Method Article

Plateforme de puces microfluidiques cliniques pour l’isolement de cellules tumorales circulantes polyvalentes

DOI:

10.3791/64674

⸱

October 13th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Microelectronics and Data Science, Anhui University of Technology, 2Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Normal University, 3School of Chemistry and Chemical Engineering, Anhui University of Technology, 4Department of Medical Oncology, Changzheng Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La puce microfluidique clinique est une technique d’analyse biomédicale importante qui simplifie le prétraitement des échantillons de sang cliniques des patients et colore immunofluorement les cellules tumorales circulantes (CTC) in situ sur la puce, permettant la détection et l’identification rapides d’un seul CTC.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont importantes dans le pronostic du cancer, le diagnostic et le traitement anticancéreux. Le dénombrement des CTC est essentiel pour déterminer la maladie du patient, car les CTC sont rares et hétérogènes. Les CTC sont détachés de la tumeur primaire, pénètrent dans le système de circulation sanguine et se développent potentiellement à des sites distants, métastasant ainsi la tumeur. Étant donné que les CTC portent des informations similaires à celles de la tumeur primaire, l’isolement des CTC et la caractérisation ultérieure peuvent être essentiels dans la surveillance et le diagnostic du cancer. Le dénombrement, la modification de l’affinité et la coloration par immunofluorescence clinique des CTC rares sont des méthodes puissantes pour l’isolement des CTC, car elles fournissent les éléments nécessaires avec une sensibilité élevée. Les puces microfluidiques offrent une méthode de biopsie liquide exempte de toute douleur pour les patients. Dans ce travail, nous présentons une liste de protocoles pour les puces microfluidiques cliniques, une plate-forme polyvalente d’isolation CTC, qui intègre un ensemble de fonctionnalités et de services nécessaires à la séparation, à l’analyse et au diagnostic précoce des CTC, facilitant ainsi l’analyse biomoléculaire et le traitement du cancer. Le programme comprend le comptage des cellules tumorales rares, le prétraitement clinique du sang des patients, qui comprend la lyse des globules rouges, ainsi que l’isolement et la reconnaissance des CTC in situ sur des puces microfluidiques. Le programme permet le dénombrement précis des cellules tumorales ou CTC. De plus, le programme comprend un outil qui intègre l’isolation CTC avec des puces microfluidiques polyvalentes et l’identification par immunofluorescence in situ sur les puces, suivie d’une analyse biomoléculaire.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont importantes dans le pronostic du cancer, le diagnostic et le traitement anticancéreux. Le dénombrement des CTC est essentiel car les CTC sont rares et hétérogènes. Le dénombrement, la modification de l’affinité et la coloration clinique par immunofluorescence des CTC rares sont des techniques puissantes pour l’isolement des CTC car elles offrent les éléments nécessaires avec une sensibilité élevée1. Un nombre rare de cellules tumorales mélangées à du sang normal imite étroitement le sang réel des patients, car 2 à 3 ml de sang réel de patient ne contiennent que 1 à 10 CTC. Pour résoudre un problème expérimental critique, au lieu d’utiliser un grand nombre de cellules tumorales introduites dans le PBS ou mélangées avec du sang normal, l’utilisation d’un nombre rare de cellules tumorales nous fournit un faible nombre de cellules sanguines, ce qui est plus proche de la réalité lors de la réalisation d’une expérience.

Le cancer est la première cause de décès dans le monde2. Les CTC sont des cellules tumorales excrétées de la tumeur d’origine qui circulent dans les systèmes de circulation sanguine et lymphatique3. Lorsque les CTC se déplacent vers un nouvel environnement de survie, ils se développent comme une deuxième tumeur. C’est ce qu’on appelle la métastase et elle est responsable de 90% des décès chez les patients cancéreux4. Les CTC sont essentiels pour le pronostic, le diagnostic précoce et la compréhension des mécanismes du cancer. Cependant, les CTC sont extrêmement rares et hétérogènes dans le sang des patients 5,6.

Les puces microfluidiques offrent une biopsie liquide qui n’envahit pas la tumeur. Ils ont l’avantage d’être portables, peu coûteux et d’avoir une balance adaptée aux cellules. L’isolement des CTC à l’aide de puces microfluidiques est classé principalement en deux types: basé sur l’affinité, qui repose sur la liaison antigène-anticorps 7,8,9 et est la méthode originale et la plus largement utilisée d’isolement CTC; et les puces physiques, qui utilisent les différences de taille et de déformabilité entre les cellules tumorales et les cellules sanguines 10,11,12,13,14,15, sont sans marquage et faciles à utiliser. L’avantage des puces microfluidiques par rapport aux techniques alternatives est que l’approche physique des microfiltres à grosses ellipses capture fermement les CTC avec une efficacité de capture élevée. La raison en est que les micropoteaux d’ellipse sont organisés en minces tunnels d’espaces ligne-ligne. Les écarts de ligne de ligne sont différents des écarts de point de point traditionnels formés par des micropoteaux tels que les micropoteaux de losange. La capture de CTC basée sur des puces à ondes combine à la fois une isolation basée sur les propriétés physiques et une isolation basée sur l’affinité. La capture par puce à ondes implique 30 réseaux en forme d’onde avec l’anticorps anti-EpCAM recouvert de micropoteaux circulaires. Les CTC sont capturés par les petits espaces, et les grands écarts sont utilisés pour accélérer le débit. Les CTC manqués doivent passer les petits espaces dans la matrice suivante et sont capturés par l’isolation basée sur l’affinité intégrée à l’intérieur de la puce16.

L’objectif du protocole est de démontrer le comptage d’un nombre rare de cellules tumorales et l’analyse clinique des CTC avec des puces microfluidiques. Le protocole décrit les étapes d’isolement CTC, comment obtenir un faible nombre de cellules tumorales, la séparation physique clinique des filtres à petites ellipses et des filtres à grandes ellipses et des filtres trapézoïdaux, la modification de l’affinité et l’enrichissement17.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les échantillons de sang des patients ont été fournis par l’hôpital Longhua affilié à l’Université médicale de Shanghai.Le protocole suit les directives du comité d’éthique de la recherche humaine du troisième hôpital de l’Université de Pékin. Le consentement éclairé des patients a été obtenu pour l’utilisation des échantillons à des fins de recherche.

1. Pré-expérience pour vérifier l’efficacité de la capture avec des cellules tumorales en culture

  1. Culture des cellules tumorales MCF-7, MDA-MB-231 et HeLa pour déterminer l’efficacité de capture. Diluer la suspension de cellules tumorales, compter le nombre de cellules tumorales et répéter jusqu’à ce que le nombre souhaité de cellules dans 1 mL de PBS soit obtenu.
    1. Culture des cellules dans un flacon de culture cellulaire avec un nombre de cellules de départ de ~ 1 x 105 cellules dans 1 mL de milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine. Incuber dans une atmosphère humidifiée à 37 °C avec une atmosphère de 5% de CO2 .
    2. Lorsque les lignées cellulaires se développent sous forme de monocouches adhérentes à 95% de confluence, détachez-les des boîtes de culture avec une solution de trypsine à 0,25% pendant 2 minutes, comme décrit dans Chen et al.16.
    3. Colorer les cellules tumorales avec de la calcéine AM. Mettez 3 μL de calcéine AM dans le plat de culture et conservez le plat dans l’incubateur pendant 30 min. Ensuite, digérez toutes les cellules avec de la trypsine.
    4. Compter les cellules tumorales cultivées dans le PBS avec une chambre de comptage cellulaire et diluer jusqu’à ce que 100 cellules tumorales par 1 mL de PBS soient obtenues.
      REMARQUE: Afin de dénombrer avec précision le nombre de cellules, prenez 50 μL de la suspension cellulaire obtenue pour voir si le nombre de cellules tumorales qu’elle contient est de cinq ou non avec un microscope. Décider du volume de suspension cellulaire à prendre pour obtenir 100 cellules tumorales en fonction du nombre réel de cellules tumorales dans 50 μL de suspension cellulaire.
  2. Introduire la suspension cellulaire contenant 100 cellules tumorales par 1 mL de PBS dans la puce microfluidique à l’aide d’une seringue avec une pompe à seringue à des débits variés de 0,5 mL/h, 1 mL/h, 2 mL/h, 3 mL/h, 4 mL/h et 5 mL/h. Obtenir l’efficacité de capture pour les différents débits et déterminer le débit optimal.
    1. Comptez le nombre de cellules tumorales capturées sur la puce et sortant de la sortie. Calculez l’efficacité de capture comme ci-dessous :
      Efficacité de capture = Nombre de cellules capturées/(Nombre de cellules capturées + nombre de cellules sortantes) × 100 %
    2. Répétez pour obtenir l’efficacité de capture pour différents nombres de cellules tumorales de 10 à 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
  3. Tester et valider la puce microfluidique pour un nombre rare de cellules tumorales. Injectez ces 10 suspensions d’échantillons dans les puces microfluidiques à l’aide d’une aiguille creuse fabriquée avec un extracteur de micropipette pour aspirer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10 cellules tumorales diluées dans 1 mL de PBS. Détecter et énumérer le nombre de cellules tumorales pour chaque échantillon après leur capture sur la puce.
    REMARQUE: L’aiguille creuse mesure environ 3 cm de long avec un diamètre externe de 1 mm.
  4. Effectuer des tests cliniques pré-expérimentaux pour les cellules tumorales enrichies dans des échantillons de sang normaux.
    1. Colorer les cellules tumorales avec de la calcéine AM, puis énumérer 100 cellules tumorales dans 5 μL de PBS. Ajoutez ces cellules à 1 mL d’échantillons de sang entier normal. Introduisez ces cellules dans la puce et énumérez le nombre de cellules tumorales capturées sur la puce avec une immunofluorescence verte. Effectuer un dénombrement in vivo sur la puce comme décrit ci-dessus et calculer l’efficacité de capture après la capture.
    2. Répétez l’étape 1.4.1 pour neuf concentrations supplémentaires de nombre de cellules tumorales de 10 à 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
    3. Énumérer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10 cellules tumorales comme décrit à l’étape 1.3 sans coloration, augmenter dans 1 mL de sang total normal, introduire ces échantillons dans la puce microfluidique et capturer les cellules tumorales sur la puce.
    4. Coloration sur la puce avec Hoechst, CK-FITC et CD45-PE. Mettez 3-5 μL de colorant fluorescent dans 20-30 μL de PBS, puis introduisez cette solution sur la puce microfluidique avec une seringue. Énumérer le nombre de cellules tumorales capturées sur la puce avec une immunofluorescence bleue et verte pour déterminer l’efficacité de capture.
  5. Effectuer une modification de la puce microfluidique pour la capture basée sur l’affinité de l’anti-EpCAM.
    REMARQUE : Étant donné que la puce d’onde combine à la fois une isolation basée sur l’affinité et une isolation basée sur les propriétés physiques, modifiez la puce avec des agents.
    1. Modifier la surface de la puce avec 100 μL de triméthoxysilane 3-mercaptopropylique à 4 % (v/v) dans de l’éthanol à température ambiante pendant 45 min. Introduisez cette solution dans la puce avec précaution et lentement au cas où elle détruirait la structure interne de la puce, en particulier le collage de la surface supérieure et du verre du substrat.
      REMARQUE: La surface de la puce est modifiée à l’aide de mercaptosilane. Les interactions qui se produisent sur la puce sont déterminées par des liaisons chimiques. Des liaisons chimiques sont établies pour réaliser la liaison de l’anticorps modifié avec l’antigène. Divers réactifs sont modifiés à l’intérieur de la puce pour établir des liaisons chimiques qui se connectent les unes aux autres. Le dernier réactif à être modifié est une molécule d’adhésion anti-épithéliale (anti-EpCAM). L’antigène de surface des cellules tumorales de l’EpCAM se combine avec l’anti-EpCAM à l’intérieur de la puce pour réaliser la capture des CTC.
    2. Laver à l’éthanol 3x. Ajouter 100 μL de l’agent de couplage N-y-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS, 1 μM) sur la puce et laisser interagir pendant 30 min.
    3. Laver avec PBS 3x. Utilisez une seringue pour introduire 1 mL de PBS sur la puce à laver.
    4. Traiter la puce avec 30-40 μL de 10 μg/mL de Neutravidine à température ambiante pendant 30 min, conduisant à l’immobilisation des cellules sur le GMBS, puis rincer avec du PBS pour éliminer l’excès d’avidine.
    5. Modifier la puce avec 3 μL d’anticorps EpCAM anti-biotinylés à une concentration de 10 μg/mL dans 100 μL de PBS avec 1 % (p/v) de BSA. Gardez ceci toute la nuit.

2. Expérience clinique sur la puce pour énumérer les cellules tumorales circulantes (CTC)

  1. Prétraiter les échantillons de sang cliniques de patients atteints de cancer à l’aide d’une solution de lyse des globules rouges (RBCL) ou introduire 2 à 3 mL de l’échantillon de sang directement sur la puce microfluidique à l’aide d’une seringue.
    1. Effectuez le prétraitement, qui prend environ 30 min. Prélever des échantillons de sang total dans des tubes anticoagulants. Ajouter 6 à 9 mL de solution de lyse RBS dans 2 à 3 mL de sang. Centrifuger à 111 x g pendant 5-8 min à température ambiante et jeter la couche supérieure de liquide clair rouge.
  2. Capturez, colorez, reconnaissez et énumérez les cellules de la puce comme décrit ci-dessous.
    1. Capturez les cellules de la puce comme décrit à l’étape 1.Colorez la puce pour les CTC capturés à l’aide de Hoechst, CK-FITC et CD45-PE. CK-FITC est une coloration spécifique pour les cellules tumorales, et CD45-PE est pour les globules blancs.
    2. Ajouter 3 μL de CK-FITC à 20 μL de PBS. Introduisez-le dans la seringue et pompez le CK-FITC dilué sur la puce. Laisser tacher pendant 30 min. Introduisez 300 μL de PBS sur la puce pour laver la puce.
    3. Ajouter 3 μL de CD45-PE à 20 μL de PBS. Introduisez-le dans la seringue et pompez le CD45-PE dilué sur la puce. Laisser reposer pendant 30 min. Introduisez 300 μL de PBS sur la puce pour laver la puce.
    4. Identifier les CTC à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée à un grossissement de 20x ou 40x. Les CTC émettent à la fois une fluorescence bleue et verte, et les globules blancs (GB) émettent à la fois une fluorescence bleue et rouge. Identifier les CTC avec fluorescence bleue et verte et les globules blancs avec fluorescence bleue et rouge.
    5. À partir des images d’immunofluorescence, énumérez le nombre de CTC capturés sur la puce. Énumérez les CTC comme Hoechst+/CK-FITC+/CD45− et les WBC comme Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
  3. Enrichir les CTC capturés en rinçant avec du PBS à travers la seringue dans le sens inverse sur la puce microfluidique pour recueillir les CTC capturés sur la puce à partir de l’entrée. Utilisez une seringue contenant 1 mL de PBS, introduisez-la à partir de la prise pour enrichir les CTC capturés sur la puce en 2-3 minutes, et récupérez-les à l’entrée. Utilisez 1 mL de PBS pour chaque étape de lavage et répétez 3x.
  4. Colorer les cellules tumorales ou CTC capturés sur la puce microfluidique comme décrit ci-dessous.
    1. Coloration à l’aide de calcéine AM. Ajouter 5 μL de calcéine AM à 20 μL de PBS, colorer les cellules pendant 30 min, puis centrifuger à 111 x g pendant 2 min à température ambiante pour obtenir des cellules tumorales, et suspendre dans 1 mL de PBS.
    2. Pour identifier les noyaux cellulaires, ajouter 20 μL de solution DAPI (10 μL de réactif DAPI dans 20 μL de PBS) à la puce au débit optimal de 1 mL/h pour les microfiltres à grosses ellipses et de 1,5 mL/h pour les microfiltres trapézoïdaux. Passez à travers 20 μL de solution mère d’anti-cytokératine (3 μL d’anticorps anti-cytokératine dans 20 μL de PBS) pour réagir avec la puce pendant 30 min.
    3. Tachez les WBC capturés sur la puce. Une fois les CTC capturés sur la puce, ajoutez 25 μL de solution d’anticorps anti-CD45 (5 μL de solution anti-CD45 dans 20 μL de PBS) à la puce et laissez colorer pendant 30 minutes. Laver avec du PBS et identifier les cellules épithéliales avec une fluorescence bleue et verte.
  5. Effectuer l’identification par immunofluorescence par microscopie à fluorescence comme décrit ci-dessous.
    1. Utilisez un microscope à fluorescence et excitez l’échantillon avec le laser bleu. Trouvez les cellules émettant une fluorescence bleue, qui sont des cellules nucléées. Utilisez l’un des grossissements suivants : 10x, 20x ou 40x. Trouvez un champ clair pour la cellule tumorale. Pour la source laser bleue, utilisez une longueur d’onde de plaque d’excitation de 420-485 nm et une longueur d’onde de plaque d’émission de 515 nm.
    2. Sans déplacer les échantillons, utilisez une autre source laser. Faites pivoter le microscope à fluorescence et excitez l’échantillon avec le laser vert. Trouvez les cellules émettant une fluorescence verte, ce qui indique des cellules tumorales. Prenez des images du même champ avec le même grossissement avec cette source laser verte. Les cellules qui émettent à la fois une fluorescence bleue et verte sont reconnues comme des cellules tumorales. Pour la source laser verte, utilisez une longueur d’onde de plaque d’excitation de 460-550 nm et une longueur d’onde de plaque d’émission de 590 nm
    3. Sans déplacer les échantillons, utilisez une autre source laser. Faites pivoter le microscope à fluorescence et excitez l’échantillon avec le laser rouge. Trouvez les cellules émettant une fluorescence rouge. Prenez des images du même champ avec le même grossissement avec cette source laser rouge. Les cellules qui émettent à la fois une fluorescence bleue et rouge sont reconnues comme des globules blancs.
    4. Enregistrez l’image obtenue en utilisant chacune des sources laser ci-dessus. Prenez plusieurs images du même champ avec des lumières de couleurs différentes.
    5. Utilisez la lumière ultraviolette avec une longueur d’onde de plaque d’excitation de 330-400 nm et une longueur d’onde de plaque d’émission de 425 nm. Utilisez la lumière violette avec une longueur d’onde de plaque d’excitation de 395-415 nm et une longueur d’onde de plaque d’émission de 455 nm.
  6. Calculez l’efficacité de capture comme à l’étape 1.2.1.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’ensemble de la configuration comprend une pompe à seringue, une seringue et une puce microfluidique. La suspension cellulaire dans la seringue est connectée à la pompe à seringue, et la suspension de cellule est introduite dans la puce microfluidique pour capturer les cellules. L’efficacité de capture pour toutes les puces microfluidiques utilisées était d’environ 90% ou plus. Pour la puce à onde, nous avons conçu des microstructures avec des lacunes variées. Les petits espaces sont utilisés pour capturer les CTC, et l...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le pronostic et le diagnostic précoce du cancer ont un effet significatif sur le traitement du cancer1. L’isolement CTC avec des puces microfluidiques offre une biopsie liquide sans invasion. Cependant, les CTC sont extrêmement rares et hétérogènes dans le sang1, ce qui rend difficile l’isolement des CTC. Les CTC ont des propriétés similaires aux sources tumorales d’origine d’où ils proviennent. Ainsi, les CTC jouent un rôle essentiel dans les métastases cancéreuses

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail de recherche a été soutenu par la Fondation chinoise des sciences naturelles de l’Anhui (1908085MF197, 1908085QB66), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (21904003), le Projet de recherche scientifique de la Commission de l’éducation de Tianjin (2018KJ154), le Programme provincial de recherche en sciences naturelles des établissements d’enseignement supérieur de la province de l’Anhui (KJ2020A0239) et le Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Key Laboratory of Multidimensional Information Transformation, Université normale de Chine orientale (MIP20221).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Calcein AMBIOTIUM80011
pipettes microcapillaires calibréesSigma- AldrichP0799
CD45-PEBD Biosciences560975
CK-FITCBD Biosciences347653cytokératine anticorps monoclonal
DMEMHyCloneSH30081.05
sérum fœtal bovin (FBS)GIBCO, USA26140
Hoechst 33342Sondes moléculaires, Solarbio Corp., ChineC0031
pénicilline-streptomycineYing Biotechnologie fiable, Chine
Lyse des globules rouges (RBCL)Solarbio, PékinR1010

References

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