Quantification des complexes myéloperoxydase-ADN et neutrophile élastase-ADN à partir de pièges extracellulaires neutrophiles à l’aide d’un test ELISA sandwich modifié

Résumé

Nous présentons un protocole pour une technique modifiée de dosage immuno-enzymatique sandwich permettant de mesurer quantitativement deux composants des restes de pièges extracellulaires neutrophiles, l’ADN conjugué myéloperoxydase et les complexes ADN conjugués à l’élastase neutrophile, dérivés de neutrophiles activés.

Résumé

Certains stimuli, tels que les micro-organismes, amènent les neutrophiles à libérer des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE), qui sont essentiellement des structures en forme de toile composées d’ADN avec des protéines granulaires, telles que la myéloperoxydase (MPO) et l’élastase neutrophile (NE), et des protéines cytoplasmiques et cytosquelettiques. Bien que l’intérêt pour les TNE ait augmenté récemment, il n’existe pas de méthode de dosage sensible et fiable pour mesurer les TNE en milieu clinique. Cet article décrit un test immuno-enzymatique sandwich modifié pour mesurer quantitativement deux composants des TNE circulantes, l’ADN-MPO et les complexes ADN-NE, qui sont des composants spécifiques des TNE et qui sont libérés dans l’espace extracellulaire en tant que produits de dégradation des TNE. Le test utilise des anticorps monoclonaux spécifiques pour MPO ou NE comme anticorps de capture et un anticorps de détection spécifique de l’ADN. MPO ou NE se lie à un site de l’anticorps de capture lors de l’incubation initiale d’échantillons contenant des complexes MPO-ADN ou NE-ADN. Ce test montre une bonne linéarité et une grande précision inter-essais et intra-essais. Nous l’avons utilisé chez 16 patients atteints de COVID-19 avec le syndrome de détresse respiratoire aiguë qui l’accompagne et avons constaté que les concentrations plasmatiques de MPO-ADN et d’ADN-NE étaient significativement plus élevées que dans le plasma obtenu à partir de témoins sains. Ce test de détection est une méthode fiable, très sensible et utile pour étudier les caractéristiques des TNE dans le plasma humain et les surnageants en culture.

Introduction

Cet article décrit une méthode permettant de quantifier la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (NET) dans les fluides biologiques en utilisant le test immuno-enzymatique sandwich (ELISA) pour détecter les complexes de myéloperoxydase (MPO) et d’élastase neutrophile (NE) avec l’ADN ^1,2. Les TNE sont composées d’un squelette d’ADN décoré de protéases antimicrobiennes provenant de granules de neutrophiles ^3,4. Les complexes MPO-ADN et ADN-E sont tous deux des composants importants et spécifiques des TNE et sont libérés dans l’espace extracel....

Protocole

Cette étude a été menée conformément à la Déclaration d’Helsinki et a été approuvée par les comités d’examen institutionnels de l’Université de médecine d’Aichi (2017-H341, 2019-H137). Le consentement éclairé écrit de chaque participant a été obtenu.

1. Préparation des réactifs

REMARQUE : Pour effectuer le test ELISA sandwich, les réactifs sont préparés comme décrit ci-dessous.

1. Tampon de revêtement :
   1. Pour obtenir un tampon carbonate-bicarbonate de 0,1 mol/L, peser 10,6 g de carbonate de sodium anhydre (poids moléculaire, 106 g/mol) et 8,4 g de bicarbonate de sodium (poids molécul....

Résultats

Cette méthode a utilisé un test ELISA sandwich avec des anticorps monoclonaux anti-MPO, anti-NE et anti-ADN pour mesurer l’ADN associé au MPO et l’ADN associé à l’EN (Figure 1). Dans cette méthode, les puits d’une plaque de microtitration ont été recouverts d’un anticorps monoclonal spécifique ou spécifique de l’ON pour capturer le MPO associé à l’ADN et l’ON associé à l’ADN, ainsi que le MPO et l’EN non associés à l’ADN. Pour calculer le coefficient de variabilité (CV) intra-essai, des mesu.......

Discussion

Nous avons décrit une méthode ELISA sandwich dans laquelle MPO ou NE se lie à un site de l’anticorps de capture lors de l’incubation initiale d’échantillons contenant des complexes MPO-ADN ou NE-ADN. Après le lavage, le « sandwich » est complété par l’incubation des échantillons avec un anticorps monoclonal anti-ADN associé à la peroxydase. Après l’élimination de l’anticorps secondaire non lié, le conjugué peroxydase lié est détecté par l’ajout d’un substrat chromogène ABTS peroxydase, ce qui donne un produit final solub.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Polymorphes en 1 étape	Accurate Chemical and Scientific Corporation	AN221725	Isolement des PMN à partir de sang humain.
Plaque de microtitration à 96 puits	Thermo Fisher Scientific	467466
solution tampon ABTS	Sigma-Aldrich Merck	11 204 530 001	Contient du perborate de sodium, de l’acide citrique et de l’hydrogénophosphate disodique.
Comprimés ABTS	Sigma-Aldrich Merck	11 204 521 001  ;	Chaque comprimé contient 5 mg de substrat ABTS et 60 mg de substances véhiculantes.
Couvercle en plastique adhésif, Axygen	Thermo Fisher Scientific	14222348
Anticorps anti-MPO	Sigma-Aldrich Merck	; 07-496-I	Conserver à 2-8 °C stable pendant 1 an. L’espèce hôte est le lapin.
Anticorps anti-NE, clone AHN-10	Sigma-Aldrich Merck	MABS461	Se conserver à 2-8 ° ;C. stable pendant 1 an. L’espèce hôte est la souris.
Albumine sérique bovine	Biomedical Science	BR-220700081	Albumine de la fraction bovine V. Conserver à 2&ndash ; 8 ° ;C. stable depuis 2 ans.
DNase I	New England BioLabs	M0303M	Magasin à -20 ° ; C
IgG, lapin, contrôle des isotypes	GENETEX, Inc.	GTX35035	Conserver sous forme de solution concentrée à 2&ndash ; 8 ° ;C.
IgG1, contrôle de l’isotype de la souris, clone Ci4	Merck  ;	MABC002	Conserver sous forme de solution concentrée à 2&ndash ; 8 ° ;C.
Tube de prélèvement sanguin d’héparine de lithium	Becton Dickinson and Company
Mélangeur de microplaques	En tant que société	NS-P
Lecteur de microplaques	Dispositifs moléculaires	SpectraMax 190  ;	Tout lecteur de microplaques capable de lire les longueurs d’onde de 405&ndash ; 490 nm peut utiliser.
Application de lecteur de microplaques	Dispositifs moléculaires	SoftMax pro
Anticorps anti-ADN conjugué à la peroxydase, Détection de la mort cellulaire ELISA	Roche Diagnostics	1154467500	; Bouteille 2. Magasin à 2&ndash ; 8 ° ;C. stable depuis 1 an.
Phorbol 12-myristate 13-acétate	Sigma-Aldrich Merck	P8139	Activation des PMN à partir du sang humain.
Solution tamponnée phosphate	Takara Bio	T9181	Conserver à température ambiante. Stable pendant 6 mois.
SigmaPlot v14.5	; Systat Software Inc. San Jose, CA, États-Unis
Azoture de sodium	Fujifilm Wako Chemicals	190-14901	Conserver à température ambiante.
t-Octylphénoxypolyéthoxyéthanol, Polyéthylène glycol tert-octylphényléther	Fujifilm Wako Chemicals	9002-93-1	Conserver à température ambiante.

à fond plat