Article de méthode

Chirurgie et tests comportementaux dans le modèle de transposition du neurinome tibial chez le rat

DOI :

10.3791/64659

⸱

6 janvier 2023

 ,  ,  , 
1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Axogen, 3Center for Translational Immunology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit le modèle de transposition du neurinome tibial, qui implique une lésion du nerf tibial avec transposition ultérieure de l’extrémité du nerf proximal vers une position prétibiale ou latérale sous-cutanée. Les tests comportementaux de la douleur du névrome et de l’hyperalgésie plantaire sont quantifiés à l’aide de monofilaments de Von Frey.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La transposition du neurinome tibial (TNT) est un modèle de rat dans lequel l’allodynie au site du névrome (nerf tibial) peut être évaluée indépendamment de l’allodynie à la surface plantaire de la patte postérieure innervée par le nerf sural intact. Ce modèle TNT convient pour tester des thérapies pour la douleur du névrome, telles que la supériorité potentielle de certains traitements chirurgicaux déjà utilisés en clinique, ou pour évaluer de nouveaux médicaments et leur effet sur les deux modalités de la douleur chez le même animal. Dans ce modèle, une lésion distale (névromésie) est réalisée dans le nerf tibial, et l’extrémité du nerf proximal est transposée et fixée par voie sous-cutanée et prétibiale pour permettre des évaluations du site du névrome avec un monofilament de Von Frey de 15 g. Pour évaluer l’allodynie sur le nerf sural, les monofilaments de Von Frey peuvent être utilisés via la méthode haut-bas sur la région latérale plantaire de la patte postérieure. Après avoir coupé le nerf tibial, une hypersensibilité mécanique se développe au site du névrome dans la semaine 1 après la chirurgie et persiste au moins jusqu’à 12 semaines après la chirurgie. L’allodynie à la surface plantaire innervée surale se développe dans les 3 semaines suivant la chirurgie par rapport au membre controlatéral. À 12 semaines, un névrome se forme à l’extrémité proximale du nerf tibial sectionné, indiqué par la dispersion et le tourbillon des axones. Pour la chirurgie modèle TNT, plusieurs étapes (micro)chirurgicales critiques doivent être suivies, et une certaine pratique chirurgicale sous anesthésie terminale est conseillée. Par rapport à d’autres modèles de douleur neuropathique, tels que le modèle de lésion nerveuse épargnée, l’allodynie sur le site du névrome peut être testée indépendamment de l’hypersensibilité du nerf sural dans le modèle TNT. Cependant, le site du névrome ne peut être testé que chez le rat, pas chez la souris. Les conseils et les directives fournis dans ce protocole peuvent aider les groupes de recherche travaillant sur la douleur à mettre en œuvre avec succès le modèle TNT dans leur établissement.

Introduction

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Chaque blessure, allant de simples lacérations à l’amputation d’un membre entier, s’accompagne de divers degrés de lésion des nerfs périphériques. Une telle lésion nerveuse peut entraîner la formation d’un névrome, un enchevêtrement désorganisé de fibres nerveuses en germination. Les névromes deviennent douloureux chez 8% à 30% des patients, affectant gravement leur qualité de vie 1,2,3,4,5. Après l’amputation d’un membre, une douleur de névrome se développe chez 50% des patients 6,7,8. Les symptômes rapportés comprennent la sensibilité, la douleur spontanée, l’allodynie, l’hyperalgésie et l’hypersensibilité mécanique ou thermique dans la zone innervée9. Lorsqu’elle n’est pas traitée adéquatement dans un délai de 1 an, la douleur du névrome peut évoluer vers un état de douleur chronique, entraînant un fardeau sociétal élevé et des coûts médicaux associés 10,11,12,13,14. En raison de la faible efficacité des interventions pharmacologiques actuelles, la douleur du névrome est traitée de préférence par ablation chirurgicale du névrome douloureux, et le nerf traité par diverses techniques chirurgicales, comme décrit dans la littérature15. Il est important de noter que le soulagement complet de la douleur est rare, que la douleur s’aggrave souvent avec le temps et que 40% des patients ne bénéficient pas de la chirurgie, ce qui indique que de nouveaux traitements sontnécessaires1,16.

Un modèle standardisé de la douleur du névrome chez le rat aide à comprendre les mécanismes qui entraînent la douleur du névrome et peut aider à identifier de nouveaux traitements ou à évaluer ceux qui existent déjà utilisés en clinique. Le modèle de transposition du neurinome tibial (TNT) a été décrit pour la première fois par Dorsi et al. en 200817 et a été utilisé par différents groupes de recherche18,19,20. L’objectif global de cette méthode est de pouvoir tester différentes techniques de traitement de la douleur du névrome. L’avantage du modèle par rapport au modèle21, par exemple, de la lésion nerveuse épargnée (SNI) est qu’il permet de tester l’allodynie au site du névrome. En effet, le modèle implique la transposition de la terminaison nerveuse proximale du nerf tibial en une position prétibiale sous-cutanée, où il peut être sondé avec des monofilaments de von Frey. De plus, l’allodynie se développe à la surface plantaire de la patte postérieure innervée par le nerf sural intact, qui peut être évaluée indépendamment de la douleur du névrome chez le même animal. Ceci est similaire aux symptômes de la douleur du névrome chez les patients, où la douleur neuropathique persistante après l’ablation d’un névrome douloureux est parfois causée par les nerfs voisins22. De plus, l’allodynie sur un nerf sectionné avec un névrome est une modalité de douleur différente de l’allodynie sur le nerf voisin intact. Ainsi, ce modèle facilite l’évaluation de l’effet des nouvelles thérapies à la fois sur l’allodynie présente au site du névrome et sur la douleur neuropathique plus répandue testée dans la surface plantaire de la patte postérieure. Comme la chirurgie effectuée pour créer le modèle TNT peut être difficile, cet article explique la procédure à suivre pour aider les chercheurs à mettre en œuvre le modèle dans leur établissement.

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Protocole

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Cette recherche a été réalisée conformément à l’IVD (Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) et aux lignes directrices pour la recherche animale, numéro de projet AVD1150020198824.

1. Mesures de référence de Von Frey

  1. Avant la chirurgie, effectuer des mesures de base selon la procédure de test de Von Frey, décrite ci-dessous dans les sections 5 et 6.

2. Anesthésie et préparation

REMARQUE : Cette étude a été menée sur 15 rats Sprague Dawley mâles âgés de 12 semaines.

  1. Anesthésier les animaux par induction avec 5% d’isoflurane et maintenir l’anesthésie avec 2% à 3% d’isoflurane.
    REMARQUE: L’entretien avec 2% d’isoflurane entraîne généralement une anesthésie suffisante et une respiration spontanée, sans nécessiter d’intubation trachéale ou de ventilation mécanique.
  2. Vérifiez les réflexes des animaux en pinçant le pied avec une pince à épiler. Assurez-vous que l’animal ne répond pas avant de continuer. Rasez le champ opératoire du genou à la cheville avec un rasoir électrique et appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse. Injecter 0,5 mg / kg de carprofène analgésique par voie sous-cutanée dans la région abdominale.
  3. Placez le rat anesthésié sur son dos, la tête à gauche ou à droite et la jambe à opérer près du chirurgien. Exorotez le membre postérieur inférieur de manière à ce que la malléole médiale soit orientée vers le haut. Placez le rat sous un microscope chirurgical stéréoscopique avec un grossissement 6x.
  4. Désinfectez la zone rasée avec trois cycles alternés de gommage à base d’iode suivis d’alcool. Placez une feuille stérile avec un trou opératoire sur la jambe, de sorte que seul le champ opératoire soit visible. Assurez-vous de maintenir ces conditions stériles pendant la chirurgie.

3. Chirurgie

  1. Placez un petit coton-tige sous la cheville afin de maintenir le champ opératoire horizontal. Localisez le genou et faites doucement une incision longitudinale de 1-2 cm à l’aide d’un scalpel sur le côté médial de la patte postérieure du milieu du mollet à la cheville. Si nécessaire, ouvrez davantage la peau et la sous-cutane avec des micro-ciseaux jusqu’à ce que les couches musculaires soient visibles.
  2. Identifiez le faisceau neurovasculaire superficiel comme deux ou trois blancs et une ligne violette / rouge plus épaisse, parfois avec des branches mineures, qui peuvent se déplacer librement sur les couches musculaires. À l’aide d’une électrocautérisation (voir tableau des matières), coaguler tout saignement actif ou suintement dans le champ opératoire. Veillez à ne pas endommager le faisceau neurovasculaire.
  3. Disséquer carrément pour ouvrir le fascia entre les muscles gastrocnémiens, juste postérieur au faisceau neurovasculaire superficiel de 3,2. Entre le fascia des muscles, le nerf tibial peut être trouvé. Le nerf tibial est environ trois fois plus grand que le nerf superficiel dans le faisceau neurovasculaire. Utilisez l’os tibial comme repère supplémentaire (le nerf tibial se trouve juste en arrière de l’os tibial).
  4. Identifier le nerf tibial et sa bifurcation.
    REMARQUE: La bifurcation est généralement visible avec une ligne plus claire longitudinalement sur le nerf.
  5. Disséquez soigneusement le nerf tibial libre des faisceaux vasculaires environnants. Effectuez la dissection en déplaçant carrément le nerf tibial et en coupant le tissu exposé qui montre un certain étirement tout en déplaçant le nerf tibial.
    REMARQUE: Si le nerf tibial est attaché à des veines croisées après la dissection, ces veines peuvent être coagulées afin d’exposer tout le nerf tibial. Veillez à ne pas coaguler le faisceau tibial lui-même.
  6. Exposez le nerf tibial à proximité jusqu’à ce qu’il disparaisse sous une couche musculaire transversale. À ce stade, le nerf tibial semble plonger plus profondément dans la patte postérieure vers le genou. Exposez le nerf tibial distalement jusqu’à la cheville.
    REMARQUE: Lorsque le nerf tibial est exposé plus distalement, la quantité de fibres de collagène traversant (c’est-à-dire les fibres perpendiculaires à la direction des fibres nerveuses) augmentera. Ces fibres de collagène doivent être coupées pour permettre une longueur suffisante pour la transposition du nerf tibial.
    1. Lorsque tout le nerf tibial est exposé, placez les couches musculaires en arrière pour éviter la déshydratation du nerf. Si le nerf se déshydrate (c’est-à-dire qu’il devient plus raide, terne et ridé) et qu’il ne suffit pas de le recouvrir de couches musculaires, ajoutez des gouttes de solution saline pour l’hydrater.
  7. À l’aide d’un outil de microchirurgie contondant, de préférence un porte-aiguille, disséquez la peau prétibiale de la couche musculaire sous-cutanée afin de créer un tunnel sous-cutané. Pour ce faire, tenez la peau vers le haut et poussez la pointe émoussée dans le tissu, parallèlement à la peau. Assurez-vous que l’extrémité du tunnel est située de manière prétibiale ou plus latérale pour assurer un accès facile à la zone pour le test du névrome.
  8. Augmenter l’isoflurane à 5%. Retournez au nerf tibial et exposez-le (c.-à-d. retournez à l’endroit décrit à l’étape 3.6). Coupez le nerf tibial (c.-à-d. les deux branches plantaires) au niveau le plus distal près de la cheville. Diminuer l’isoflurane au niveau normal de 2% à 3%.
  9. Réglez le grossissement du microscope sur 10x ou 16x. Identifier l’épineurium du nerf tibial proximal à la coupe effectuée à l’étape 3.8, ou en cas de bifurcation plus proximale du nerf tibial, identifier l’épineurium des branches plantaires médiale et latérale proximale à la coupe à l’étape 3.8.
    REMARQUE: L’épineurium est plus blanc et plus ferme par rapport aux fibres nerveuses à l’intérieur, qui sont plus jaunes et molles.
  10. Placez soigneusement un 8-0 suture en nylon (voir le tableau des matériaux) à travers l’épineurium de l’extrémité du nerf proximal en tenant soigneusement l’épineurium avec une pince à épiler et en plaçant l’aiguille entre le nerf et l’épineurium avec une morsure d’environ 0,5 mm. Tirez la suture à travers et prenez une bouchée avec l’aiguille par voie sous-cutanée au bout du tunnel sous-cutané effectué à l’étape 3.7. Faites un nœud, qui transposera le nerf latéralement dans le tunnel sous-cutané.
    NOTE: Si les deux branches plantaires partagent un épineurium commun, une suture devrait suffire. Si les deux branches plantaires ont leur propre épineurium, chaque épineurium doit être fixé individuellement. Évitez de placer la suture à travers la peau; Ne le fixez que par voie sous-cutanée.
  11. Placez une suture plus épaisse avec une couleur foncée (de préférence une suture bleue ou noire 4-0) affleurant l’extrémité nerveuse fixée, sans pénétrer la peau. Assurez-vous que la suture est visible de l’extérieur de la peau. Vérifiez si le nerf reste en place après avoir déplacé la patte et les muscles. Couper les extrémités de suture avec une extrémité de suture légèrement plus longue sur le 4-0 que sur le 8-0 suture.
  12. Réglez le grossissement du microscope à 6x. Fermez la peau avec des sutures intraépidermiques à l’aide du 8-0 suturer et nettoyer délicatement la peau avec 0,9% de NaCl à l’aide d’un coton-tige.

4. Traitement post-chirurgical

  1. Placez le rat dans une cage propre sous une serviette en papier dans une position confortable. Si la pièce est froide, placez un coussin chauffant sous une partie de la cage (seulement sous une partie de la cage, car l’animal devrait pouvoir échapper à la chaleur en cas de besoin). Assurez un accès facile à la nourriture et à l’eau.
  2. Ne laissez pas le rat post-chirurgical sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment conscience pour maintenir une position couchée sternale. Le rat peut être retourné en compagnie d’autres animaux lorsqu’il est complètement rétabli de l’anesthésie après la chirurgie. C’est généralement après 1 h et lorsque le rat présente son schéma de marche et son comportement normaux.
  3. À 24 h et 48 h après la chirurgie, administrer une dose de 0,5 mg/kg de carprofène par voie sous-cutanée (région abdominale) pour traiter la douleur post-chirurgicale.

5. Test de von Frey de la face plantaire des pattes postérieures

REMARQUE: Le test de Von Frey (étapes 5 et 6) est effectué avant la chirurgie (pour la mesure de base) et à partir de 3 jours après la chirurgie.

  1. Placez les rats dans des cages à fond grillagé 1 semaine avant la mesure de base, ou 2 semaines avant la chirurgie, pour assurer l’acclimatation à l’environnement d’essai.
  2. Commencez par des mesures de base au moins 1 semaine avant la chirurgie. Assurez-vous que trois mesures de référence indépendantes sont effectuées à des jours différents.
  3. Vérifiez que les rats sont calmes dans les cages inférieures grillagées en maille. Appliquer une série de monofilaments de Von Frey avec une échelle logarithmique perpendiculaire à la surface plantaire de la patte postérieure.
    1. Afin de stimuler le nerf sural (hypersensibilité), appliquez le monofilament sur le côté latéral près de la bordure du cheveu. Évitez de toucher les repose-pieds car ils sont plus sensibles.
    2. Pour stimuler le nerf tibial (hyposensibilité), appliquez le monofilament au milieu de la surface plantaire de la patte postérieure. Si le monofilament est appliqué dans la zone la plus médiale, cela pourrait également stimuler le nerf saphène, une branche du nerf fémoral (Figure 1). Évitez de toucher les repose-pieds.
  4. Commencez par le monofilament de 4 g. Appliquez une force suffisante sur le monofilament pour que les poils se plient et tiennent pendant 3 s, puis vérifiez les réponses de l’animal sur le monofilament. Une réponse positive est un retrait soudain de la patte, un tressaillement soudain, un léchage soudain des pattes ou une vocalisation. Dans certains cas, le rat se déplace et tente de trouver/attaquer le monofilament.
  5. Choisissez le monofilament suivant en fonction de la réponse au stimulus via la méthode haut-bas23. Par exemple, si le rat répond, stimulez ensuite avec le monofilament de 2 g; Si le rat ne répond pas, stimulez avec le monofilament de 6 g, et ainsi de suite. Au total, appliquez 5 à 10 stimuli en fonction de la réaction.

6. Test de von Frey du site du névrome

  1. Manipulez les animaux quotidiennement pendant au moins 5 à 7 jours avant les mesures de base ou 2 semaines avant la chirurgie. Assurez-vous que les animaux sont tenus comme décrit à l’étape 6.2, afin qu’ils soient à l’aise avec la position.
  2. Tenez les rats avec leur nez pointé vers le pli du coude. Si le rat est tenu dans la main droite, sa patte postérieure gauche doit pendre librement entre le pouce droit et l’index (premier espace Web). Si le rat est tenu dans la main gauche, sa patte postérieure droite doit pendre librement entre le pouce gauche et l’index.
  3. Commencez par des mesures de base au moins 1 semaine avant la chirurgie. Assurez-vous que trois mesures de référence indépendantes sont effectuées à des jours différents.
  4. Vérifiez que les rats sont calmes et confortables lorsqu’ils sont tenus. Au départ, placer doucement le monofilament de 15 g sur la surface prétibiale de la patte postérieure exposée. Après la chirurgie, placez le monofilament de 15 g sur la suture visible (par exemple, à l’emplacement du névrome). Appliquez une force suffisante sur le monofilament pour que les cheveux se plient et tiennent pendant 1 s.
    1. Enregistrez la réaction à chaque stimulus. Les options de réaction comprennent l’absence de réaction, le retrait lent, le retrait rapide et la vocalisation. Notez la réponse comme 0 point pour l’absence de réaction et un point pour le retrait lent, le retrait rapide ou la vocalisation.
  5. Répéter cinq groupes de cinq applications du monofilament, avec 2-3 s entre chaque application et 2-3 min ou plus entre les cinq clusters. Au total, chaque patte postérieure devrait avoir 25 applications du monofilament avec des réponses enregistrées.

7. Récupération d’échantillons pour l’histologie et la préparation

NOTE: L’examen histologique est effectué 12 semaines après la chirurgie initiale.

  1. Induire l’anesthésie et préparer les animaux comme décrit aux étapes 2.2, 2.3 et 2.4.
  2. Faites doucement une incision de 2-3 cm à l’aide d’un scalpel sur la cicatrice qui a été faite par la chirurgie initiale, mais veillez à ne pas couper trop profondément car le nerf est placé superficiellement.
  3. Déterminez la position du névrome, disséquez soigneusement le névrome et le nerf exempt de tissu cicatriciel environnant et placez le névrome récolté dans un fixateur. Pour évaluer la morphologie du névrome, le tissu est de préférence incorporé longitudinalement dans de la résine de paraffine ou d’époxy comme décrit par Tork et al.18.
  4. Après avoir récolté le tissu, euthanasier les rats sous anesthésie terminale (isoflurane à 5 %) par ponction cardiaque ou décapitation.
    REMARQUE: Il est conseillé de récolter d’abord le névrome avant de tuer les rats, car il est alors plus facile de distinguer le névrome de son tissu environnant in vivo.

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Résultats

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L’évaluation au site du névrome a montré une sensibilité accrue à l’application du monofilament de von Frey de 15 g. Au départ, les rats répondaient généralement à 10 % à 15 % (± 13 %) des 25 applications d’un monofilament de 15 g. Le taux de réponse est passé à 45%-50% (± 24%) 1 semaine après la chirurgie TNT. Du côté controlatéral, le nombre de réponses après la chirurgie était similaire à celui des valeurs initiales (figure 2A). Environ 20% des rats n’ont pas développé de névrome douloure...

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Discussion

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Étapes critiques du protocole
Le modèle TNT consiste à couper le nerf tibial et à le transposer latéralement et sous-cutanéement à un emplacement prétibial pour permettre un test de sensibilité du névrome, en plus de l’hyperalgésie plantaire sur le nerf sural. Dans le modèle TNT, il est essentiel que la place du névrome soit visible pour les chercheurs. Par conséquent, une souche de rat albinos est préférée car les sutures sous-cutanées sont facilement visibles à travers la peau et la couleur de la su...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts. Bien que ces travaux de recherche aient été en partie financés par Axogen, la société n’a eu aucune influence sur l’exécution de l’étude et sur les résultats.

Remerciements

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Nous tenons à remercier Sabine Versteeg pour son aide lors de la microchirurgie et Anja van der Sar et Trudy Oosterveld-Romijn du Common Animal Laboratory (Gemeenschappelijk Dieren Laboratorium) pour leur aide dans la préparation du microscope et de la salle d’opération et dans la prise en charge des animaux.

Cette recherche a été financée par Axogen.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AesthesioLinton Instrumentation514007 jusqu’à 5140150,6 g jusqu’à 15 g monofilaments
CarprofènePharmacie vétérinaire localen/aLa pharmacie vétérinaire locale fabrique des écouvillons de dilution de caprofène
Cotons-tigesNobamed974255
ÉlectrocautérisationOutils de sciences fines18010-00
Éthanol 70 %Interchema BV
Ethilon 4.0Johnson & Johnson1854GIMPORTANT : la couleur doit être bleue ou noire
Ethilon 8.0Johnson & JohnsonBV130-5
Isoflo, isoflurane ZoetisDechra Produits vétérinairesB506
Cages à fond grillagéStoeltingCo57816 et 57824
Micro-pincesOutils de science fine11251-35
Porte-micro-aiguilles  ;Fine Science Tools12076-12
Micro ciseauxFine Science Tools15019-10
Micro pince à épilerFine Science Tools11254-20
NaCl 0.9 %TrademedH7 1000-FRE
Porte-aiguilleFine Science Tools12004-16
Pommade ophtalmique  ;Pharmacie vétérinaire localen/aLa pharmacie vétérinaire locale fabrique la pommade ophtalmique
ScalpelFine Science Tools10003-12
CiseauxFine Science Tools14001-12
Microscope chirurgical stéréoLeicaA60 F
Feuille stérile avec trouEvercare OneMed1555-01
Lame chirurgicale nr.15Outils de science fine10015-00
Pince à épilerOutils de science fine11617-12
400406

Références

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