Application de la vermimétrie de flux pour la quantification et l’analyse du microbiome intestinal de Caenorhabditis elegans

Summary

Caenorhabditis elegans est un modèle puissant pour examiner les déterminants moléculaires à l’origine des interactions hôte-microbiome. Nous présentons un pipeline à haut débit profilant les niveaux de colonisation du microbiome intestinal chez un seul animal ainsi que des aspects clés de la physiologie de C. elegans.

Abstract

La composition du microbiome intestinal peut avoir un impact considérable sur la physiologie de l’hôte tout au long du développement et de la vie de l’animal. La mesure des changements de composition dans le microbiome est cruciale pour identifier les relations fonctionnelles entre ces changements physiologiques. Caenorhabditis elegans est apparu comme un puissant système hôte pour examiner les moteurs moléculaires des interactions hôte-microbiome. Grâce à son plan corporel transparent et à ses microbes naturels marqués par fluorescence, les niveaux relatifs de microbes dans le microbiome intestinal d’un animal C. elegans individuel peuvent être facilement quantifiés à l’aide d’un grand trieur de particules. Nous décrivons ici les procédures de mise en place expérimentale d’un microbiome, la collecte et l’analyse des populations de C. elegans au stade de vie souhaité, le fonctionnement et la maintenance du trieur, ainsi que les analyses statistiques des ensembles de données résultants. Nous discutons également des considérations relatives à l’optimisation des paramètres du trieur en fonction des microbes d’intérêt, du développement de stratégies de contrôle efficaces pour les stades de vie de C. elegans et de la façon d’utiliser les capacités du trieur pour enrichir les populations animales en fonction de la composition du microbiome intestinal. Des exemples d’applications potentielles seront présentés dans le cadre du protocole, y compris le potentiel d’évolutivité vers des applications à haut débit.

Introduction

L’évolution animale est sous l’influence microbienne constante¹. À partir de divers microbes présents dans l’environnement, les hôtes animaux acquièrent des partenaires spécifiques² qui étendent les capacités de l’hôte et déterminent sa physiologie et sa susceptibilité aux maladies³. Par exemple, les analyses métagénomiques du microbiome intestinal ont révélé des classes métaboliques enrichies de gènes microbiens qui peuvent conférer une plus grande récolte et stockage d’énergie chez les souris obèses⁴, dont beaucoup se trouvent également dans le micro....

Protocol

1. Préparation du mélange de microbiome

1. Tamponnez ou éliminez les bactéries d’un stock de glycérol de congélation sur une plaque de bouillon de lysogénie (LB) ou un milieu de croissance approprié, et cultivez pendant la nuit à une température optimale en fonction des souches bactériennes d’intérêt (généralement 25 °C pour les microbes naturels de C. elegans ).
2. À partir de la plaque LB, utiliser une seule colonie de chaque isolat bactérien (p. ex., 12 bactéries de la collection CeMbio) pour inoculer 800 μL de milieu LB dans des puits séparés d’une plaque à puits profond de 1 mL. Incuber toute la nuit à la température optima....

Results

Définition des portes des populations d’adultes et de larves
Ici, des C. elegans L1 synchronisés ont été cultivés sur une plaque NGM ensemencée avec E. coli OP50 (Eco), un régime alimentaire standard de laboratoire. Les populations de C. elegans ont été prélevées pour l’analyse LPS après 96 h ou 120 h de croissance à 20 °C (figure 2A). Un diagramme à points de l’extinction (EXT, un indicateur de la densité corporelle) en fonction du temps de vol.......

Discussion

La vermimétrie en flux a été utilisée pour caractériser les gènes et les voies de C. elegans contre la colonisation et la toxicité des agents pathogènes dans plusieurs études^21,22. Ici, une approche à haut débit est présentée qui utilise C. elegans pour étudier comment les microbiomes intestinaux modulent la physiologie de leur hôte. Par rapport aux méthodes existantes utilisant des unités formant colonie (UFC) ou le séquençage d’amplicon d’ARNr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes à centrifuger à fond conique de 15 mL	VWR	10026-076
96 plaques à puits profonds (1 mL)	Axygen	P-DW-11-C
96 plaques à puits profonds (2 mL)	Axygen	P-DW-20-C
Plaque Costar à 96 puits	Corning	3694
Agar	Millipore Sigma		La gélose bactériologique standard est également suffisante.
Collecteur d’aspiration	V& P scientific	VP1171A
Bleach	Clorox
Solution d’eau de Javel  ;			Mélange d’eau de Javel avec 5M Hypochlorite de sodium 2:1 (v/v)
Imagerie cellulaire Lecteur multimode	Biotek	Cytation 5	Mesure de la DO bactérienne
	Centrifugeuse Thermo scientific  ;	Sorvall Legend XTR	Pour 96 puits Plaque et tubes coniques
Microscope fluorescent	Nikon	TiE
ggplot : Divers outils de programmation R pour le traçage des données.	Package	R Version 3.3.2
Échantillonneur automatique de grosses particules	Union Biometrica	LP Sampler
Trieur de grandes particules	Union Biometrica	COPAS Biosorter
Levamisole	Fisher	AC187870100
Lysogeny Broth (LB)	RPI	L24066	Standard LB Des recettes maison à base de Bacto-tryptone, d’extrait de levure et de NaCl sont également suffisant.
La solution M9			22 mM KH2PO4 monobasique, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nématode Croissance Medium RPI		N81800-1000.0	1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4 ajouté après autoclavage.
RStudio	GNU	Version 1.3.1093
Hypochlorite de sodium	Stéréomicroscope Sigma-Aldrich		5M NaOH
Nikon		SMZ745
Boîtes de Pétri stériles de 10 cm de diamètre	Corning	351029
Plaques stériles à 12 puits	VWR	10062-894
Plaques stériles à 24 puits	VWR	10062-896
Boîtes de Pétri stériles de 6 cm de diamètre	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787