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Utilisation de C. elegans pour surveiller les déséquilibres de la protéostasie

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DOI :

10.3791/64643

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24 août 2022

 , 
1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Anatomy II, Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-University of Munich

Dans cet article

Résumé

Le réseau de protéostasie est un système de contrôle de la qualité des protéines cellulaires qui assure la fonctionnalité du protéome, favorisant ainsi la santé cellulaire et de l’organisme. Avec l’âge, sa fidélité diminue, ce qui entraîne une vulnérabilité accrue du protéome au stress et éventuellement à des maladies telles que les troubles neurodégénératifs et le cancer. Pour mettre en évidence les recherches sur ce réseau conservé au cours de l’évolution, le Journal of Visualized Experiments (JoVE) présente une collection de méthodes de chercheurs utilisant C. elegans pour surveiller les déséquilibres de la protéostasie. Cet éditorial donne un bref aperçu de ces différentes approches expérimentales pour comprendre le réseau de protéostasie aux niveaux cellulaire, tissulaire et organique.

ARTICLES DISCUTÉS :

Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Méthodes normalisées de mesure de l’induction de la réponse au choc thermique chez Caenorhabditis elegans. Journal des expériences visualisées. (161), doi :10.3791/61030 (2020).

Chauve, L. et al. RT-PCR quantitative à haut débit dans des échantillons uniques et en vrac de C. elegans à l’aide de la technologie nanofluidique. Journal des expériences visualisées. (159), doi :10.3791/61132 (2020).

Bar-Ziv, R. et al. Mesures des réponses physiologiques au stress chez C. Elegans. Journal des expériences visualisées. (159), doi :10.3791/61001 (2020).

Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. Worm-align and Worm_CP, deux pipelines open-source pour le redressement et la quantification des données d’image de fluorescence obtenues à partir de Caenorhabditis elegans. Journal des expériences visualisées. (159), doi :10.3791/61136 (2020).

Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantification du déclin protéostatique spécifique aux tissus chez Caenorhabditis elegans. Journal des expériences visualisées. (175), doi :10.3791/61100 (2021).

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Utilisation de Caenorhabditis elegans pour dépister les interactions chaperonnes spécifiques aux tissus. Journal des expériences visualisées. (160), doi :10.3791/61140 (2020).

Miles, J., van Oosten-Hawle, P. Outils ARNi spécifiques aux tissus pour identifier les composants de la signalisation du stress systémique. Journal des expériences visualisées. (159), doi :10.3791/61357 (2020).

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. Quantification in vivo du renouvellement des protéines chez C. elegans vieillissant à l’aide de dendra2 photoconvertible. Journal des expériences visualisées. (160), doi :10.3791/61196 (2020).

Pigazzini, M. L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Caractérisation des structures amyloïdes chez C. elegans vieillissant à l’aide de l’imagerie de la durée de vie de la fluorescence. Journal des expériences visualisées. (157), doi :10.3791/61004 (2020).

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Mesure de la toxicité peptidique RAN chez C. elegans. Journal des expériences visualisées. (158), doi :10.3791/61024 (2020).

Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Approches quantitatives pour l’évaluation in vivo de l’agrégat neuronal et de l’extrusion d’organites dans de grandes vésicules d’exopher chez C. elegans. Journal des expériences visualisées. (163), doi :10.3791/61368 (2020).

Éditorial

L’homéostasie des protéines, ou protéostasie, est fondamentale pour la santé cellulaire et de l’organisme 1,2. Les processus cellulaires conservés coopèrent pour maintenir un protéome correctement replié en influençant la synthèse, le repliement et l’élimination des protéines 3,4. Les perturbations de la protéostasie ont été associées à des maladies neurodégénératives et à des cancers liés à l’âge 5,6. Sur la base du haut niveau de conservation, des organismes modèles tels que le nématode Caenorhabditis elegans (C. elegans) ont joué un rôle déterminant dans la compréhension du rôle de la protéostasie dans la santé humaine et la maladie 7,8. C. elegans possède de nombreuses caractéristiques qui en font un modèle expérimental idéal, notamment son cycle de vie court, sa cuticule transparente et sa facilité de manipulations chimiques et génétiques9. Cette collection de méthodes fournit des protocoles détaillés pour surveiller les déséquilibres de la protéostasie au niveau moléculaire, cellulaire et de l’organisme chez C. elegans.

Les cellules réagissent aux perturbations de la protéostasie en activant une variété de réponses au stress, y compris la réponse au choc thermique (HSR), la réponse aux protéines dépliées (UPR) et la réponse au stress oxydatif (OxSR) pour réajuster le protéome cellulaire10. Pour améliorer la reproductibilité sur le terrain, des pratiques standardisées pour l’induction robuste de la HSR sont décrites par Golden et ses collègues11. La RT-qPCR est une méthode sensible largement utilisée pour analyser l’expression des gènes en quantifiant l’ARNm, et ce test peut être utilisé pour mesurer les niveaux d’ARNm cellulaires de divers gènes induits par un choc thermique11. Pour étendre cette approche à l’analyse à grande échelle et à haut débit, Chauve et al.12 décrivent une nouvelle adaptation pour la préparation de l’ADNc, couplée à une plateforme nanofluidique RT-qPCR robuste et très sensible. Des mesures précises de l’expression génique peuvent être effectuées sur des vers uniques ou des échantillons en vrac12. Les cibles recommandées des gènes de réponse au stress ainsi que les paires d’amorces pour mesurer la régulation transcriptionnelle positive des gènes de réponse au stress sont énumérées dans les protocoles correspondants12,13.

L’une des limites de l’utilisation de la RT-qPCR pour évaluer l’activation des réponses au stress est qu’elle peut être coûteuse, techniquement difficile et nécessite l’utilisation d’un équipement spécialisé. Par conséquent, des souches rapporteures transcriptionnelles spécifiques à la voie exprimant une protéine fluorescente sous un promoteur inductible par le stress (par exemple, hsp-16.2p ::gfp pour la surveillance de la HSR) sont fréquemment utilisées pour évaluer les réponses cellulaires au stress11. À l’aide d’un flux de travail open source simple basé aux Fidji nommé Worm-align, associé au Worm_CP de pipeline CellProfiler, Okkenhaug et ses collègues décrivent14 étapes pour quantifier rapidement la fluorescence de vers individuels. De plus, Bar-Ziv et al.13 décrivent une méthode à haut débit utilisant un cytomètre à flux de grandes particules qui permet de capturer l’intensité de fluorescence, la taille et la distribution spatiale (2D) de milliers d’animaux. Des informations sur les rapporteurs transcriptionnels pour l’évaluation de l’activation des réponses au stress cellulaire ainsi que les paramètres recommandés pour la microscopie à fluorescence et la quantification à l’aide d’un biotrieur de vers sont fournies13. Il est important de noter que ces rapporteurs peuvent être associés à des tests de survie au stress physiologique spécifiques qui surveillent la santé d’un animal suivant un régime de stress spécifique11,13. Bien que les rapporteurs fluorescents aient l’avantage de révéler des différences spécifiques aux tissus, ils ne peuvent détecter l’induction qu’au-dessus d’un certain seuil et la stabilité de certains fluorophores, tels que la GFP, empêche la détection de variations dynamiques dans l’expression des gènes. De plus, la plupart des tests physiologiques prennent du temps et ont donc une évolutivité limitée. Malgré ces limites, ces méthodes permettent une caractérisation complète des effets cellulaires et physiologiques des facteurs de stress internes et externes.

Les perturbations protéotoxiques chroniques sont associées à l’effondrement du réseau de protéostasie (PN), la machinerie de contrôle de la qualité responsable du maintien d’un protéome fonctionnel 5,6. Le déclin progressif de la protéostasie a été impliqué dans de nombreuses maladies liées à l’âge. C. elegans est un excellent système modèle pour examiner la vulnérabilité de tissus spécifiques aux défaillances de la protéostasie. Lazaro-Pena et al.15 décrivent une approche pour surveiller les muscles de la paroi corporelle ou la fonctionnalité neuronale à mesure que le ver vieillit. Cette approche peut être adaptée pour l’analyse génétique à haut débit ou le dépistage de drogues15. L’enjeu majeur est de comprendre comment fonctionnent les interactions entre les différents composants du PN in vivo. Pour remédier à cette lacune, Dror et ses collègues16 ont mis au point un système permettant de collecter des informations spécifiques sur les interactions des chaperons moléculaires, composants clés de la NP, dans des tissus spécifiques au cours du développement et du vieillissement. En couplant des perturbations spécifiques à un tissu de l’équilibre de repliement avec des mutants disponibles ou des souches transgéniques qui permettent le silençage spécifique au tissu des gènes cibles par l’ARNi, le réseau chaperon dans un tissu donné peut être examiné. En complétant cette stratégie par des tests comportementaux simples qui évaluent la fonctionnalité de tissus ou de types de cellules spécifiques, on peut découvrir des interactions biologiquement pertinentes du PN in vivo15,16. Il est important de reconnaître que les déséquilibres de la protéostasie dans un tissu ou un type de cellule peuvent avoir un impact sur le système de contrôle de la qualité d’autres tissus de manière non autonome sur les cellules. Miles et van-Oosten-Hawle17 décrivent une approche permettant d’identifier les mécanismes et les composants de la PN cellulaire non autonome à l’aide d’approches ARNi spécifiques aux tissus couplées à une gamme de rapporteurs de stress et de capteurs de protéostasie17. Cette stratégie permet d’examiner la capacité de PN dans différents tissus à la suite de mécanismes de réponse au stress activés par des cellules non autonomes.

C. elegans est couramment utilisé pour modéliser les maladies neurodégénératives liées à l'âge causées par des mutations de l'expansion répétée de la polyglutamine, telles que la maladie de Huntington18. Un capteur de protéostasie qui est fortement utilisé est un fragment de polyglutamine (polyQ) fusionné à une protéine fluorescente qui forme des foyers in vivo en fonction de la longueur du polyQ et de l’âge de19 ans. Pour améliorer la reproductibilité entre les essais biologiques, entre les individus et entre les laboratoires, il faut définir ce qui est noté comme des foyers. Lazaro-Pena et al.15 décrivent une stratégie pour mesurer avec précision la formation de foyers polyQ ::YFP dans les neurones ou les muscles de la paroi corporelle au cours du vieillissement. Pour surveiller les taux de renouvellement de la protéine huntingtine mutante sujette à l’agrégation et portant une expansion de polyglutamine, Pigazzini et Kirstein20 décrivent une technique non invasive qui nécessite l’utilisation du fluorophore photoconvertible Dendra2. À l’aide de la microscopie confocale et d’une souche de C. elegans exprimant la huntingtine mutante fusionnée à Dendra2, il est possible de surveiller et de quantifier la dégradation de cette protéine sujette à l’agrégation dans un organismevieillissant20. Pour quantifier la fibrilisation amyloïde de protéines sujettes à l’agrégation telles que la huntingtine mutante, la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM) peut être utilisée21. FLIM permet une analyse non invasive du processus d’agrégation en surveillant l’extinction des fluorophores à proximité immédiate des structures amyloïdes, réduisant ainsi la durée de vie de la fluorescence21. La durée de vie de la fluorescence est négativement corrélée à l’agrégation de la protéine amyloïde fusionnée et est indépendante des niveaux d’expression des fluorophores. Cette technique permet à un chercheur de suivre les effets du vieillissement et de l’altération de la PN sur la propension à l’agrégation de n’importe quelle protéine. Cependant, si l’intensité du fluorophore est faible, cela peut devenir problématique puisque le FLIM nécessite l’acquisition d’un nombre relativement important de photons. Une puissance laser d’excitation plus élevée est donc nécessaire, ce qui entraîne un photoblanchiment plus rapide et une courbe de décomposition peu fiable. De plus, la technique nécessite un équipement sophistiqué et coûteux en complément des systèmes de microscopie préexistants. Une approche standardisée importante est incluse pour un protocole différent étudiant la traduction non dépendante d’AUG (RAN) associée à la répétition associée à l’ARN contenant des expansions répétées. Étant donné que la traduction RAN ne nécessite pas de codon de départ pour déterminer le cadre de lecture, le nombre de peptides toxiques associés à la maladie augmente. Rudich et ses collègues22 fournissent des détails sur la façon de quantifier la toxicité du peptide RAN à l’aide du mouvement et de la reproduction de C. elegans.

Les déséquilibres de la protéostasie entraînent un mauvais repliement des protéines et l’accumulation d’agrégats de protéines qui ont été liés à de multiples maladies neurodégénératives liées à l’âge 5,6. Des souches de C. elegans exprimant diverses protéines sujettes à l’agrégation fusionnées à des rapporteurs fluorescents ont été utilisées pour surveiller les déséquilibres de protéostasie dans différents types de cellules et de tissus. L’analyse de ces modèles a conduit à une série d’observations nouvelles ; Monica Driscoll et ses collègues ont remarqué que les neurones libèrent des agrégats PolyQ et d’autres débris cellulaires, tels que des organites endommagés, dans des « exophères », découvrant une branche auparavant non reconnue de la protéostasie neuronale23. Comme il s’agit d’un phénomène nouveau, il est crucial de fournir des instructions claires pour le suivi de la production d’exopher afin d’assurer la reproductibilité sur le terrain. Arnold et al.24 décrivent les caractéristiques physiques des exophateurs de C. elegans, les stratégies de détection, les critères d’identification et le moment optimal de la quantification. De plus, ce protocole met en évidence l’attention critique nécessaire pour contrôler strictement les conditions de croissance afin d’éliminer les stress involontaires qui peuvent moduler les niveaux d’exopher afin d’obtenir une évaluation reproductible de la production d’exopher.

Cette collection fournit de multiples stratégies méthodologiques pour surveiller les déséquilibres de protéostasie au niveau moléculaire, cellulaire et de l’organisme chez C. elegans. Des facteurs de stress, tels que des protéines de maladie mal repliées, peuvent être introduits expérimentalement dans des types de tissus spécifiques, tandis que la réponse cellulaire et organique à la protéotoxicité est surveillée au fil du temps. Cette collection fournit une boîte à outils pour sonder et surveiller la protéostasie, évaluer les systèmes de contrôle de la qualité qui maintiennent un protéome plié et étudier la dérégulation de ces systèmes qui mènent à la maladie.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions nos collègues pour leurs contributions très précieuses à cette collection de méthodes.

Références

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  2. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475 (7356), 324-332 (2011).
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  11. Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (161), e61030(2020).
  12. Chauve, L. High-throughput quantitative RT-PCR in single and bulk C. elegans samples using nanofluidic technology. Journal of Visualized Experiments. (159), e61132(2020).
  13. Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments. (159), e61001(2020).
  14. Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. Worm-align and Worm_CP, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (159), e61136(2020).
  15. Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (175), e61100(2021).
  16. Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions. Journal of Visualized Experiments. (160), e61140(2020).
  17. Miles, J., van Oosten-Hawle, P. Tissue-specific RNAi tools to identify components for systemic stress signaling. Journal of Visualized Experiments. (159), e61357(2020).
  18. Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods Enzymology. 412, 256-282 (2006).
  19. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  20. Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In vivo quantification of protein turnover in aging C. elegans using photoconvertible dendra2. Journal of Visualized Experiments. (160), e61196(2020).
  21. Pigazzini, M. L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Characterization of amyloid structures in aging C. elegans using fluorescence lifetime imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), e61004(2020).
  22. Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN peptide toxicity in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e61024(2020).
  23. Melentijevic, I., et al. C. elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress. Nature. 542 (7641), 367-371 (2017).
  24. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative approaches for scoring in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (163), e61368(2020).

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