Article de méthode

Évaluation du processus et cinétique de l’expression de la chitine désacétylase recombinante dans les cellules E . coli Rosetta pLysS à l’aide d’une technique statistique

DOI :

10.3791/64590

⸱

10 mars 2023

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans le protocole actuel, une technique statistique, le plan composite central (CCD), a été appliquée pour optimiser les conditions du processus d’expression de la chitine désacétylase bactérienne recombinante (BaCDA) dans les cellules E . coli Rosetta pLysS. L’utilisation du CCD a entraîné une augmentation de ~2,39 fois de l’expression et de l’activité du BaCDA.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces dernières années, la voie plus verte de la désacétylation de la chitine en chitosane à l’aide de l’enzyme chitine désacétylase a pris de l’importance. Le chitosane converti enzymatiquement avec des caractéristiques d’émulation a un large éventail d’applications, en particulier dans le domaine biomédical. Plusieurs chitines désacétylases recombinantes provenant de diverses sources environnementales ont été signalées, mais il n’existe aucune étude sur l’optimisation du processus de production de ces chitines désacétylases recombinantes. La présente étude a utilisé la méthodologie de conception composite centrale de la surface de réponse pour maximiser la production de chitine désacétylase bactérienne recombinante (BaCDA) chez E. coli Rosetta pLysS. Les conditions de traitement optimisées étaient de 0,061 % de glucose, de 1 % de lactose, d’une température d’incubation de 22 °C, d’une vitesse d’agitation à 128 tr/min et de 30 h de fermentation. Dans des conditions optimisées, l’expression due à l’induction du lactose a été initiée après 16 h de fermentation. L’expression maximale, la biomasse et l’activité de BaCDA ont été enregistrées 14 h après l’induction. Dans les conditions optimisées, l’activité de BaCDA de BaCDA exprimé a été augmentée de ~2,39 fois. L’optimisation du processus a permis de réduire le cycle total de fermentation de 22 h et le temps d’expression de 10 h après l’induction. Il s’agit de la première étude à rapporter l’optimisation du processus d’expression de la chitine désacétylase recombinante à l’aide d’une conception composite centrale et de son profilage cinétique. L’adaptation de ces conditions de croissance optimales pourrait aboutir à une production rentable et à grande échelle de la monéran désacétylase, moins explorée, s’engageant ainsi dans une voie plus verte pour la production de chitosane de qualité biomédicale.

Introduction

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La chitine, un polymère naturel lié à la β structurelle 1-4 glycosidique, est le deuxième polysaccharide le plus abondant dans la nature après la cellulose. Malgré ce fait, la chitine a des applications industrielles limitées en raison de son insolubilité1. Ce goulot d’étranglement est résolu en soumettant la chitine à la N-désacétylation, qui confère une charge positive et augmente la solubilité du polymère résultant, le chitosane1. La chitine peut être modifiée en chitosane par deux voies différentes : chimique et enzymatique. L’application biomédicale du chitosane nécessite une désacétylation contrôlée et définie, qui est limitée par les voies chimiques 2,3. Cette limitation peut être résolue à l’aide de chitines désacétylases (CDA), une approche enzymatique verte pour le processus de désacétylation 4,5.

La chitine désacétylase appartient à la famille des glucides estérases 4 (CE-4), définie dans la base de données des enzymes actives des glucides (CAZY). Les enzymes de la famille CE-4 partagent l’homologie NodB ou domaine polysaccharidique désacétylase en tant que région conservée. Le plan composite central (CCD), un outil statistique, est utilisé pour l’optimisation de plusieurs enzymes modificatrices de la chitine de type sauvage 6,7,8,9. Cependant, les étapes en aval de l’utilisation d’organismes de type sauvage deviennent fastidieuses, d’où le passage aux enzymes recombinantes 10,11,12,13,14,15,16,17. Au cours des dernières années, l’ADC halophile recombinant d’origine marine a gagné en importance en raison de sa facilité d’application industrielle et de production de chitosane18,19 de qualité biomédicale.

La production d’enzymes recombinantes chez E. coli a une limitation sur le processus, et l’optimisation du milieu est nécessaire car son expression dans E. coli varie en fonction du gène et du plasmide utilisés20. Il devient donc important de déterminer si l’on détermine un procédé et des paramètres nutritifs appropriés. One factor at a time (OFAT), la méthode d’optimisation couramment utilisée, nécessite énormément de ressources et de temps pour effectuer des expériences étape par étape. Cette méthode souffre d’un manque d’informations statistiques concernant l’interaction entre les paramètres 20,21,22,23. Par conséquent, la méthodologie CCD de surface de réponse (RSM) a été adoptée pour étudier le rendement d’expression de la chitine désacétylase bactérienne halophile (BaCDA) et l’activité de BaCDA chez E. coli Rosetta pLysS. Les paramètres pris en compte pour l’optimisation de l’expression chez l’hôte d’E. coli étaient la concentration de lactose, la concentration de glucose, la température d’incubation, le taux d’agitation et le temps d’incubation. Dans la plupart des études sur l’expression d’E. coli, le milieu Luria Bertani (LB) avec de l’isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a été utilisé comme inducteur. Cet ajout d’IPTG a nécessité un suivi régulier de la croissance24. Ces médiations récurrentes au cours du processus fermentatif ouvrent également des voies de contamination. Par conséquent, les groupes de recherche se sont tournés vers le bouillon formidable (TB) avec le lactose comme inducteur. L’inclusion du lactose dans les milieux au lieu de l’IPTG répond à cette préoccupation ; E. coli consomme ce lactose et produit de l’allolactose comme sous-produit, ce qui entraîne une condition d’auto-induction. Ce milieu auto-inducteur comprend du glycérol, qui a montré des rendements améliorés de protéinerecombinante 25.  Cette surexpression des protéines recombinantes dans les milieux de tuberculose a été encore améliorée par l’optimisation des paramètres du procédé. Dans la présente étude, un modèle composite central a été appliqué pour optimiser l’expression hétérologue de l’ADC halophile Badans les cellules d’E. coli Rosetta pLysS. Les paramètres du procédé choisis étaient la température d’incubation, la vitesse d’agitation et le temps d’incubation, et les paramètres nutritifs évalués étaient la concentration de glucose et de lactose. L’expression halophile de l’ADC Baa été évaluée à l’aide de la condition optimisée prédite et validée par recoupement à l’aide de SDS-PAGE.

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Protocole

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1. Médias d’expression et condition culturelle

  1. Transformer le vecteur pET-22b contenant le gène BaCDA en cellules compétentes de E. coli Rosetta pLysS à l’aide de la méthode du choc thermique, comme décrit aupoint 15.
    REMARQUE : Des précautions doivent être prises lors du travail avec des micro-organismes. Tous les travaux microbiologiques doivent être effectués à l’intérieur d’une hotte d’armoire de biosécurité pour éviter toute contamination.
  2. Réaliser l’étude d’expression préliminaire dans un milieu tuberculeux contenant 0,05 % (p/v) de glucose et 0,2 % (p/v) de lactose à 16 °C et 180 tr/min. Cultiver 6,792 x 107 cellules E. coli Rosetta pLysS dans 100 mL de milieu contenant du plasmide cloné BaCDA jusqu’à ce qu’il atteigne la phase stationnaire. Dans les conditions de croissance mentionnées, les cellules E . coli Rosetta pLysS atteignent une densité optique de 600 (OD600) de 10,85 ± 0,21.
    REMARQUE : Composition du milieu antituberculeux ( % p/v) : tryptone, 1,2 ; extrait de levure, 2,4 ; glycérol, 0,6 ; et 1x TB de sel (17 mM KH2PO4 et 74 mM K2HPO4)17.

2. Optimisation et conception expérimentale

  1. Concevez les expériences et ajustez le modèle polynomial du second ordre dans le plan composite central à l’aide de l’outil statistique logiciel. Le logiciel statistique utilisé dans la présente étude était MINITAB 17.0 (version d’essai).
    1. Pour ce faire, ouvrez le logiciel et cliquez sur les boutons suivants : Stat > DoE > Surface de réponse > Créer une surface de réponse > Conception de réponse > Composite central. La sortie s’affiche sous la forme d’une boîte de dialogue.
  2. Alimentez les cinq paramètres, la température d’incubation, le taux d’agitation, le temps d’incubation, la concentration en glucose et la concentration en lactose, à cinq niveaux (-2, -1, 0, +1, +2) dans la boîte de dialogue.
    1. Pour ce faire, entrez les paramètres avec les niveaux dans la boîte de dialogue, entrez les détails de tous les paramètres et appuyez sur OK. Cela génère la matrice de conception expérimentale avec six répétitions au point central, nécessitant 32 exécutions expérimentales. Le logiciel génère un tableau contenant les paramètres et leurs niveaux en termes codés et non codés, utilisés dans l’optimisation du processus à l’aide du CCD (Tableau 1).
  3. Effectuez les 32 expériences avec les conditions générées par le logiciel. Introduire les résultats expérimentaux dans la matrice de conception expérimentale (générée par le logiciel) contenant les niveaux et les paramètres en termes d’unités codées et non codées (tableau 2).
  4. Analyser la matrice du plan d’expérience (tableau 2) à l’aide du logiciel. Pour ce faire, ouvrez le logiciel et entrez la réponse dans la feuille de données. Sélectionnez la colonne Réponse > Stat > DoE > Surface de réponse > Analyser la conception de la surface de réponse > OK. La signification statistique de la sortie est analysée et un modèle est prédit par le logiciel.

Tableau 1 : Les paramètres et leurs niveaux en termes codés et non codés utilisés dans la conception expérimentale pour estimer l’expression de la chitine désacétylase recombinante dans les cellules E . coli Rosetta pLysS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Matrice de conception expérimentale avec activité (expression) expérimentale et prédite de lachitine désacétylase recombinante dans les cellules E . coli Rosetta pLysS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

3. Validation du modèle

  1. Validez le modèle conçu à l’aide de l’outil d’optimisation des réponses disponible dans le logiciel.
  2. Répétez la fermentation dans des conditions optimales prédites par logiciel et comparez la valeur expérimentale avec la valeur prédite par logiciel.
    1. Pour ce faire, ouvrez le logiciel et sélectionnez la colonne Réponse > Statistiques > DoE > Surface de réponse > Optimiseur de réponses > Maximiser > OK. Le résultat est des conditions de processus optimales et des valeurs prédites par le logiciel. Répétez la fermentation dans les conditions optimales prévues et comparez les valeurs.

4. Méthodes analytiques

  1. Expression, biomasse et quantification des protéines
    1. Effectuer la fermentation dans 32 conditions données par le logiciel dans la matrice de conception expérimentale (Tableau 2). Obtenir le granulé après chaque passage en centrifugeant la culture à 5 405 x g pendant 10 min à 4 °C. Pesez la pastille cellulaire pour déterminer le rendement en biomasse.
      REMARQUE : Toute manipulation microbienne doit être effectuée dans des conditions aseptiques (c.-à-d. à l’intérieur d’enceintes de sécurité biologique).
    2. Lyser la cule cellulaire pour obtenir la protéine périplasmique par sonication. Ajouter 5 mL de tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 10 mM d’imidazole) à chaque gramme de pastille cellulaire et perturber en soniquant pendant 10 cycles avec une impulsion de 10 s de marche et de 10 s de désactivation à 60 % d’amplitude. Prélever le lysat par centrifugation à 5 405 x g pendant 10 min à 4 °C. Quantifier la concentration en protéines à l’aide du test de Bradford26.
      REMARQUE : Pour éviter la dénaturation des protéines, la sonication doit être effectuée dans des conditions froides. Placez les échantillons sur de la glace pendant que vous effectuez la sonication.
    3. Analysez l’expression de l’ADC Baà l’aide de SDS-PAGE suivi du logiciel ImageJ. Chargez 10 μL de lysat cellulaire soluble (protéine périplasmique) sur un gel de bis-acrylamide à 12 % et passez sous 1 tampon tris-glycine-SDS (TGS) à un courant de 100 V pendant 2 h. Une fois la course terminée, colorez le gel avec du bleu Coomassie et décolorez-le pour enlever l’arrière-plan27.
    4. Capturez une image à l’aide d’une unité de documentation sur gel. Déterminez l’expression BaCDA en comparant l’intensité de la bande sous la forme des valeurs de pixel à l’aide du logiciel ImageJ. Considérons l’exploitation expérimentale avec l’activité CDA Baet la biomasse les plus faibles comme pixel de référence 28.
      1. Pour ce faire, ouvrez le logiciel et ouvrez le fichier image, puis sélectionnez chaque voie à l’aide de la case rectangulaire. Allez dans Analyser et définissez chaque voie sur 100 %, puis sélectionnez la bande surexprimée dans chaque voie à l’aide de la case rectangulaire. Allez dans Analyser et déterminer l’intensité de la bande, répétez le processus dans chaque voie et exportez le résultat sous forme .xls fichier. Considérez l’intensité de la bande de l’essai expérimental avec l’activité CDA Bala plus faible comme intensité de référence et analysez l’expression de chaque voie.
  2. Dosage de l’activité enzymatique
    1. Déterminer l’activité de l’ADC Baà l’aide d’une trousse de dosage de l’acétate15, à l’aide de chitine d’éthylène glycol (1 mg/mL ; EGC) comme substrat29.
    2. Laisser 20 μL de BaCDA réagir avec 40 μL du substrat en présence de 40 μL de tampon Tris-HCl (pH 7) de 50 mM pendant 1 h à 30 °C en agitant à 800 tr/min.
    3. Après 1 h, centrifuger le réactif de 100 μL à travers une colonne de 3 kDa à 2 111 x g pendant 15 min à 4 °C. Jeter le rétentat composé de BaCDA et recueillir le filtrat contenant l’acétate libéré pendant la réaction. Utilisez le filtrat pour le dosage de l’acétate afin de déterminer l’activité du BaCDA.
      REMARQUE : Une unité de l’enzyme est définie comme l’activité qui libère 1 μM d’acétate du substrat par microlitre d’enzyme par minute. Le dosage de l’activité enzymatique a été effectué en trois exemplaires, et l’activité enzymatique correspondante a été calculée en conséquence.
  3. Cinétique de fermentation de l’induction du lactose
    1. Examinez le profil d’activité pour déterminer le point d’induction et le point de départ de l’expression du lactose. Le profilage d’activité est réalisé en estimant l’activité de la biomasse et de l’activité de BaCDA dans des conditions de fermentation optimisées.
    2. Déterminez la concentration de glucose dans le milieu à l’aide d’un kit d’estimation de la glycémie. Tracez le profil d’activité en utilisant la biomasse, la concentration de glucose et l’activité de BaCDA en fonction du temps de fermentation.

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Résultats

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Optimisation du procédé d’expression de l’enzyme recombinante périplasmique chitine désacétylase chez E. coli à l’aide de la conception composite centrale (CCD)
La construction pET22b-Ba CDA, lorsqu’elle a été cultivée dans des conditions non optimisées, a donné un rendement maximal en biomasse et une activité BaCDA de 22,26 ± 0,98 g/L et de 84,67 ± 0,56 U/L, respectivement15. Dans la présente étude, une approche statistique CCD a été adoptée pour tro...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La chitine désacétylée, le chitosane, a de nombreuses applications, en particulier dans le domaine biomédical30. Cependant, la reproductibilité du chitosane en ce qui concerne son degré d’acétylation (DA) et son modèle d’acétylation (PA) est une préoccupation majeure en plus d’autres appréhensions environnementales. La voie plus verte, utilisant des enzymes, a ainsi été exploitée. La gamme d’ADC peut être utilisée pour créer du chitosane avec un modèle unique de désacétylation, ce qui augmenterait...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier l’Académie Manipal pour l’enseignement supérieur (MAHE) pour le fonds MAHE UNSW, et les auteurs souhaitent remercier le Conseil de la recherche scientifique et industrielle - Groupe de développement des ressources humaines (CSIR-MHRD), gouvernement de l’Inde pour une bourse de recherche senior, lettre d’attribution numéro 09/1165(0007)2K19 EMR-I datée du 31.3.2019.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kits
Acetateassay kit Megazyme, IrelandK-ACETAKLe protocole a été légèrement modifié et optimisé pour effectuer le test dans une plaque à 96 puits
Kit d’estimation du glucoseAgappe diagnosis Ltd., Inde12018013Le protocole a été légèrement modifié et optimisé pour effectuer le test dans une plaque
à 96 puitsChemicals
Aceticacid Hi-media, IndeAS001Utilisé pour la préparation de la solution de coloration et de décoloration SDS-PAGE
AcrylamideHi-media, IndeMB068Utilisé pour la préparation du gel SDS-PAGE
Poursulfate d’ammoniumHi-media, IndeMB003Utilisé pour la préparation du gel SDS-PAGE
Bis-acrylamideHi-media, IndeMB005Utilisé pour la préparation du gel SDS-PAGE
Coomassie briliiant blue G-250Hi-media, IndeMB092Utilisé pour la préparation de la solution de coloration et de déstaing SDS-PAGE
Coomassie briliiant blue R-250Hi-media, IndeMB153Utilisé pour la préparation du test de Bardford
Ethylene glycol chitosanSigma-aldrich, USAE1502Utilisé pour préparer la chitine d’éthylène glycol et la chitine d’éthylène glycol a été utilisée comme substrat pour la réaction enzymatique
D-glucoseHi-media, IndeMB037Utilisé comme composant de milieu.
ImidazoleHi-media, IndeGRM1864Utilisé dans le tampon de lyse
LactoseHi-media, IndeGRM017Utilisé comme composant de milieu.
MéthanolFinar, Inde30930LC250Utilisé pour la préparation de la solution de coloration et de détartrage SDS-PAGE
Chlorure de sodium (NaCl)Hi-media, IndeMB023Utilisé dans le tampon de lyse
Acide phosphoriqueHi-media, IndeMB157Utilisé pour la préparation du dosage de Bardford
Dodécylsulfate de sodium (SDS)Hi-media, IndeGRM6218Utilisé pour la préparation du gel SDS-PAGE
Phosphate de sodium dibasique anhydreHi-media, IndeMB024Utilisé pour préparer le sald de tuberculose pour le milieu et le tampon pour la réaction enzymatique.
Phosphate de sodium monobasique anhydreHi-media, IndeGRM3964Utilisé pour préparer le sald de tuberculose pour le milieu et le tampon pour la réaction enzymatique.
Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)Hi-media, IndeMB026Utilisé pour la préparation du gel SDS-PAGE
BaseTris Hi-media, IndeMB029Utilisé pour la préparation du gel SDS-PAGE
TryptoneHi-media, IndeRM7707Utilisé comme composant du média.
Extraitde levure Hi-media, IndeRM027Utilisé comme composant de média.
Equipment
AlphaImager Unité de documentation sur gelHP ProteinSimple, USA92-13823-00Utilisé pour capturer des photos SDS-PAGE
Mélangeur de paillasseEppendorf, Allemagne  ;9.776 660Utilisé pour conserver pour la réaction enzymatique avec un adaptateur de 2 mL
Bioincubateur agitateurTrishul instruments, Inde13410622Utilisé pour incuber la culture bactérienne à différentes températures et RPM
BiospectrophotomètreEppendorf, Allemagne  ;6135000009Utilisé pour prendre toutes les lectures spectroscopiques
Centrifugeuse de refroidissementEppendorf, Allemagne  ;5805000017Utilisé pour la centrifugation de la culture, du lysat et de tous les autres protocoles de centrifugation
Bain secLabnet International, États-UnisS81522039Utilisé pour dénaturer un échantillon de protéines pour
micropipettesEppendorf, Allemagne.3123000900Utilisé dans le protocole pour les mesures de volume
Rocker shakerTrishul instruments, Inde11770719Utilisé pour agiter le gel SDS-PAGE pour la coloration et la décoloration de l’unité
SDS-PAGEBio-Rad, USA1658001FCUtilisé pour couler et exécuter le gel SDS-PAGE
Ultra sonicatorSonics & Materials, Inc., USAVCX 130Utilisé pour lyser la cellule bactérienne par ultrasonication
Balance de pesageSartorius, AllemagneBSA124 SUtilisé pour mesurer le poids tout au long du
protocoleDevices
Nanosep Dispositifs centrifuges avec membrane Omega (3 kDa)PALL life sciences, USAOD003C33Utilisé pour séparer l’enzyme après le substrat treatment
SoftwaresVersiondéveloppée chez
MINITAB17.0  ; (Version d’essai)  ; L’Université d’État de PennsylvanieUtilisé pour concevoir le modèle expérimental et analyser les données
ImageJ1.53oNational Institutes of Health (NIH)Utilisé pour analyser le niveau d’expression à l’aide de l’image
Plasmid
pET22b (+) DNA&mdash ; NovagenMerck- Millipore, États-Unis69744Stocké à &minus ; 20 ° ; C
Cells
E. coli Rosetta pLysS&mdash ; NovagenMerck- Millipore, États-Unis70956Maintenu à Luria&ndash ; Bouillon Bertani (LB) contenant 25 % de glycérol à &minus ; 80 ° ; L
les SDS-PAGE

Références

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