Article de méthode

Étude des interactions entre les enzymes modifiant l’histone et les facteurs de transcription in vivo par transfert d’énergie par résonance de fluorescence

DOI :

10.3791/64656

⸱

14 octobre 2022

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) est une technique d’imagerie permettant de détecter les interactions protéiques dans les cellules vivantes. Ici, un protocole FRET est présenté pour étudier l’association des enzymes modifiant les histones avec des facteurs de transcription qui les recrutent vers les promoteurs cibles de la régulation épigénétique de l’expression génique dans les tissus végétaux.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La régulation épigénétique de l’expression génique est généralement affectée par les enzymes modifiant les histones (HME) qui génèrent des marques d’histones hétérochromatiques ou euchromatiques pour la répression transcriptionnelle ou l’activation, respectivement. Les HME sont recrutés pour leur chromatine cible par des facteurs de transcription (TF). Ainsi, la détection et la caractérisation des interactions directes entre les HME et les TF sont essentielles pour mieux comprendre leur fonction et leur spécificité. Ces études seraient plus pertinentes sur le plan biologique si elles étaient réalisées in vivo dans des tissus vivants. Ici, un protocole est décrit pour visualiser les interactions dans les feuilles des plantes entre une histone déubiquitinase végétale et un facteur de transcription de la plante en utilisant le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET), ce qui permet la détection de complexes entre des molécules de protéines qui se trouvent à moins de <10 nm les unes des autres. Deux variantes de la technique FRET sont présentées : SE-FRET (émission sensibilisée) et AB-FRET (blanchiment accepteur), dans lesquelles l’énergie est transférée non radiativement du donneur à l’accepteur ou émise radiativement par le donneur lors du photoblanchiment de l’accepteur. Les approches SE-FRET et AB-FRET peuvent être facilement adaptées pour découvrir d’autres interactions entre d’autres protéines in planta.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les histone déubiquitinases végétales jouent un rôle important dans le contrôle de l’expression génique par modification post-traductionnelle des histones, notamment en effaçant leurs marques de monoubiquitylation1. Jusqu’à présent, OTLD1 est l’une des rares histone déubiquitinases végétales caractérisées au niveau moléculaire chez Arabidopsis 2,3. OTLD1 élimine les groupes monoubiquitine des molécules d’histones H2B, favorisant ainsi l’élimination ou l’ajout d’acétylation euchromatique et de modifications de méthylation des histones H3 dans le gène cible chromatine 4,5. De plus, OTLD1 interagit avec une autre enzyme modifiant la chromatine, l’histone lysine déméthylase KDM1C, pour affecter la suppression transcriptionnelle des gènes cibles 6,7.

La plupart des enzymes modifiant les histones n’ont pas de capacités de liaison à l’ADN et ne peuvent donc pas reconnaître directement leurs gènes cibles. Une possibilité est qu’ils coopèrent avec les protéines du facteur de transcription liant l’ADN qui lient ces enzymes et les dirigent vers leurs cibles de chromatine. Plus précisément, chez les plantes, plusieurs enzymes importantes modifiant les histones (c.-à-d. les histone méthyltransférases8,9, les histone acétyltransférases 10, les histone déméthylases 11 et les complexes répressifs Polycomb12,13,14) sont connues pour être recrutées par des facteurs de transcription. Conformément à cette idée, récemment, un mécanisme possible pour le recrutement d’OTLD1 chez les promoteurs cibles a été proposé, basé sur des interactions protéine-protéine spécifiques d’OTLD1 avec un facteur de transcription LSH1015.

LSH10 appartient à une famille de protéines végétales ALOG (Arabidopsis LSH1 et Oryza G1) qui fonctionnent comme régulateurs centraux du développement 16,17,18,19,20,21,22. Le fait que les membres de la famille des protéines ALOG contiennent des motifs de liaison à l’ADN23 et présentent les capacités de régulation transcriptionnelle 22, de localisation nucléaire19 et d’homodimérisation24 renforce l’idée que ces protéines, y compris LSH10, peuvent agir comme facteurs de transcription spécifiques lors de la régulation épigénétique de la transcription. L’une des principales techniques expérimentales utilisées pour caractériser l’interaction LSH10-OTLD1 in vivo est le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET)15.

FRET est une technique d’imagerie permettant de détecter directement les interactions à courte distance entre les protéines à <10 nm les unes des autres25 à l’intérieur des cellules vivantes. Il existe deux variantes principales de l’approche FRET26: l’émission sensibilisée (SE-FRET) (figure 1A) et le blanchiment accepteur (AB-FRET) (figure 1B). Dans le SE-FRET, les protéines en interaction - dont l’une est marquée avec un fluorochrome donneur (par exemple, protéine fluorescente verte, GFP) et l’autre avec un fluorochrome accepteur (par exemple, protéine fluorescente rouge monomère, mRFP27,28) - transfèrent non radiativement l’énergie de l’état excité du donneur à l’accepteur. Parce qu’aucun photon n’est émis pendant ce transfert, un signal fluorescent est produit qui a un spectre d’émission radiatif similaire à celui de l’accepteur. Dans l’AB-FRET, les interactions protéiques sont détectées et quantifiées en fonction de l’émission radiative élevée du donneur lorsque l’accepteur est inactivé en permanence par photoblanchiment et est donc incapable de recevoir l’énergie non radiative transférée du donneur (Figure 1). Il est important de noter que l’emplacement subcellulaire de la fluorescence FRET indique la localisation des protéines en interaction dans la cellule.

La capacité de déployer FRET dans les tissus vivants et de déterminer la localisation subcellulaire des protéines en interaction simultanément avec la détection de cette interaction en soi, fait de FRET la technique de choix pour les études et la caractérisation initiale des interactions protéine-protéine in vivo. Une méthodologie d’imagerie par fluorescence in vivo comparable, la complémentarité par fluorescence bimoléculaire (BiFC)29,30,31,32, est une bonne approche alternative, bien que, contrairement au FRET, le BiFC puisse produire des faux positifs en raison de l’assemblage spontané des rapporteurs BiFC autofluorescents 33, et la quantification de ses données est moins précise.

Cet article partage l’expérience réussie dans la mise en œuvre des techniques SE-FRET et AB-FRET et présente un protocole pour leur déploiement afin d’étudier les interactions entre OTLD1 et LSH10 dans les cellules végétales.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicotiana benthamiana, la souche EHA105 d’Agrobacterium tumefaciens ou GV3101 ont été utilisées pour la présente étude.

1. Construction de vecteurs FRET

  1. Sélectionnez des étiquettes fluorescentes pour la paire donneur/accepteur FRET.
    1. Utilisez l’EGFP de pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (voir le tableau des matériaux) pour générer le vecteur donneur.
    2. Utilisez mRFP de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (voir Tableau des matériaux) pour générer le vecteur accepteur.
  2. Générer les constructions FRET donneur/accepteur à l’aide d’une technique de clonage par recombinaison spécifique au site34, telle que le système de clonage par recombinaison Gateway35.
    1. Amplifier les séquences codantes des protéines d’intérêt36 (c.-à-d. Arabidopsis OTLD1 et LSH10)15.
      REMARQUE : C’est aussi une bonne idée d’utiliser un témoin négatif qui représente un homologue de l’une des protéines en interaction, mais qui ne devrait pas présenter d’interaction; l’étude d’interaction OTLD1-LSH10 utilise un homologue de LSH10, LSH4, qui ne reconnaît pas OTLD1. Les ADNc OTLD1, LSH10 et LSH4 sont amplifiés par PCR à l’aide des amorces énumérées dans le tableau 1.
    2. Cloner OTLD1, LSH10 et LSH4 dans le vecteur d’entrée pDONR207 par la technique de clonage par recombinaison spécifique au site 34.
    3. Utilisez la passerelle LR Clonase II (voir le tableau des matériaux) pour transférer LSH10 et LSH4 de pDONR207 dans le vecteur de destination binaire pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 pour générer les constructions donneuses binaires p35S::LSH10-GFP (construction testée) et p35S::LSH4-GFP (contrôle négatif).
    4. Utiliser la même enzyme disponible dans le commerce (étape 1.2.3) pour transférer OTLD1 de pDONR207 dans le vecteur de destination binaire pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 pour générer la construction accepteur binaire p35S:: OTLD1-mRFP (construction testée).
    5. Amplifier par PCR36 mRFP à partir de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 à l’aide des amorces répertoriées dans le Tableau 1, cloner par la technique de clonage par recombinaison dans pDONR207, puis utiliser LR Clonase II pour transférer mRFP dans pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 pour générer la construction de fusion binaire p35S::mRFP-GFP (contrôle positif).
  3. Effectuer la transformation des constructions donneuses et accepteuses en Agrobacterium.
    1. Ajouter 1 μg de chaque plasmide des étapes 1.2.3-1.2.5 à 100 μL de la culture de cellules compétentes de la souche EHA105 ou GV3101 d’Agrobacterium tumefaciens , préparée selon les protocoles standard 37 ou obtenue commercialement, et incuber à37 °C pendant 5 min.
    2. Ajouter 1 mL de milieu LB (1 % de tryptone, 0,5 % d’extrait de levure et 1 % de NaCl; voir le tableau des matières) au mélange cellulaire compétent et agiter à 200 rpm et 28 °C pendant 1,5 h. Recueillir les cellules par centrifugation à 3 000 × g pendant 1 min à température ambiante.
    3. Resuspendre les cellules dans 0,1 mL de milieu LB par pipetage et les étaler sur gélose LB additionnée avec les antibiotiques appropriés (p. ex. spectinomycine à 0,01 % et rifampicine à 0,005 %; voir le tableau des matières). Cultiver à 28 °C pendant 2 jours.
    4. Choisissez des colonies individuelles et inoculez chacune d’elles séparément dans 1 mL de bouillon LB complété par les antibiotiques appropriés.
    5. Cultiver les cellules à 28 °C pendant 24 h et transférer 0,2 mL de la culture dans un nouveau tube. Recueillir les cellules par centrifugation à 10 000 × g pendant 30 s à température ambiante.
    6. Extraire l’ADN plasmidique par un protocole standard pour isoler les plasmides des cellules d’Agrobacterium 38 et remettre en suspension l’ADN extrait dans30 μL d’eau. Pour identifier les colonies hébergeant les plasmides souhaités, utilisez 2 μL de la préparation d’ADN comme modèle pour la PCR avec des amorces spécifiques aux gènes énumérées dans le tableau 1. Mélanger 0,7 mL de la culture identifiée avec 0,3 mL de glycérol et conserver à -80 °C.

2. Agroinfiltration

  1. Cultivez des plantes de Nicotiana benthamiana .
    REMARQUE: Tout au long de l’expérience, toutes les plantes doivent être en bonne santé.
    1. Semez et cultivez des graines de N. benthamiana dans un pot contenant un sol humide à haute densité.
    2. Conserver les graines plantées dans une chambre de croissance réglée à 23 °C avec 16 h de lumière et 8 h de cycle sombre avec une intensité lumineuse de 150-170 μmol/m2s jusqu’à ce que le diamètre de l’euphylle atteigne 0,5 cm.
    3. Transférez les plants dans des pots plus grands et laissez-les pousser dans la même chambre avec les mêmes paramètres.
      REMARQUE: Les plantes sont prêtes pour l’agroinfiltration lorsque leurs plus grandes feuilles ont un diamètre de 5 à 7 cm, généralement dans les 4 à 5 semaines. Dans les petites usines trop jeunes, les effets de l’agroinfiltration seront trop graves pour l’analyse FRET.
  2. Préparer les cellules bactériennes pour l’agroinfiltration.
    1. Cultiver chaque colonie d’Agrobacterium contenant les constructions FRET pendant la nuit dans 5 mL de milieu LB complété par les antibiotiques appropriés (étape 1.3.3) et 150 μM d’acétosyringone à 28 °C (voir le tableau des matières).
    2. Centrifuger les cellules à 3 000 × g pendant 5 min à température ambiante.
    3. Remettre les cellules en suspension dans un tampon agroinfiltration (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 150 μM acétosyringone) à OD600 =0,5.
    4. Combiner les cellules remises en suspension dans un rapport de 1:1 v/v entre les cellules abritant les constructions appropriées (étape 2.2.5).
    5. Pour les agroinfiltrations à double construction, mélanger les aliquotes de deux cultures et, pour les agroinfiltrations à construction unique, mélanger les aliquotes de la même culture:
      1. Protéines testées : OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (bactéries hébergeant les constructions p35S::OTLD1-mRFP et p35S::LSH10-GFP).
      2. Contrôle négatif : OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (bactéries hébergeant les constructions p35S::OTLD1-mRFP et p35S::LSH4-GFP).
      3. Contrôle négatif : LSH10-GFP + mRFP libre (bactéries hébergeant les constructions p35S::LSH10-GFP et pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1).
      4. Contrôle positif : mRFP-GFP (bactéries hébergeant la construction p35S::mRFP-GFP).
    6. Incuber les cellules à 28 °C pendant 0,5-1 h.
  3. Effectuer l’agroinfiltration.
    1. Chargez la culture bactérienne dans une seringue sans aiguille de 1 mL.
    2. Pressez doucement mais fermement la buse de la seringue contre la face abaxiale des feuilles de N. benthamiana complètement dilatées tout en tenant la feuille avec un doigt ganté sur la face adaxiale.
    3. Infiltrer jusqu’à quatre taches sur une feuille, trois feuilles par plante, deux ou trois plantes pour chaque culture bactérienne. Changez de gants entre les échantillons pour éviter la contamination croisée.
    4. Maintenir les plantes agroinfiltrées dans la même chambre de croissance dans les mêmes conditions, telles que décrites à l’étape 2.1.2, pendant 24 h à 36 h. Ne conservez pas les plantes agroinfiltrées plus de 36 h, car cela réduirait le signal de fluorescence.

3. Microscopie confocale

  1. Préparez des lames de microscope pour la visualisation de la fluorescence.
    1. Après 24-36 h de l’infiltration, utiliser une lame de rasoir pour couper chaque feuille agroinfiltrée en petits morceaux (2 mm x 4 mm) entre les nervures.
    2. Placez les morceaux de feuilles sur une lame de verre avec la surface de la feuille abaxiale tournée vers le haut. Placez une goutte d’eau sur les morceaux de feuilles et recouvrez-les avec le verre de couverture. Tapotez légèrement le verre du couvercle pour éliminer les bulles d’air.
    3. Allumez le microscope et le laser (voir Tableau des matériaux). Placez la lame dans le support de la platine du microscope pour l’imagerie sous les paramètres FRET spécifiques (étapes 3.2 et 3.3).
    4. Commencez les observations à l’aide d’une lentille d’objectif 10x pour identifier les cellules qui présentent à la fois les signaux GFP et mRFP, puis utilisez une lentille d’objectif 40x pour les observations détaillées ultérieures.
      REMARQUE : Il est important de noter que SE-FRET et AB-FRET sont généralement effectués sur le même échantillon de tissu, ce qui permet l’utilisation des mêmes réglages de canal (étape 3.2), à l’exception du canal FRET, qui est activé/désactivé pour les observations SE-FRET et AB-FRET, respectivement (étapes 3.2.2.3 et 3.3.1).
  2. Configurez les paramètres pour SE-FRET (Figure 1A).
    1. Ouvrez l’outil Acquisition multidimensionnelle (MDA).
    2. Établir un ensemble de trois canaux confocaux dans le même champ de vision (figure supplémentaire 1).
      1. Réglez le canal donneur (le canal GFP) pour l’excitation et l’émission du fluorochrome donneur avec le laser d’excitation 405 nm et le filtre d’émission 400-597 nm.
      2. Réglez le canal accepteur (le canal mRFP) pour l’excitation et l’émission du fluorochrome accepteur avec le laser d’excitation 561 nm et le filtre d’émission 400-597 nm.
        REMARQUE: Le filtre d’émission pour mRFP a été réglé sur 400-597 nm pour séparer le signal mRFP du signal FRET à 597-617 nm (étape 3.2.2.3) et, par conséquent, réduire l’émission mRFP indépendante du FRET.
      3. Réglez le canal FRET pour l’excitation du donneur et l’émission des fluorochromes accepteurs avec le laser d’excitation 405 nm et le filtre d’émission 597-617 nm.
    3. Réglez l’intensité d’excitation du donneur à un niveau minimum pour observer le FRET tout en évitant le photoblanchiment, réduisant ainsi l’efficacité du SE-FRET.
      REMARQUE: Cette intensité d’excitation est sélectionnée expérimentalement avant d’effectuer la procédure FRET pour éviter le photoblanchiment. Il varie en fonction de l’épaisseur des feuilles, de l’âge et du temps après la surexpression.
    4. Excitez le donneur et recherchez des cellules contenant le signal de fluorescence attendu de l’accepteur.
    5. Sélectionnez la région qui contient le signal de fluorescence d’intérêt.
    6. Acquérir une séquence d’images SE-FRET en appuyant sur le bouton Snap .
      1. Image 10-15 cellules exprimant la construction mRFP-GFP (contrôle positif) en premier; ajustez les paramètres de mise au point, de zoom et de gain intelligent pour effectuer la mise au point sur la zone d’intérêt à capturer (Figure supplémentaire 2).
      2. En utilisant les mêmes paramètres, imagez 10 à 15 cellules, chacune exprimant OTLD1-mRFP, mRFP libre, LSH10-GFP ou LSH4-GFP séparément.
        NOTE: Ces images sont acquises par le plug-in « PixFRET » d’ImageJ (voir Tableau des matériaux), qui a été utilisé pour les analyses de données FRET (étape 3.4.1) pour déterminer les valeurs de bleed-through spectrale (SBT) pour les accepteurs et les donneurs; ces images sont utilisées par le logiciel pour générer les images SE-FRET pour les paires de protéines OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP et LSH10-GFP + mRFP libre (étape 3.2.6.3).
      3. En outre, en utilisant les mêmes paramètres, imagez 10-15 cellules co-exprimant OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP et LSH10-GFP + mRFP libre paires de protéines.
  3. Définissez les paramètres AB-FRET (Figure 1B).
    1. Utilisez les paramètres de canal donneur et accepteur définis pour SE-FRET (étape 3.2.2) mais désactivez le canal FRET.
    2. Définir les paramètres de photoblanchiment de l’accepteur (mRFP) (figure supplémentaire 3).
      1. Assurez-vous que le blanchiment commence après cinq images. Permettre 200 itérations pour chaque zone d’eau de Javel. Maintenez une intensité laser de 100 % à 561 nm.
      2. Maintenir une durée de blanchiment de 45 s. Assurez une vitesse de numérisation de 512 x 512 pixels à 400 Hz.
    3. Dessiner la région de la cellule à blanchir; Par exemple, pour les interactions nucléaires, les régions d’intérêt sont dessinées autour de toute la zone du noyau cellulaire39.
    4. Activez le blanchiment en appuyant sur le bouton Démarrer l’expérience ; l’activation de cette fonction effectuera le photoblanchiment et acquerra la séquence d’images AB-FRET.
  4. Analysez les données FRET.
    1. Pour analyser les données SE-FRET, utiliser le plug-in « PixFRET » du logiciel ImageJ pour générer des images corrigées de l’efficacité SE-FRET après soustraction du SBT40 (étape 3.2.6.2).
    2. Pour analyser les données AB-FRET, calculez %AB-FRET comme le pourcentage d’augmentation des émissions de GFP après photoblanchiment mRFP en utilisant la formule41 suivante : %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, où GFPpost est l’émission de GFP après photoblanchiment mRFP et GFPpre est l’émission de GFP avant photoblanchiment mRFP.
    3. Lors de l’examen des images FRET, faites attention à la localisation subcellulaire du signal FRET.
      REMARQUE : Dans de nombreux cas, ces compartiments cellulaires (p. ex., noyau, chloroplastes, RE, etc.) peuvent être facilement identifiés et, comme avantage supplémentaire de la technique FRET, fournissent des indices importants sur la fonction biologique des protéines en interaction.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La figure 2 illustre les résultats typiques d’une expérience SE-FRET, dans laquelle les noyaux cellulaires ont été enregistrés simultanément dans trois canaux (c.-à-d. GFP du donneur, accepteur mRFP et SE-FRET). Ces données ont été utilisées pour générer des images de l’efficacité SE-FRET codées dans une pseudo-échelle de couleurs. Sur cette échelle, le passage du bleu au rouge correspond à une augmentation de l’efficacité du FRET, une mesure de la proximité protéine-protéine de 0% à 100%. D...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole FRET est simple et facile à reproduire ; Il nécessite également un investissement minimal en fournitures et utilise un équipement standard pour de nombreux laboratoires modernes. Plus précisément, cinq caractéristiques techniques principales distinguent la polyvalence de cette procédure. Tout d’abord, les constructions FRET sont générées à l’aide d’une recombinaison spécifique au site, une approche de clonage facile à utiliser, produisant des résultats précis et permettant de gagner du temps par rapport au c...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le travail dans le laboratoire de V.C. est soutenu par des subventions des NIH (R35GM144059 et R01GM50224), NSF (MCB1913165 et IOS1758046) et BARD (IS-5276-20) à V.C.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acétosyringone (3&prime ;,5&prime ;-Diméthoxy-4&prime ;-hydroxyacétophénone)Sigma-Aldrich#D134406-1G
Bacto AgarBD Biosciences#214010
Bacto tryptonBD Biosciences#211705
Extrait de levure BactoBD Biosciences#212750  ;
Microscope confocal à balayage laser (CLSM)ZeissLSM900Tout CLSM ayant des capacités similaires convient
EHA105VWR104013-310Nous utilisons le stock dans la collection de stock de laboratoire bactérien Citovsky
Gateway BP Clonase II  ;Invitrogen#11789100
Gateway LR Clonase IIInvitrogen#11791020
GV3101VWR104013-296Nous utilisons le stock dans la collection de stock de laboratoire bactérien Citovsky
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
MESSigma-Aldrich#69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich#63068-250G
NaClSigma-Aldrich#S5886-500G
Nicotiana benthamiana grainesHerbalistics PtyRA4 ou LABNous utilisons le stock dans la collection de stock de laboratoire de semences Citovsky
pDONR207Invitrogen#12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  ;N/ARéf. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1N/AGénéré sur la base de la construction pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 (voir réf. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  ;N/AGénéré sur la base de la construction pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1
RifampicineSigma-Aldrich#R7382-5G
SpectinomycineSigma-Aldrich#S4014-5G
Seringues sans aiguillesLogiciel BD309659
Zen pour l’imagerie CLSMZeissZEN 3.0logiciel doit être compatible avec le CLSM utilisé
Version Le

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274(2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56(2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83(2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125(2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39(2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712(2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511(2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S. Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. Hartley, D. A. , IRL Press. 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237(2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Histone Modifying EnzymesTranscription FactorsProtein Protein InteractionFluorescence Resonance EnergySE FRETAB FRETPlant LeavesAgroinfiltrationConfocal MicroscopyImageJ Analysis

Articles connexes