Article de méthode

Génération et imagerie d’organoïdes épithéliaux de souris et humains à partir de tissus mammaires normaux et tumoraux sans passage

DOI :

10.3791/64626

⸱

11 novembre 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Harold C. Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas Southwestern Medical Center, 3Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 4Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 5Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 6Division of Medical Oncology, Norris Comprehensive Cancer Center, Keck School of Medicine, University of Southern California

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole traite d’une approche pour générer des organoïdes épithéliaux à partir de tissu mammaire primaire normal et tumoral par centrifugation différentielle. En outre, des instructions sont incluses pour la culture tridimensionnelle ainsi que l’imagerie immunofluorescente des organoïdes intégrés.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les organoïdes sont une méthode fiable pour modéliser les tissus organiques en raison de leurs propriétés auto-organisatrices et de la conservation de la fonction et de l’architecture après la propagation à partir de tissus primaires ou de cellules souches. Cette méthode de génération d’organoïdes renonce à la différenciation unicellulaire par plusieurs passages et utilise plutôt la centrifugation différentielle pour isoler les organoïdes épithéliaux mammaires des tissus dissociés mécaniquement et enzymatiquement. Ce protocole fournit une technique simplifiée pour produire rapidement de petits et grands organoïdes épithéliaux à partir de tissus mammaires de souris et humains, en plus de techniques d’incorporation organoïde dans le collagène et la matrice extracellulaire basale. De plus, des instructions pour la fixation dans le gel et la coloration immunofluorescente sont fournies dans le but de visualiser la morphologie et la densité organoïdes. Ces méthodologies conviennent à une myriade d’analyses en aval, telles que la co-culture avec des cellules immunitaires et la modélisation ex vivo des métastases via un test d’invasion de collagène. Ces analyses servent à mieux élucider le comportement cellule-cellule et à créer une compréhension plus complète des interactions au sein du microenvironnement tumoral.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacité de modéliser les cellules épithéliales in vitro a été le fondement de la recherche biomédicale moderne, car elle capture des caractéristiques cellulaires qui ne sont pas accessibles in vivo. Par exemple, la croissance de lignées cellulaires épithéliales dans un plan bidimensionnel peut fournir une évaluation des changements moléculaires qui se produisent dans une cellule épithéliale pendant la prolifération1. De plus, la mesure de la régulation dynamique entre la signalisation et l’expression génique est limitée dans les systèmes in vivo 2. Dans la recherche sur le cancer, la modélisation des lignées cellulaires épithéliales cancéreuses a permis d’identifier les facteurs moléculaires de progression de la maladie et les cibles médicamenteuses potentielles3. Cependant, la croissance de lignées cellulaires épithéliales cancéreuses sur un plan bidimensionnel a des limites, car la plupart sont génétiquement immortalisées et modifiées, souvent de nature clonale, sélectionnées pour leur capacité à se développer dans des conditions non physiologiques, limitées dans leur évaluation de l’architecture tridimensionnelle (3D) des tissus tumoraux, et ne modélisent pas adéquatement les interactions du microenvironnement dans un environnement tissulaire réaliste4. Ces contraintes sont particulièrement évidentes dans la modélisation des métastases, qui comprend in vivo plusieurs étapes biologiques distinctes, y compris l’invasion, la dissémination, la circulation et la colonisation sur le site d’organes éloigné5.

Des organoïdes épithéliaux cancéreux ont été développés pour mieux récapituler l’environnement 3D et le comportement des tumeurs 6,7,8. Les organoïdes ont d’abord été développés à partir de cellules cryptiques intestinales LRG5+ uniques et différenciés pour représenter la structure 3D des unités cryptes-villosités qui maintenaient la structure hiérarchique de l’intestin grêle in vitro9. Cette approche a permis de visualiser et de caractériser en temps réel l’architecture tissulaire auto-organisatrice dans des conditions homéostatiques et de stress. En tant qu’extension naturelle, les organoïdes épithéliaux du cancer ont été développés pour modéliser de nombreux types de cancer différents, y compris colorectal 10, pancréatique11, sein 12, foie13, poumon 14, cerveau 15 et gastrique 16. Les organoïdes épithéliaux du cancer ont été exploités pour caractériser l’évolution du cancer17,18 et les comportements spatio-temporels métastatiques19,20 et interroger l’hétérogénéité tumorale21, et tester les chimiothérapies 22. Des organoïdes épithéliaux cancéreux ont également été isolés et collectés au cours d’essais cliniques en cours pour prédire la réponse des patients aux agents anticancéreux et à la radiothérapie ex vivo 8,23,24,25. En outre, les systèmes incorporant des organoïdes épithéliaux cancéreux peuvent être combinés avec d’autres cellules non cancéreuses, telles que les cellules immunitaires, pour former un modèle plus complet du microenvironnement tumoral afin de visualiser les interactions en temps réel, de découvrir comment les cellules épithéliales cancéreuses modifient la nature fondamentale des cellules immunitaires effectrices cytotoxiques telles que les cellules tueuses naturelles, et de tester les immunothérapies potentielles et l’activité cytotoxique dépendante des anticorps26, 27,28. Cet article démontre une méthode de génération d’organoïdes épithéliaux sans passer et incorporer dans le collagène et la matrice extracellulaire basale (ECM). En outre, des techniques d’imagerie en aval d’organoïdes isolés sont également partagées.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les tissus de souris utilisés dans ce manuscrit ont été prélevés de manière éthique conformément aux règlements et directives du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas. De même, tous les patients ont consenti avant le don de tissus sous la supervision d’un comité d’examen institutionnel (CISR), et les échantillons ont été dépersonnalisés.

REMARQUE: Ce protocole décrit la génération d’organoïdes à partir de tissus primaires.

1. Préparation de nuit des matériaux

  1. Pour l’incorporation dans la matrice extracellulaire basale (BECM), décongeler l’aliquote BECM en la laissant à 4 °C.

2. Préparation de la collagénase et de la solution d’enrobage de sérum albumine bovine (BSA)

  1. Préparer une solution d’enrobage BSA/PBS à 2,64 % (solution BSA) : Filtre stérile 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 4,10 mL de solution BSA à 30 % à l’aide d’une fiole filtrante à 50 mL/0,2 μm. Cette solution BSA peut être filtrée et réutilisée.
  2. Préparer la solution de collagénase pour le tissu mammaire de souris : Filtre stérile 27 mL de milieu cellulaire basal, 1,5 mL de sérum bovin fœtal (FBS), 30 μL de gentamicine à 50 mg/mL, 15 μL d’insuline à 10 mg/mL, 600 μL de collagénase A à 0,1 g/mL et 600 μL de trypsine à 0,1 g/mL à l’aide d’une fiole filtrante de 50 mL/0,2 μm. Allouer entre 10 mL et 30 mL de solution de collagénase par souris, selon la masse tissulaire.
  3. Préparer la solution de collagénase pour le tissu mammaire humain : Filtre stérile 18 mL de RPMI-1640, 200 μL de solution 100x de pénicilline-streptomycine (stylo/streptocoque), 200 μL de tampon de 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanéthanésulfonique (HEPES), 1 mL de FBS et 400 μL de collagénase A à 0,1 g/mL à l’aide d’une fiole filtrante de 50 mL/0,2 μm. Allouer entre 10 mL et 20 mL par échantillon de tissu, selon la masse tissulaire.

3. Préparation des médias

  1. Préparer les milieux organoïdes : milieu filtrant stérile à cellules basales avec 1 % stylo/streptocoque et 1 % insuline-transférrine-sélénium (STI) à l’aide d’une fiole filtrante de 50 mL/0,2 μm. Pour fabriquer des milieux de facteur de croissance organoïdes, ajouter le facteur de croissance des fibroblastes basiques (FGFb) à une concentration finale de 2,5 nM.
  2. Préparer les milieux épithéliaux mammaires : Pour fabriquer 100 mL de milieu épithélial mammaire, filtre stérile à haute teneur en glucose milieu basal commun avec 1 mL de supplément de glutamine 100x, 1 mL de stylo/streptocoque, 1 mL de tampon HEPES 10 mM (pH 7,3), 250 μL de stock de BSA à 30 %, 1 μL de 1 mg/mL de toxine cholérique, 1 mL de stock d’hydrocortisone à 50 μg/mL dans du PBS, 50 μL de solution d’insuline humaine à 10 mg/mL, 10 μL de facteur de croissance épidermique (EGF) à 50 μg/mL et 1 % de FBS à l’aide d’une fiole filtrante de 150 mL/0,2 μm. Conserver le support à 4 °C et l’utiliser jusqu’à 2 semaines.
  3. Préparer le lavage de l’amphotéricine : Filtre stérile PBS avec 2 % stylo/streptocoque et 2 % amphotéricine B. Conserver à 4 °C.

4. Collecte et digestion des tissus

  1. Tissu mammaire de souris
    1. Euthanasier la souris en la plaçant dans une chambre de CO 2 pendant2-5 min, puis suivre avec la luxation cervicale. Avec la face ventrale tournée vers le haut, écartez les membres de la souris et utilisez quatre aiguilles de 19 G pour épingler la souris par les pattes à une planche recouverte d’un tampon absorbant. Vaporiser avec de l’éthanol à 70% pour lisser la fourrure et désinfecter la peau. Essuyez les matières fécales avec un tampon de gaze ou un mouchoir.
    2. En commençant juste au-dessus de la région anogénitale, coupez vers le haut à partir de la ligne médiane à l’aide de ciseaux chirurgicaux, en prenant soin de ne pas percer le péritoine. En atteignant le menton, faites des coupes latérales le long des clavicules et des pattes postérieures, et épinglez la peau de la souris tendue à la planche pour exposer les coussinets graisseux mammaires.
    3. Localisez les coussinets graisseux mammaires inguinaux sur des souris de type sauvage en identifiant le ganglion lymphatique inguinal situé près des membres postérieurs. Localisez les coussinets graisseux mammaires thoraciques sur les souris de type sauvage comme le tissu vascularisé plus épais sous les membres antérieurs.
    4. Utilisez une pince pour élever le coussinet adipeux mammaire. Évitez de collecter le muscle sous-jacent. À l’aide de l’extrémité émoussée des ciseaux tranchants, créez une poche sous le coussinet adipeux mammaire, loin de la peau. Coupez le coussinet graisseux mammaire en un seul morceau complet.
    5. Une fois que les coussinets graisseux mammaires ont été retirés, rincer dans PBS avant de les placer dans un plat de culture tissulaire stérile. Transférer rapidement dans une hotte de culture tissulaire.
      REMARQUE: Pour les tumeurs mammaires, utilisez un coton-tige mouillé avec PBS pour rouler doucement la tumeur loin de la peau. Assurez-vous d’éviter les zones sombres ou molles, car une décoloration foncée indique une nécrose, ce qui ne donnera pas d’organoïdes sains.
    6. Hacher les tumeurs mammaires avec un scalpel #10 ou #11 pour détacher les tissus jusqu’à ce qu’ils atteignent une consistance pâteuse. Transférer le tissu haché dans un tube conique contenant 10 à 30 mL de solution de collagénase à l’aide d’un scalpel. Pour vous assurer que tous les tissus sont recueillis, pipeter 1 mL de solution de collagénase sur la plaque de culture tissulaire et revenir dans le tube conique.
      REMARQUE: Pour produire des organoïdes plus gros, la digestion mécanique doit être minimisée, laissant quelques petits morceaux visibles de tissu intacts. Alternativement, les tissus peuvent être conservés congelés pour une préparation organoïde ultérieure avec une perte minimale de viabilité. Pour ce faire, lavez le tissu dans une solution de PBS ou de milieu de cellules basales + 1% FBS, puis hachez grossièrement pour augmenter la surface (en gardant le tissu en un ou deux morceaux solides). Déplacer le tissu dans un flacon cryogénique, recouvert d’un milieu de congélation (90% FBS + 10% diméthylsulfoxyde (DMSO)). Congeler les flacons dans un contenant de congélation à débit contrôlé pendant la nuit avant de les entreposer dans de l’azote liquide.
    7. Placer le tube conique dans un incubateur de banc de paillasse à 37 °C à 180 tr/min jusqu’à ce que le tissu devienne filandreux et que la solution de collagénase devienne trouble. Par exemple, une grande masse tissulaire (environ 500-800 mg) d’une tumeur prend 30-60 min. Une masse tissulaire plus petite (environ 100-300 mg) à partir de coussinets graisseux mammaires de type sauvage prend environ 20-30 min. En cas d’incertitude, vérifiez à intervalles de 5 minutes.
    8. Après incubation, centrifuger le tube conique pendant 10 min à 550 x g à température ambiante (RT).
    9. Aspirez soigneusement le surnageant du tube conique.
      REMARQUE: Pour aller de l’avant, pré-enduisez toutes les extrémités des pipettes, des pipettes sérologiques et des tubes coniques avec une solution BSA pour éviter la perte d’organoïdes due à l’adhérence au plastique.
    10. Ajouter 8 mL de milieu cellulaire basal et 80 μL de solution de DNase [2 U/μL] dans le tube. Retourner doucement pendant 1-3 min.
    11. Ajouter 12 mL de milieu cellulaire basal dans le tube et mélanger soigneusement par pipetage ou tourner doucement le tube 15 fois pour mélanger.
    12. Centrifuger pendant 10 min à 550 x g à TA.
    13. Aspirer le surnageant, puis remettre en suspension la pastille dans 12 mL de milieu cellulaire basal.
    14. Laissez les fragments de tissu les plus lourds se déposer au fond. Recueillir le surnageant avec une pipette sérologique et le transférer dans un tube conique de 15 mL. Cette suspension contient des organoïdes épithéliaux et des cellules stromales/immunitaires.
  2. Tissu mammaire humain
    1. Traiter les échantillons de tissus mammaires humains pour les organoïdes ou les stocker dans les 24 heures suivant le prélèvement. Conserver les échantillons à 4 °C dans un milieu indépendant du CO2 avec 1% 100x antibiotique-antimycotique.
    2. Transférer le tissu dans une plaque de culture tissulaire. Inclinez la plaque et aspirez l’excès de milieu de stockage, puis rincez le mouchoir avec 5 mL de lavage à l’amphotéricine B. Retirez immédiatement le lavage à l’amphotéricine B.
    3. Hachez l’échantillon de tissu avec un scalpel #10 ou #11 pour détacher le tissu jusqu’à ce qu’il atteigne une consistance pâteuse. Transférer le tissu haché dans un tube conique contenant 10 à 30 mL de solution de collagénase à l’aide d’un scalpel. Pour vous assurer que tous les tissus sont recueillis, pipeter 1 mL de solution de collagénase sur la plaque de culture tissulaire et retourner dans le tube conique.
      REMARQUE: Pour produire des organoïdes plus gros, la digestion mécanique doit être minimisée, laissant quelques petits morceaux visibles de tissu intacts. La masse tissulaire initiale pour ce protocole variait entre 100 et 250 mg. Alternativement, les tissus peuvent être conservés congelés pour une préparation organoïde ultérieure avec une perte minimale de viabilité après l’étape 4.2.2 dans 90% FBS + 10% DMSO comme ci-dessus.
    4. Placez le tube conique dans un incubateur de banc de paillasse à 37 °C à 180 tr/min jusqu’à ce que le tissu devienne plus petit et que la collagénase devienne trouble. Vérifiez le tissu à intervalles de 5 minutes. La dissociation de la collagénase des échantillons humains prend environ 5-20 min.
    5. Après l’incubation, faire tourner le tube conique pendant 10 min à 550 x g à TA.
    6. Aspirez soigneusement le surnageant du tube conique.
      REMARQUE: Pour aller de l’avant, pré-enduire toutes les pointes de pipettes, les pipettes sérologiques et les tubes coniques avec une solution BSA pour éviter la perte d’organoïdes due à l’adhérence au plastique.
    7. Ajouter 4 mL de milieu cellulaire basal et 40 μL de solution de DNase [2 U/μL] dans le tube conique. Retourner doucement pendant 3 min.
    8. Ajouter 6 mL de milieu cellulaire basal dans le tube et mélanger soigneusement par pipetage ou tourner doucement le tube conique 15 fois pour mélanger.
    9. Centrifuger pendant 10 min à 550 x g à TA.
    10. Aspirer le surnageant, puis remettre en suspension la pastille dans 10 mL de milieu cellulaire basal.
    11. Laissez les fragments de tissu les plus lourds se déposer au fond. Prélever le surnageant et le transférer dans un tube conique de 15 mL. Cette suspension contient des organoïdes épithéliaux et des cellules stromales/immunitaires.

5. Centrifugation différentielle

  1. Pulser à 550 x g pendant 3-4 s à TA, aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 10 mL de milieu cellulaire basal. Répétez cette étape trois fois de plus (un total de quatre tours).
  2. Après chaque centrifugation, assurez-vous que la pastille devient de plus en plus opaque. Cette pastille restante sera constituée d’organoïdes épithéliaux.

6. Collecte de petits organoïdes

  1. Pulser à 80-100 x g pendant 3 s à TA. Recueillir le surnageant dans un tube frais revêtu de BSA, puis pulser à 550 x g pendant 3 s à TA pour enrober les petits organoïdes.

7. Intégration d’organoïdes dans BECM

  1. Suspension appropriée aliquote des organoïdes dans des tubes microcentrifugés en fonction de la densité organoïde par rapport à la quantité de BECM par puits (tableau 1). Par exemple, utilisez 50 à 100 organoïdes pour 20 μL de BECM dans un puits d’une plaque de 96 puits.
    NOTE: La densité organoïde peut être comptée à l’aide de la formule suivante: ((Nombre moyen d’organoïdes)/50 μL) x facteur de dilution.
  2. Effectuez toutes les étapes sur la glace. Placez le BECM décongelé sur de la glace dans une hotte de culture tissulaire. Pendant la préparation de la hotte, placez toutes les pointes de pipette sur de la glace pour refroidir.
  3. Centrifuger les tubes de microcentrifugation pendant 10 min à 300 x g à TA. Jeter le surnageant des tubes. Déplacer les tubes contenant des pastilles organoïdes dans de la glace et ajouter le volume approprié de BECM à chaque tube de microcentrifugation (tableau 1).
    REMARQUE: Puisque BECM est visqueux, ajoutez des volumes supplémentaires (environ 10% -20% supplémentaires du volume du dôme) de BECM pour tenir compte de la perte dans la pointe de la pipette.
  4. Pipeter doucement de haut en bas pour remettre en suspension les organoïdes dans BECM, en prenant soin de ne pas produire de bulles.
  5. Pipeter lentement et soigneusement les organoïdes suspendus BECM sur la surface de placage. Pendant le pipetage, soulevez lentement la pipette pour créer un dôme. Remplissez tous les puits vides avec du PBS pour maintenir l’humidité.
  6. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 1 h pour permettre à BECM de se solidifier, puis couvrir avec le volume approprié de média (tableau 1).

8. Intégration d’organoïdes dans le collagène

  1. Effectuez toutes les étapes sur la glace. Préparer la solution de collagène en combinant, dans l’ordre séquentiel, 375 μL de DMEM 10x, 100 μL d’hydroxyde de sodium 1 N (NaOH) et 3 mL de solution de collagène I de queue de rat dans un tube conique de 15 mL. Mélanger à pipette en prenant soin de ne pas faire de bulles. Titrer la solution à un pH de 7,2-7,4 avec de petites quantités (incréments de 1-3 μL) de NaOH ou 10x DMEM au besoin.
  2. Enduisez le fond des puits avec la quantité minimale de collagène nécessaire pour couvrir complètement le fond du puits. Une approche consiste à placer une petite quantité de collagène et à balancer la plaque d’un côté à l’autre pour l’enduire. Laisser les sous-couches de collagène se fixer à 37 °C pendant 30 min-2 h.
  3. Aliquote la suspension appropriée des organoïdes dans des tubes de microcentrifugation en fonction de la densité organoïde par rapport à la quantité de collagène par puits (tableau 1). Placer dans un incubateur à 37 °C.
  4. Conservez la solution de collagène à 4 °C et surveillez la polymérisation en vérifiant la formation de fibres au microscope toutes les 10 minutes. Le collagène atteindra une polymérisation appropriée entre 30 min-2 h.
    REMARQUE: La polymérisation correcte peut être déterminée par la présence de fibres ramifiées dans toute la matrice. Passez à l’étape 8.5 immédiatement une fois que quelques fibres sont observées dans le champ de vision.
  5. Centrifuger les tubes de microcentrifugation à 300 x g pendant 10 min à TA. Jeter le surnageant des tubes. Déplacer les pastilles organoïdes vers de la glace et ajouter le volume approprié de collagène à chaque tube de microcentrifugation (tableau 1).
    REMARQUE: Puisque le collagène est visqueux, ajoutez des volumes supplémentaires (environ 10% -20% supplémentaires du volume du dôme) de collagène pour tenir compte de la perte dans l’embout de la pipette.
  6. Pipeter doucement de haut en bas pour remettre en suspension les organoïdes dans le collagène, en prenant soin de ne pas produire de bulles.
  7. Pipeter lentement et soigneusement les organoïdes en suspension de collagène sur la surface de placage. Pendant le pipetage, soulevez lentement la pipette pour créer un dôme. Remplissez tous les puits vides avec du PBS pour maintenir l’humidité.
  8. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 1 h pour permettre au collagène de se solidifier, puis recouvrir du volume de média approprié (tableau 1).
  9. NOTE : Les organoïdes maintiennent leur viabilité dans la matrice 3D jusqu’à 7 jours. Si l’imagerie est utilisée pour l’analyse, passez aux étapes 9 et 10.

9. Fixation des organoïdes embarqués

  1. Utilisez une pipette pour retirer tous les fluides des puits sans entrer en contact avec les dômes ECM.
  2. Fixer avec une solution de paraformaldéhyde (PFA)/PBS à 4 % pendant 5 min.
  3. Lavez deux à trois fois en appliquant du PBS sur les puits après les avoir placés sur un agitateur à déplacement lent. Après le lavage, appliquer du PBS frais sur les dômes et conserver la plaque à 4 °C.

10. Coloration immunofluorescente des organoïdes incorporés

  1. Préparation de solutions pour la coloration immunofluorescente
    1. Tampon de perméabilisation: Préparez une solution PBS avec 10% de Triton X-100.
    2. Tampon de blocage : Préparez une solution PBS avec 10 % FBS et 0,2 % de Triton X-100.
    3. Tampon de dilution des anticorps : Préparer une solution de PBS avec 2 % de FBS et 0,2 % de Triton X-100.
  2. Perméabilisation et blocage
    1. Pipette suffisamment de tampon de perméabilisation pour couvrir les dômes ECM. Incuber pendant 1 h à TA sur un agitateur à déplacement lent.
    2. Retirer le tampon de perméabilisation à l’aide d’une pipette et appliquer le même volume de tampon de blocage pendant 3 h.
  3. Incubation d’anticorps primaires
    1. Retirer le tampon de blocage à l’aide d’une pipette et appliquer le tampon de dilution des anticorps contenant l’anticorps primaire aux concentrations spécifiées par le fabricant. Incuber l’échantillon à 4 °C pendant 12-16 h sur un agitateur à déplacement lent.
    2. Retirer la solution d’anticorps primaires et laver les échantillons trois fois pendant 10 minutes avec PBS at RT sur un agitateur à déplacement lent.
  4. Incubation d’anticorps secondaires et coloration nucléaire
    1. Aspirer le PBS restant laver et appliquer le tampon de dilution d’anticorps contenant l’anticorps secondaire aux concentrations spécifiées par le fabricant. De plus, ajoutez DAPI ou Hoechst (pour marquer les noyaux) ou la phalloïdine (pour marquer l’actine) au tampon à un rapport de 1:250. Incuber pendant 2-4 h à TA sur un agitateur à déplacement lent.
    2. Retirer la solution d’anticorps secondaires et laver les échantillons trois fois pendant 10 minutes dans du PBS à TA sur un agitateur. Conservez les échantillons dans du PBS à 4 °C jusqu’à l’imagerie.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les images présentées à la figure 1 fournissent un exemple d’organoïdes épithéliaux mammaires de type sauvage et tumoral provenant de tissus humains et murins. Une illustration en un coup d’œil de la méthode d’isolement des organoïdes épithéliaux par centrifugation différentielle est fournie dans le flux de travail de la bande dessinée de la figure 1A, montrant que les tissus primaires de différentes espèces peuvent être traités de manière presque identique tout...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Différentes méthodes ont été décrites dans la littérature pour générer des organoïdes tumoraux. Ce protocole met en évidence une méthode permettant de générer des organoïdes tumoraux directement à partir de la tumeur sans passer. En utilisant cette méthode, les organoïdes tumoraux sont productibles dans les heures suivant le début de la procédure et génèrent près de 100% d’organoïdes viables contre 70% rapportés dans la littérature31. En comparaison, d’autres méthodes nécessitent le passage en sér...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été financée par METAvivor, le Peter Carlson Trust, la Theresa’s Research Foundation et le NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Nous remercions l’aide de la Southwestern Tissue Management Shared Resource de l’Université du Texas, une ressource partagée du Simmons Comprehensive Cancer Center, qui est soutenue en partie par le National Cancer Institute sous le numéro d’attribution P30 CA142543. Un merci spécial à tous les membres du Chan Lab.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 mM HEPES BufferGibco  ;
100x Antibiotique-Antimycosique  ;Gibco  ;15240-096
100x GlutamaxLife Technologies  ;35050-061Supplément de glutamine
100x insuline-transfertrine-sélénium (ITS)  ;Technologies de la vie  ;51500-056
100x Pénicilline/Streptomycine (Pen/Streptocoque)Sigma  ;P4333
10x DMEMSigma  ;D2429
50 mL/0,2 & micro ; m gourde filtranteFisher  ;#564-0020
Amphotéricine BLife Technologies  ;15290-018
bFGFSigmaF0291
BSA Solution (32 %)Sigma  ;
toxine cholériqueSigma  ;C8052
CO2-Independent Medium  ;Gibco18045-088
Collagénase A  ;Sigma  ;C2139
Désoxyribonucléase I du pancréas bovin (DNase)SigmaD4263
DMEM avec 4500 mg/L de glucose, pyruvate de sodium et bicarbonate de sodium, sans L-glutamine, liquide, stérile-filtré, adapté à la culture cellulaireSigmaD6546Milieu basal commun
D-MEM/F12  ;Technologies de la vie  ;#10565-018Milieu basal
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (D-PBS)  ;Sigma#D8662PBS
Sérum fœtal bovin (FBS)Sigma  ;
Gentamicine  ;Technologies de la vie  ;#15750-060
Facteur de croissance épidermique humain (EGF)Sigma  ;E9644
Hydrocortisone  ;Sigma  ;H0396
Insuline  ;Sigma  ;
Matrigel  ;Corning  ;#354230Matrice extracellulaire du socle (BECM)
NaOH (1 N)Sigma  ;S2770
Collagène de queue de rat ICorning  ;
RPMI-1640 mediaFisher  ;
Trypsine  ;Technologies de la vie  ;Référence 27250-018
15630080#A9576#F0926#I9278354236SH3002701

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
  2. Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698(2021).
  3. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  4. Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
  5. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  6. Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  7. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  8. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  9. Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
  10. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  11. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  12. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  13. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  14. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991(2019).
  15. Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
  16. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
  17. Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285(2017).
  18. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  19. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  20. Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
  21. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  23. Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  24. Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398(2021).
  25. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  26. Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134(2020).
  27. Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
  28. Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762(2022).
  29. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  30. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
  31. LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
  32. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
  33. Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Centrifugation diff rentielleEnrobage d organo desMatrice de collag neMarquage immunofluorescentMicroenvironnement tumoralEssai d invasion d organo desCo culture d organo desImagerie d organo des

Articles connexes