L’un des principaux moteurs des phénotypes cellulaires chez les eucaryotes est l’expression des gènes. Le contrôle de l’expression des gènes est essentiel et s’appuie sur de multiples protéines et ARN, de la transcription aux processus de traduction1. Les altérations le long de ces étapes peuvent déclencher plusieurs maladies différentes. Le traitement et l’épissage de l’ARN constituent un groupe important de réactions responsables de la génération de molécules d’ARN matures 2,3,4,5. L’épissage élimine les introns et relie les exons pour générer une molécule d’ARN mature capable d’effectuer des activités fonctionnelles et structurelles. L’efficacité et les taux d’épissage ont un impact considérable sur les phénotypes observés dans différentes conditions6.
L’épissage est effectué par une machinerie macromoléculaire complexe appelée épissage, qui est composée de cinq ARNsn et de plus de 100 protéines 5,7. En plus des composants protéiques de base, les splicéosomes ont des protéines trans-agissantes, qui pourraient affecter directement la régulation de ce processus 8,9. L’importance de l’épissage se reflète dans le large éventail de maladies causées par des altérations de ce processus, notamment les troubles neurodégénératifs, les maladies neuromusculaires et plusieurs types de cancer 3,10,11. L’étude de la dynamique de l’épissage et de l’assemblage de l’épissage peut grandement impacter la compréhension de la biologie de ces troubles.
L’assemblage de l’épissage commence par l’association de U1 snRNP avec une région spécifique du pré-ARNm récemment transcrit, le site d’épissage 5' 5,8. L’appariement et la reconnaissance efficaces des sites d’épissage 5' par l’ARNsn U1 définissent non seulement les sites d’épissage qui doivent être utilisés, mais contrôlent également quels pré-ARN seront épissés en premier, ou plus efficacement 6,12,13. L’utilisation de différents sites d’épissage peut générer plusieurs isoformes alternatives d’ARN matures à partir du même gène. L’épissage alternatif est une source majeure de diversité protéomique, permettant la génération des ARN et des protéines nécessaires au développement ou dans différentes cellules et tissus 14,15. D’autres transcrits d’ARN peuvent générer des isoformes de protéines tronquées ou non fonctionnelles, ce qui peut provoquer des maladies10,16. Par conséquent, les composants protéiques du complexe U1 snRNP jouent un rôle régulateur important dans l’épissage1. La galectine-1 et la galectine-3 (Gal1 et Gal3) sont des composants de U1 snRNP17,18. Voss et al.19 proposent une méthode de fractionnement d’extrait nucléaire pour obtenir des complexes enrichis en snRNP Gal3-U1 capables de sauver l’activité d’épissage dans des cellules appauvries en U1. Cette analyse contribue à comprendre le mécanisme d’association de Gal3 aux épissages, et des approches similaires peuvent être utilisées pour explorer d’autres protéines régulatrices potentielles de l’épissage.
La liaison de U1 snRNP aux sites d'épissage 5' est un médiateur important de la fidélité de l'épissage20. Les mutations au niveau des sites d’épissage 5' sont critiques et entraînent la perte de l’appariement U1 snRNP, entraînant des défauts d’épissage2. La mucoviscidose, par exemple, est causée par un site d'épissage 5' muté dans le gène CFTR21. Wong et al.22 décrivent une méthode pour compenser les mutations du site d'épissage 5' par des mutations complémentaires dans les ARNnb U1. L’approche favorise avec succès l’inclusion d’exons, générant des ARN matures et aboutissant à un sauvetage des défauts d’épissage. En plus d’offrir une possible thérapie à base d’ARN pour ces maladies, cette approche peut être utile pour l’analyse de séquences régulatrices individuelles dans les pré-ARNm23.
La fidélité de l’association de l’ARNsn U1 aux sites d’épissage est également explorée dans le système modèle de levure par van der Feltz24. La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae a été largement utilisée pour explorer la cinétique d’épissage et l’assemblage des épissages25. La cinétique d’épissage et la composition de l’épissage sont bien conservées chez les eucaryotes, et la levure a été largement utilisée pour surveiller la formation de complexes intermédiaires au cours de l’assemblage26. Le test rapporteur ACT1-CUP1 est basé sur l’expression d’une paire de gènes : ACT1, qui contient un intron avec des séquences de sites d’épissage optimales, et CUP1, qui exprime un chélateur de cuivre, protégeant la cellule des dommages causés par cet ion métallique. CUP1 n’est exprimé que si ACT1 est correctement épissé, créant ainsi le système rapporteur27. La croissance cellulaire dans des conditions avec différentes concentrations de cuivre peut être surveillée pour évaluer l’efficacité de l’épissage de différentes séquences d’introns ou en utilisant différentes protéines régulatrices. van der Feltz24 présente une méthode pour analyser les effets d’une protéine régulatrice d’épissage à l’aide de ce système rapporteur et de tests de viabilité du cuivre. Une approche similaire peut être utilisée pour concevoir des variations dans les séquences d’introns en combinaison avec différentes protéines afin d’améliorer le succès de l’épissage chez les levures.
En plus de l’association snRNP, la liaison des protéines est essentielle lors de l’assemblage de l’épissage1. Le contrôle de l’activité des splicéosomes dépend directement de sa composition protéique et des interactions qui se produisent lors de sa formation. Les caractéristiques structurelles et fonctionnelles des composants protéiques sont importantes pour activer le complexe 5,7. Carvalho et al.28 utilisent une approche basée sur la méthode Grafix, qui repose sur la réticulation non réversible des protéines dans l’analyse du gradient de glycérol. Cette analyse porte sur la composition des protéines et les interactions transitoires qui se produisent lors de l’assemblage, ce qui peut être essentiel pour l’assemblage du complexe actif et le succès de l’épissage. L’analyse d’autres complexes macromoléculaires dynamiques avec cette approche peut être très utile et fournir des informations sur l’organisation et les interactions des protéines.
La chimie et la vitesse d’épissage sont également affectées par l’association dynamique des différents composants de l’épissage8. Récemment, l’utilisation d’inhibiteurs d’épissage à petites molécules a révélé que des étapes spécifiques peuvent être bloquées in vitro en raison de la vitesse réduite des réactions d’épissage29,30. Basei et al.31 présentent une méthode pour analyser l’épissage alternatif sur l’influence du facteur régulateur d’épissage, Nek4. La prévalence des isoformes de transcrits conduisant à des phénotypes pro- ou anti-tumoraux dans les cellules HEK293 utilisant un minigène est abordée. La mauvaise régulation de l’épissage ou les différentes utilisations des sites d’épissage peuvent conduire à une génération alternative de transcrits, provoquant différents types de cancer16. L’utilisation de modulateurs ou d’inhibiteurs d’épissage pendant le traitement peut déterminer les choix de sites d’épissage, définissant ainsi les isoformes alternatives générées, qu’elles soient pro- ou anti-tumorales. Le paclitaxel et le cisplatine sont actuellement utilisés comme agents chimiothérapeutiques. Avec l’utilisation du minigène E1A, les effets de ces médicaments dans l’épissage alternatif sont abordés. L’analyse de l’épissage alternatif à l’aide de minigènes est une stratégie importante pour surveiller les effets des protéines transagissantes et les changements d’épissage lors du traitement et de l’utilisation de médicaments spécifiques.
Dans cette lignée, de nombreux microARN introniques (miARN) ont été rapportés comme étant associés à des phénotypes tumoraux32,33. Le contrôle et la régulation de la synthèse et de la biogenèse des miARN introniques peuvent être associés au contrôle des réactions d’épissage. Les miARN peuvent moduler la stabilité et la prévalence des ARNm dans les cellules, affectant la stabilité de l’ARN et le taux de traduction34 . Gatti da Silva et Coltri35 décrivent un système rapporteur pour évaluer la biogenèse et la maturation des miARN introniques, qui peut être directement lié à des altérations des phénotypes cellulaires et à la détermination de caractéristiques pro- ou anti-tumorales. Avec la modulation de la protéine régulatrice d’épissage HuR, le système permet l’analyse de la biogenèse et de l’activité fonctionnelle d’un miARN oncogène intronique.
L’analyse de l’épissage des pré-ARN et de la maturation de différents ARN dans des cellules spécifiques sera essentielle pour comprendre et interpréter les informations génomiques. Les splicéosomes de levure et de mammifère sont conservés, et la recherche fondamentale peut améliorer l’utilisation des différentes méthodes appliquées aux thérapies et à la biomédecine. Malgré la grande quantité de données génomiques actuellement disponibles, l’expression de cette information dans les phénotypes pourrait être spécifique à la cellule et dépendre du traitement et de l’épissage de l’ARN. Comprendre la régulation complexe de ce processus sera essentiel pour les recherches futures.