissance de chaque quartier dans un dôme ont été capturées et fusionnées. Barre d’échelle = 200 μm. (C)La conception et les dimensions (en centimètres) du dispositif polyvalent (MD). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Développer des sphéroïdes dans une goutte d’hydrogel du jour 3 au jour 21. Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Sphéroïdes entiers colorés à l’hématoxyline et à l’éosine dans le MD. Visualisation des connexions entre les cellules situées dans les sphéroïdes adjacents ou fusionnés. Les processus délicats entre les cellules (flèches) sont visibles puisque l’échantillon entier dans l’hydrogel est fixé, coloré et examiné sans endommager les structures de culture 3D. Barre d’échelle: jour 3, jour 9 = 50 μm; Jour 7, Jour 17 = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Coloration immunohistochimique de sphéroïdes entiers dans l’hydrogel dans le MD. Les échantillons ont été immunocolorés avec un anticorps spécifique à l’arginase. Les cellules arginases positives (flèches rouges) et négatives (flèches noires) sont observées dans les sphéroïdes. Les images proviennent de deux expériences: (A-C) sans et (D-F) avec contre-coloration avec hématoxyline. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Image confocale d’un organoïde vivant dans l’hydrogel. Les organoïdes vivants ont été marqués avec la membrane cellulaire vivante (WGA) et les taches de noyau (Hoechst). Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Marquage par immunofluorescence de sphéroïdes entiers dans un hydrogel avec un anticorps et une coloration nucléaire (Hoechst). (A-C) Le panneau supérieur montre un sphéroïde marqué avec un anticorps spécifique de Na-K ATPase dans la membrane cellulaire. (D-F) Le panneau inférieur montre l’emplacement d’un autre anticorps spécifique de l’arginase, une protéine cytosolique spécifique du carcinome hépatocellulaire, dans les sphéroïdes du cancer du foie. Durée du protocole de coloration : 6 h. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Marquage par immunofluorescence de sphéroïdes entiers dans un hydrogel avec deux anticorps et une coloration nucléaire (Hoechst). (A-C) Le panneau supérieur montre un sphéroïde marqué avec deux anticorps spécifiques de l’albumine et de l’Ov6. Barre d’échelle = 5 μm. (D-F) Le panneau inférieur montre l’emplacement de la protéine alpha feto et de l’Ov6 dans les sphéroïdes du cancer du foie. Barre d’échelle = 20 μm. Durée du protocole de coloration : 6 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Marquage par immunofluorescence de sphéroïdes entiers dans un hydrogel avec trois anticorps et une coloration nucléaire (Hoechst). (A-E) Le sphéroïde dans le panneau supérieur est marqué avec des anticorps spécifiques de l’arginase, de la Na-K ATPase et de la bêta-galactosidase. Barre d’échelle = 10 μm. (F-J) Le panneau du milieu montre un sphéroïde marqué avec Ov6, bêta-galactosidase et protéine alpha-fœto. Barre d’échelle = 20 μm. (K-O) Le sphéroïde dans le panneau inférieur a été marqué avec FITC-phalloïdine, anticorps anti-mitochondrial et anticorps anti-Golgi. Barre d’échelle = 20 μm. Notez la spécificité élevée de l’étiquetage et la réduction de l’arrière-plan. Durée du protocole de coloration : 6 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Images de microscopie électronique. (A-C) Balayage d’images au microscope électronique de sphéroïdes entiers dans l’hydrogel du MD. Barre d’échelle = 10 μm. (D-F) Les caractéristiques ultrastructurales des cellules d’un sphéroïde ont également été visualisées au microscope électronique à transmission. Barres d’échelle: (D) = 4 μm; (E,F) = 2 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11 : Images en direct de sphéroïdes avant et après congélation. (A-F) L’irrégularité des bordures des dômes d’hydrogel est évidente après le gel. Cependant, la taille et la rondeur des sphéroïdes restent similaires. (F) La migration cellulaire sur la surface de culture peut être observée après décongélation. (G-L) La membrane cellulaire vivante (WGA) et la coloration du noyau (Hoechst) démontrent une viabilité cellulaire similaire et des membranes cellulaires intactes avant et après la congélation des sphéroïdes entiers dans un hydrogel dans le MD. Échelle basr: (A,B,D,E) = 200 μm; (C,F,G-L) = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Comparaison du nombre d’étapes, du temps et de la production de déchets entre les flux de travail traditionnels et nouveaux au cours d’une expérience à court terme.

Tableau 2 : Comparaison entre l’immunomarquage conventionnel et le nouveau protocole d’immunomarquage.

Vidéo 1 : Série chronologique d’images à différents niveaux d’un hydrogel contenant des sphéroïdes sous un microscope à contraste de phase inversé. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Structure 3D de deux organoïdes des voies respiratoires marqués avec des anticorps contre la cytokératine 5 et le DAPI. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Figure supplémentaire 1 : Vue d’ensemble de l’expérience. Ce schéma montre les étapes expérimentales séquentielles pour la culture et l’examen d’organoïdes entiers dans un hydrogel. La technologie décrite ici permet de cultiver, de congeler, de décongeler, d’étiqueter et d’examiner les organoïdes sous différents microscopes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Comparaison de la viabilité cellulaire, de la toxicité et des taux de prolifération des cellules HepG2 dans un plat traditionnel à fond de verre ou un MD. Les cellules HepG2 ont été cultivées sur (A) une boîte de culture cellulaire traditionnelle à fond de verre ou (B) dans un DM pour comparer la viabilité cellulaire et la toxicité. C) L’essai d’exclusion du bleu de trypan a été utilisé pour démontrer la viabilité. Barre d’échelle = 20 μm. Les résultats ont été comparés à l’aide de tests de cytotoxicité (D-E) CCK8 et de prolifération cellulaire (F). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Disposition des deux boîtes en mousse. Une boîte en mousse est placée à l’intérieur de l’autre pendant le processus de congélation lente des organoïdes entiers ou sphéroïdes dans le MD. *indique les deux cases. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Étapes démontrant comment retirer la séquence de résine du MD après polymérisation de la résine. (A) Le bloc de résine entourant les sphéroïdes ou organoïdes est préparé à l’intérieur de la niche MD puis polymérisé. (B-D) Ensuite, avec une tige mince appropriée, le bloc de résine est poussé pour le retirer de la niche. (E) Ensuite, le bloc de résine, avec le plastique en dessous, est retiré. (F-G) Enfin, une pince à épiler est utilisée pour les séparer si le bloc est toujours attaché au plastique. (H) Le bloc est prêt pour une section mince. Les organoïdes ou sphéroïdes montés sur l’ensemble dans le bloc de résine (*) sont prêts pour la section pour la microscopie électronique à transmission. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 5 : Organoïdes des voies respiratoires marqués par immunofluorescence puis visualisés alors qu’ils étaient encore dans des DM. (A-C) Le panneau supérieur montre des organoïdes circulaires des voies respiratoires avec une lumière centrale. Le vert représente les cellules progénitrices des voies respiratoires exprimant la cytokératine 5 dans l’anneau le plus externe de l’organoïde, et le bleu représente les noyaux. Barre d’échelle = 50 μm. (D-F) Le panneau inférieur montre l’image tridimensionnelle des deux organoïdes côte à côte dans les filtres (D) DAPI et (E) Alexa 488, ainsi que l’image fusionnée (F). Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 6 : Comparaison de la densité de marquage sur les membranes cellulaires vivantes des cellules. Le graphique compare les sphéroïdes avant et après la congélation en utilisant le flux de travail traditionnel et actuellement adopté. L’analyse a été effectuée à l’aide du logiciel d’analyse d’images Image J. Abréviations : IntDen = Densité intégrée (intensité de fluorescence dans les sphéroïdes sélectionnés). CTCF = Fluorescence cellulaire totale corrigée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Ranan Gulhan Aktas est propriétaire de demandes de brevets MD, S-IHC, S-IF et FS. Olgu Enis Tok a participé au développement de ces produits. Olgu Enis Tok et Gamze Demirel sont membres de l’équipe de R&D de la société Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut et Ozgecan Kayalar n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.