Method Article

Méthodes et protocoles d’imagerie en direct en développement

DOI:

10.3791/64642

⸱

January 13th, 2023

1Department of Neurobiology and Department of Neurosurgery of Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Liangzhu Laboratory, MOE Frontier Science Center for Brain Science and Brain-machine Integration, State Key Laboratory of Brain-machine Intelligence, Zhejiang University, 3NHC and CAMS Key Laboratory of Medical Neurobiology, Zhejiang University

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ARTICLES DISCUTÉS :

Januschke, J., Loyer, N. Applications de l’immobilisation des tissus de la drosophile avec des caillots de fibrine pour l’imagerie en direct. Journal des expériences visualisées. (166), 10.3791/61954 (2020).

Li, T., Luo, L. Un système d’explant pour l’étude d’imagerie time-lapse de l’assemblage des circuits olfactifs chez la drosophile. Journal des expériences visualisées. (176), 10.3791/62983 (2021).

Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. Imagerie in vivo du tissu cérébral pleinement actif chez les larves et les juvéniles de poisson-zèbre éveillés par ablation du crâne et de la peau. Journal des expériences visualisées. (168), 10.3791/62166 (2021).

Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Imagerie simultanée en direct de plusieurs embryons d’insectes dans des microscopes à fluorescence à feuillet de lumière basés sur une chambre d’échantillon. Journal des expériences visualisées. (163), 10.3791/61713 (2020).

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS imagerie de cellules vivantes au cours du développement neuronal. Journal des expériences visualisées. (168), 10.3791/62165 (2021).

Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Imagerie sans marquage de la dynamique de stockage des lipides chez Caenorhabditis elegans à l’aide de la microscopie à diffusion Raman stimulée. Journal des expériences visualisées. (171), 10.3791/61870 (2021).

Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Ablations volumiques profondes et spatialement contrôlées à l’aide d’un microscope à deux photons dans la gastrula du poisson-zèbre. Journal des expériences visualisées. (173), 10.3791/62815 (2021).

Discussion

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Le développement est caractérisé par le changement dynamique des structures au niveau des organites, des cellules et des organes. La capacité de l’imagerie time-lapse à collecter des informations quadridimensionnelles à partir de la même structure dans son état physiologique en fait une technique idéale pour étudier le processus dynamique de développement 1,2,3,4,5,6. La grande quantité de données collectées grâce à l’imagerie en direct permet également l’analyse quantitative du développement. Bien que l’imagerie time-lapse ait été plus largement utilisée pour la culture cellulaire monocouche, l’imagerie de tissus vivants ou d’animaux tridimensionnels est beaucoup plus difficile en raison de difficultés techniques, telles que la diffusion de la lumière des tissus vivants, le développement d’une stratégie de montage et d’une méthode de marquage appropriées, le maintien d’un état physiologique normal pendant une longue période d’imagerie, l’accessibilité à un microscope approprié, etc. Ces défis limitent l’utilisation de l’imagerie en direct dans de nombreux laboratoires. Dans cette collection de méthodes, sept articles ont rapporté de nouvelles méthodes de préparation d’échantillons vivants, d’étiquetage et de manipulation au laser. Toutes ces méthodes facilitent l’imagerie en direct des processus de développement sous différents angles.

L’imagerie directe des régions profondes est techniquement difficile en raison de la forte diffusion des tissus vivants. Cette diffusion peut être minimisée par l’exposition des organes internes par dissection, améliorant ainsi la résolution spatiale des images. Dans cette collection, Januschke et Loyer7 ont décrit un protocole de dissection des cerveaux larvaires de drosophile et une méthode de montage à l’aide de caillots de Fibrin. Cette stratégie de montage a permis l’imagerie en accéléré à l’aide de microscopes inversés de plusieurs échantillons sur la même boîte, car elle ne nécessitait que l’ajout de fibrinogène et de thrombine. Li et Luo8 ont présenté un protocole pour la dissection d’un explant antenne-cerveau de pupes de mouches et une condition de culture ex vivo qui a maintenu le développement normal du circuit olfactif pendant 24 h. Leur système a permis de visualiser le ciblage axonal et dendritique dans l’assemblage du circuit olfactif d’une mouche à partir de son état physiologique. Ce système d’explantation convient au microscope à deux photons et au microscope à feuille de lumière sur réseau avec imagerie basée sur l’optique adaptative, permettant à la fois une imagerie continue à long terme et une imagerie rapide avec une résolution spatio-temporelle élevée dans un court laps de temps. Schramm et al.9 ont mis au point une procédure chirurgicale mini-invasive pour enlever la peau et le cartilage mou du crâne du poisson-zèbre par micro-peeling. Cela leur a permis d’observer certains événements clés dans les stades ultérieurs du développement, notamment la différenciation neuronale, la maturation, la plasticité et le passage en Ca2+ jusqu’à 30 jours après la fécondation. Cela leur a également permis d’effectuer une imagerie en direct après la pigmentation de la peau des larves de poisson-zèbre. Outre la dissection, un montage approprié des échantillons est également crucial pour l’imagerie en direct. Ratke et al.10 ont présenté un cadre expérimental pour l’imagerie en direct simultanée de plusieurs embryons de mouches à l’aide de la microscopie à feuillet de lumière. Ce protocole a augmenté le débit global et est idéal pour les études comparatives.

En plus de la préparation des échantillons, de nouvelles méthodes de marquage facilitent la visualisation de structures spécifiques dans les tissus vivants. Terzi et al.11 ont rapporté un biocapteur spécifique de H2O2 génétiquement codé, roGFP2-Orp1, pour l’imagerie des niveaux intracellulaires de H2O2 à partir de neurones de poisson-zèbre cultivés et de larves entières au cours du développement. L’un des avantages importants de ce biocapteurH2O2 génétiquement codé était l’amélioration de la résolution temporelle et spatiale de la détection de H2O2 . Une autre étude de Mutlu et al.12 a décrit la microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS), une méthode d’imagerie chimique sans marquage pour la détection rapide et quantitative des lipides dans les cellules vivantes avec une résolution subcellulaire. LeH2O2 et les lipides sont facilement perdus lors de la fixation de l’échantillon. Le développement de méthodes de marquage ou d’imagerie dans les tissus vivants a non seulement permis de contourner ce défi, mais a également conservé des informations spatiales et temporelles de ces structures dans les processus biologiques.

Enfin, la lumière peut également être utilisée pour l’ablation cellulaire. Boutillon et al.13 ont montré une méthode pour ablater des volumes profonds et spatialement bien définis chez le poisson zèbre à l’aide d’un microscope à deux photons. Par rapport aux ablations cellulaires par laser ultraviolet, le laser à deux photons a amélioré la résolution axiale et la pénétration tissulaire. Ce protocole a fourni une stratégie de perturbation pour étudier l’interaction cellule-cellule au cours du développement.

Les progrès des technologies microscopiques nous ont permis de comprendre de nombreux processus de développement en quatre dimensions. Les protocoles de cette collection aideront davantage de scientifiques à surmonter l’obstacle technique de l’imagerie en direct dans différents systèmes biologiques. Nous prévoyons que d’autres méthodes facilitant l’imagerie en direct seront développées à l’avenir.

Disclosures

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L’auteur n’a rien à divulguer.

Acknowledgements

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Ce numéro de la collection de méthodes JoVE a été financé par NIH 1K99DC01883001. Je remercie mon mentor postdoc Liqun Luo, mes collaborateurs Eric Betzig et Tian-Ming Fu pour le soutien solide qui m’a permis de développer mon intérêt pour l’imagerie time-lapse au cours de mon projet postdoctoral. Je remercie également l’École des sciences du cerveau et de la médecine du cerveau de l’Université du Zhejiang de m’avoir recruté et de m’avoir aidé à poursuivre l’étude de l’imagerie en accéléré dans mon propre laboratoire.

References

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  1. Rieger, S., Wang, F., Sagasti, A. Time-lapse imaging of neural development: zebrafish lead the way into the fourth dimension. Genesis. 49 (7), 534-545 (2011).
  2. Wong, C., Chen, A. A., Behr, B., Shen, S. Time-lapse microscopy and image analysis in basic and clinical embryo development research. Reproductive Biomedicine Online. 26 (2), 120-129 (2013).
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  7. Januschke, J., Loyer, N. Applications of immobilization of Drosophila tissues with fibrin clots for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e61954(2020).
  8. Li, T., Luo, L. An explant system for time-lapse imaging studies of olfactory circuit assembly in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (176), e62983(2021).
  9. Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. In vivo imaging of fully active brain tissue in awake Zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal. Journal of Visualized Experiments. (168), e62166(2021).
  10. Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Simultaneous live imaging of multiple insect embryos in sample chamber-based light sheet fluorescence microscopes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61713(2020).
  11. Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS live cell imaging during neuronal development. Journal of Visualized Experiments. (168), e62165(2021).
  12. Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid storage dynamics in Caenorhabditis elegans using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (171), e61870(2021).
  13. Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the Zebrafish gastrula. Journal of Visualized Experiments. (173), e62815(2021).

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