Article de méthode

Le système Tol2 du poisson zèbre : une approche de transgénèse modulaire et flexible basée sur une passerelle

DOI :

10.3791/64679

⸱

30 novembre 2022

 ,  , 
1Alcohol Research Center, Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Louisville

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail décrit un protocole pour le système modulaire de transgénèse Tol2, une méthode de clonage basée sur une passerelle pour créer et injecter des constructions transgéniques dans des embryons de poisson zèbre.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les troubles causés par l’alcoolisation fœtale (ETCAF) sont caractérisés par un ensemble très variable de défauts structurels et de déficiences cognitives qui surviennent en raison de l’exposition prénatale à l’éthanol. En raison de la pathologie complexe de l’ETCAF, les modèles animaux se sont révélés essentiels à notre compréhension actuelle des défauts de développement induits par l’éthanol. Le poisson zèbre s’est avéré être un modèle puissant pour examiner les défauts de développement induits par l’éthanol en raison du degré élevé de conservation de la génétique et du développement entre le poisson zèbre et les humains. En tant que système modèle, le poisson zèbre possède de nombreux attributs qui le rendent idéal pour les études de développement, y compris un grand nombre d’embryons fécondés à l’extérieur qui sont génétiquement traitables et translucides. Cela permet aux chercheurs de contrôler avec précision le moment et le dosage de l’exposition à l’éthanol dans de multiples contextes génétiques. Un outil génétique important disponible chez le poisson zèbre est la transgénèse. Cependant, générer des constructions transgéniques et établir des lignées transgéniques peut être complexe et difficile. Pour résoudre ce problème, les chercheurs sur le poisson zèbre ont établi le système de transgénèse Tol2 basé sur des transposons. Ce système modulaire utilise une approche de clonage de passerelle multisite pour l’assemblage rapide de constructions transgéniques complètes basées sur des transposons Tol2. Ici, nous décrivons la boîte à outils flexible du système Tol2 et un protocole pour générer des constructions transgéniques prêtes pour la transgénèse du poisson zèbre et leur utilisation dans les études sur l’éthanol.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’exposition prénatale à l’éthanol donne lieu à un continuum de déficits structurels et de déficiences cognitives appelés troubles causés par l’alcoolisation fœtale (ETCAF)1,2,3,4. Les relations complexes entre de multiples facteurs rendent difficile l’étude et la compréhension de l’étiologie de l’ETCAF chez les humains. Pour résoudre ce problème, une grande variété de modèles animaux ont été utilisés. Les outils biologiques et expérimentaux disponibles dans ces modèles se sont avérés cruciaux pour développer notre compréhension de la base mécaniste de la tératogénicité de l’éthanol, et les résultats de ces systèmes modèles ont été remarquablement cohérents avec ce que l’on trouve dans les études sur l’éthanol humain 5,6. Parmi ceux-ci, le poisson zèbre est apparu comme un modèle puissant pour étudier la tératogenèse de l’éthanol 7,8, en partie en raison de leur fécondation externe, de leur fécondité élevée, de leur traçabilité génétique et de leurs embryons translucides. Ces forces se combinent pour rendre le poisson zèbre idéal pour les études d’imagerie en temps réel de l’ETCAF à l’aide de lignées de poissons-zèbres transgéniques.

Le poisson-zèbre transgénique a été largement utilisé pour étudier de multiples aspects du développement embryonnaire9. Cependant, la création de constructions transgéniques et de lignées transgéniques ultérieures peut être extrêmement difficile. Un transgène standard nécessite un élément promoteur actif pour piloter le transgène et un signal poly A ou « queue », le tout dans un vecteur bactérien stable pour le maintien général du vecteur. La génération traditionnelle d’une construction transgénique à plusieurs composants nécessite plusieurs étapes de sous-clonagechronophages 10. Les approches basées sur la PCR, telles que l’assemblage Gibson, peuvent contourner certains des problèmes associés au sous-clonage. Cependant, des amorces uniques doivent être conçues et testées pour la génération de chaque construction transgénique unique10. Au-delà de la construction transgénique, l’intégration génomique, la transmission germinale et le criblage d’une intégration correcte des transgènes ont également été difficiles. Ici, nous décrivons un protocole d’utilisation du système de transgénèse Tol2 basé sur des transposons (Tol2Kit)10,11. Ce système modulaire utilise le clonage de passerelle multisite pour générer rapidement plusieurs constructions transgéniques à partir d’une bibliothèque en constante expansion de vecteurs « d’entrée » et de « destination ». Les éléments transposables Tol2 intégrés augmentent considérablement le taux de transgénèse, permettant la construction rapide et l’intégration génomique de plusieurs transgènes. À l’aide de ce système, nous montrons comment la génération d’une lignée de poisson-zèbre transgénique endodermique peut être utilisée pour étudier les défauts structurels spécifiques aux tissus sous-jacents à l’ETCAF. En fin de compte, dans ce protocole, nous montrons que la configuration modulaire et la construction de constructions transgéniques aideront grandement la recherche sur l’ETCAF à base de poisson zèbre.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les embryons de poisson zèbre utilisés dans cette procédure ont été élevés et élevés conformément aux protocoles IACUCétablis 12. Ces protocoles ont été approuvés par l’Université de Louisville.

NOTE: La souche de poisson-zèbre de type sauvage, AB, et la lignée double mutante bmp4st72;smad5b1100 ont été utilisées dans cette étude. Toute l’eau utilisée dans cette procédure était de l’eau stérile par osmose inverse. Les images confocales ont été prises au microscope confocale à balayage laser. Les mesures de l’endoderme ont été effectuées à l’aide de l’outil de mesure d’ImageJ. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide d’un logiciel statistique.

1. Faire les solutions et les médias

  1. Milieu bactérien: Dissoudre le bouillon LB ou la gélose selon les instructions du fabricant et l’autoclave. Avant de verser le média dans des boîtes de Petri de 100 mm, ajouter de l’ampicilline (50 μg/mL), de la kanamycine (50 μg/mL) ou une combinaison ampicilline/chloramphénicol (50 μg/mL et 30 μg/mL, respectivement).
  2. Pour obtenir 20x le milieu embryonnaire, dissoudre les éléments suivants dans 1 L d’eau : 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl, 2,9 g de CaCl2, 0,41 g de K2HPO 4, 0,142 g de Na2HPO 4 et4,9 g de MgSO4·7H2O. Filtrer-stériliserla solution mère à l’aide d’un système de filtration sous vide de 0,22 μm, et conserver à 4 °C.
    REMARQUE: Ignorez le précipité blanc qui se forme; Cela n’aura pas d’impact sur les médias.
  3. Dans 19 L d’eau, dissoudre 1,2 g de NaHCO3 et ajouter 1 L du milieu embryonnaire 20x pour générer la solution de milieu embryonnaire fonctionnel, et maintenir cette solution à 28 °C.
  4. Pour une solution de rouge de phénol à 2 %, dissoudre 20 mg de sel de sodium rouge de phénol dans 1 mL d’eau exempte de RNase et conserver à température ambiante.

2. Moules d’injection d’embryons

  1. Pour fabriquer la plaque d’injection d’agarose, dissoudre l’agarose dans le milieu embryonnaire jusqu’à une concentration finale de 3% en chauffant à ébullition.
  2. Versez 50 ml d’agarose dans des boîtes de Petri de 100 mm et, pendant que l’agarose est encore liquide, placez doucement le moule d’injection dans l’agarose pour éviter la formation de bulles sous le moule.
  3. Laissez refroidir les plaques d’agarose. Une fois que l’agarose est solide, retirez le moule d’injection et conservez à 4 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.

3. Pipettes d’injection

  1. Tirer des capillaires de 1,0 mm (OD) contenant un filament dans des aiguilles à l’aide d’un extracteur de pipette vertical avec le solénoïde réglé sur 2,5 et l’élément chauffant réglé sur 14,6.
    REMARQUE: Tout extracteur chauffé fonctionnera s’il tire les capillaires en deux aiguilles proprement et uniformément, mais les aiguilles d’injection doivent être tirées dans la semaine 1 suivant l’injection des embryons de poisson zèbre pour des résultats d’injection cohérents.
    1. Placez le capillaire dans l’extracteur, serrez la pince à chaque extrémité, puis activez l’élément chauffant.
    2. Tirez les capillaires pour créer deux aiguilles d’injection.
    3. Retirez les capillaires de l’extracteur et rangez-les dans une boîte de Petri vide avec une bande de pâte à modeler qui sert de porte-aiguille.

4. Préparation de l’ARNm de la transposase

  1. Linéariser le plasmide Tol2Kit contenant la transposase avec une endonucléase de restriction NotI en combinant les éléments suivants dans un tube microcentrifuge de 0,5 mL : 10 μL de plasmide de transposase (150 ng/μL), 1,5 μL de tampon de réaction de l’endonucléase de restriction, 0,3 μL d’endonucléase NotI.
  2. Remplir la réaction jusqu’à 20 μL avec de l’eau sans RNase, puis mélanger et digérer à 37 °C pendant la nuit.
  3. Arrêtez la digestion par transposition en ajoutant 1 μL de 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μL de 5 M NH4OAc et 80 μL d’EtOH à 100% à la réaction de digestion, puis mélangez et refroidissez à -20 °C pendant la nuit.
  4. Centrifuger la solution à 14 000x g pendant 20 min à 4 °C, puis aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille d’ADN dans de l’eau sans RNase.
  5. Déterminer la concentration plasmidique linéaire en nanogrammes par microlitre (ng/μL) à l’aide d’un fluoromètre en faisant d’abord couler 2 μL d’un blanc d’eau sans RNase, puis 2 μL du plasmide linéarisé.
    REMARQUE: Les concentrations plasmidiques varient généralement entre 100 et 200 ng / μL
  6. Configurez la production d’ARNm SP6 en combinant les composants suivants dans l’ordre dans un tube microcentrifuge de 0,5 mL : 10 μL de 2x NTP/CAP, 2 μL de tampon de réaction 10x, 0,1-1 μg de matrice d’ADN linéaire et 2 μL de mélange d’enzymes SP6.
  7. Remplir la réaction jusqu’à 20 μL avec de l’eau sans RNase, puis mélanger et incuber à 37 °C pendant 2 h.
  8. Après 2 h d’incubation, ajouter 1 μL de DNase, bien mélanger et incuber pendant 15 minutes supplémentaires à 37 °C.
  9. Pour arrêter la réaction SP6, ajouter 30 μL de solution de précipitation LiCl dans le tube de réaction, puis mélanger et refroidir à -20 °C pendant la nuit.
  10. Centrifuger la solution à 14 000 x g pendant 20 min à 4 °C pour enduire l’ARNm, puis aspirer le surnageant et laver la pastille d’ARNm avec 1 mL d’EtOH à 80% (dilué avec de l’eau sans RNase).
  11. Centrifuger la solution à 14 000 x g pendant 20 min à 4 °C pour granuler l’ARNm, puis aspirer le surnageant. Laissez le granulé sécher à l’air.
  12. Resuspendre la pastille d’ARNm dans 20 μL d’eau exempte de RNase, déterminer la concentration d’ARNm en nanogrammes par microlitre (ng/μL) à l’aide d’un fluoromètre comme décrit à l’étape 4.5 (doit être d’au moins 100 ng/μL), aliquote 100 ng d’ARNm par tube à usage unique, et conserver à −80 °C.
    REMARQUE: Pour s’assurer que l’ARNm n’est pas dégradé, 2 μL d’ARNm peuvent être rapidement exécutés sur un gel d’électrophorèse d’ADN pour confirmer une seule bande à 1 950 bps.

5. Clonage de passerelle multisite pour créer des vecteurs d’entrée pour la transgénèse

REMARQUE : Ce protocole est modifié à partir de Kwan et coll.10, la réaction LR étant écrite comme une réaction demi-LR et avec un volume total de 5 μL. Pour générer de nouveaux éléments d’entrée, les réactions BP utilisant des vecteurs donneurs 5', milieu et 3' doivent être utilisées10,13.

  1. Pour effectuer la réaction, recueillir 10 fmol de p5E, pME et p3E et 20 fmol du vecteur de destination (pDest).
    REMARQUE: La recombinaison LR multisite utilise quatre vecteurs plasmidiques différents: un vecteur d’entrée 5' (p5E), un vecteur d’entrée intermédiaire (pME), un vecteur d’entrée 3' (p3E) et un vecteur de destination (pDest), pour générer une construction transgénique unique flanquée de répétitions Tol2 prêtes à être injectées dans des embryons de poisson zèbre.
    1. Identifiez la taille des quatre vecteurs dans les paires de bases à partir de la source plasmidique (Tableau 1, Tol2Kit Wiki page14 ou Addgene11; voir le Tableau des matériaux).
      REMARQUE: Pour les nouveaux vecteurs, le séquençage plasmidique complet via des sociétés de séquençage commerciales peut fournir la taille exacte du plasmide en bps.
    2. Déterminer la concentration des quatre vecteurs en nanogrammes par microlitre (ng/μL) à l’aide d’un fluoromètre, comme décrit à l’étape 4.5.
    3. En utilisant le poids de l’ADN comme 660 g / mol et la taille du plasmide (en bps), calculer le total des nanogrammes (ng) de plasmide nécessaires pour atteindre 10 fmol (vecteurs d’entrée) ou 20 fmol (vecteur de destination).
      figure-protocol-1
      REMARQUE: Le laboratoire Mosimann de l’Université du Colorado, Anschutz Medical Campus, a généré une feuille de calcul disponible gratuitement pour calculer la quantité de plasmide nécessaire (en ng) et le volume (en μL) des vecteurs nécessaires dans la réaction LR15.
  2. Pour générer la construction décrite ci-dessous, sox17: EGFPCAAX, utilisez les vecteurs suivants : un vecteur p5E contenant le promoteur sox17 du poisson zèbre, dontla taille est de 6 918 pb ; un vecteur pME contenant l’EGFP prénylé, d’une taille10 de 3 345 pb; un vecteur p3E contenant la séquence de signaux poly A tardifs SV40, d’une taille10 de 2 838 pb; et le pDest, qui est de 5 883 pb en taille10.
  3. À l’aide de la concentration plasmidique déterminée à l’étape 5.1.2 et de la quantité en nanogrammes (ng) pour chaque vecteur (étape 5.1.3), calculer les microlitres totaux (μL) de chaque plasmide nécessaires pour atteindre 10 fmol (vecteurs d’entrée) ou 20 fmol (vecteur de destination), puis diviser cela par deux pour une utilisation dans les réactions demi-LR de 5 μL (toutes les valeurs énumérées ci-dessous sont énumérées dans le tableau 2).
    figure-protocol-2
    1. Pour générer 10 fmol de p5E-sox17, utilisez 45,66 ng (à une concentration de 140,3 ng/μL) et diluez avec de l’eau stérile d’un facteur 4 pour obtenir 0,65 μL.
    2. Pour générer 10 fmols de pME-EGFPCAAX, utiliser 22,08 ng (à une concentration de 213,5 ng/μL) et diluer avec de l’eau stérile par un facteur de 10 pour obtenir 0,52 μL.
    3. Pour générer 10 fmol de p3E-poly A, utiliser 15,73 ng (à une concentration de 276,1 ng/μL) et diluer avec de l’eau stérile par un facteur de 20 pour obtenir 0,57 μL.
    4. Pour 20 fmol du vecteur de destination, utiliser 77,66 ng de pDest (à une concentration de 307,3 ng/μL) et diluer avec de l’eau stérile par un facteur de 5 pour obtenir 1,63 μL.
  4. Pour mettre en place une réaction demi-LR de 5 μL, combinez les volumes de p5E, pME, p3E et pDest déterminés à l’étape 5.3 dans un tube microcentrifuge de 0,5 mL, puis ajoutez de l’eau stérile pour atteindre un volume de réaction total de 4 μL.
  5. Tourbillonner vigoureusement le mélange d’enzymes LR 2x pendant 1 min chacun pour assurer un mélange approprié, puis ajouter 1 μL à la réaction et bien mélanger.
  6. Incuber à 25 °C pendant la nuit (16+ h).
  7. Arrêter la réaction LR en ajoutant 0,5 μL de protéinase K (2 μg/μL), incuber à 37 °C pendant 10 min, puis refroidir à température ambiante.
  8. Transformez 3-4 μL de plasmide en cellules décongelées et chimiquement compétentes en ajoutant le plasmide et en laissant les cellules reposer sur la glace pendant 25-30 min.
  9. Pendant que les cellules reposent sur de la glace, réchauffer deux plaques de gélose LB-ampicilline à température ambiante.
  10. Choc thermique des cellules dans un bain-marie à 42°C pendant 30 s précises.
  11. Après le choc thermique, ajouter 250 μL de milieux liquides riches et sans antibiotiques aux cellules, et incuber en agitant à 37 °C pendant 1,5 h.
  12. Étaler 300 μL de bactéries sur une plaque d’ampicilline et incuber à 37 °C pendant la nuit.
  13. Le lendemain matin, examiner les colonies pour détecter la présence de deux phénotypes, clair et opaque, choisir les colonies claires (comme décrit dans Kwan et al.10) une à la fois, inoculer la culture liquide, puis agiter à 37 °C pendant la nuit.
    REMARQUE: Les colonies claires contiennent presque toujours la bonne colonie LR (>85% du temps).
  14. À l’aide d’une trousse commerciale conforme aux instructions du fabricant, effectuer une préparation plasmidique sur chaque culture liquide et digérer diagnostiquement chaque plasmide pour confirmer la taille appropriée de la construction transgénique, ce qui indique que la réaction de la passerelle LR a fonctionné correctement.
  15. Retransformez les constructions transgéniques correctes en utilisant le protocole de transformation bactérienne standard décrit aux étapes 5.4-5.12 en utilisant 0,5-1 μL du plasmide, et incuber seulement à 37 °C pendant 1 h.
  16. Resemer les colonies et confirmer que chacune a la construction transgénique LR comme à l’étape 5.14.
  17. Déterminer la concentration plasmidique comme décrit à l’étape 4.5 (au moins 150 ng/μL est nécessaire pour l’injection d’embryons).

6. Injection du transgène dans les embryons

  1. Décongeler un échantillon d’ARNm transposase à usage unique et une construction transgénique Tol2 sur de la glace et avertir une plaque d’injection d’agarose à température ambiante.
  2. Combinez les éléments suivants sur la glace : 150 ng de plasmide, 100 ng d’ARNm de transposase et 2 % de rouge de phénol (0,3 μL). Ensuite, ajoutez de l’eau sans ARN pour compléter le volume à 3 μL.
  3. Transférer un embryon au stade cellulaire à l’aide de pipettes de transfert sur la plaque d’injection (décrite à l’étape 2) remplie de ME recouvrant complètement l’agar-agar, puis presser doucement environ 50 à 75 embryons par fente de la plaque d’injection.
  4. Ajouter le mélange ARNm/plasmide/rouge phénol à l’extrémité ouverte d’une aiguille d’injection capillaire, placer l’aiguille capillaire dans l’armature de la plate-forme d’injection et allumer la plate-forme d’injection.
    REMARQUE:La plate-forme d’injection utilise du gaz comprimé, tel que de l’air, pour pulser le volume souhaité (décrit à l’étape 6.5) du mélange ARNm/plasmide/rouge phénol dans l’embryon lorsqu’il est activé.
  5. Abaissez l’aiguille capillaire dans l’EM de la plaque d’injection et brisez l’embout à l’aide d’une pince pour permettre à seulement une petite quantité de mélange ARNm/plasmide/rouge phénol d’être pompée par la plate-forme d’injection.
  6. Injecter les embryons avec un petit bolus de 3 nL du mélange ARNm/plasmide/rouge phénol dans le corps cellulaire de l’embryon.
    REMARQUE: Un bolus de 3 nL est un volume de mélange d’ARNm / plasmide / rouge phénol auquel sept bolus peuvent théoriquement s’adapter également à travers la ligne médiane de l’embryon.
  7. Lorsque l’injection des embryons est terminée, retirez-les de la plaque d’injection en les sortant doucement de la fente et en les transférant-pipetage dans une boîte de Petri de 100 mm avec EM frais (environ 40 ml), puis incuber à 28,5 °C pour permettre aux embryons de se développer.

7. Dépistage des embryons en vue de leur insertion transgénique

  1. Pour l’expression des protéines fluorescentes, choisir le stade de développement approprié où le transgène fluorescent doit être exprimé et rechercher la présence de fluorescence au microscope à dissection fluorescente.
    NOTE: Ces embryons seront en mosaïque dans leur expression et montreront une insertion génomique de la construction transgénique.
  2. Dépister les transgènes non fluorescents par criblage d’un marqueur transgénique fluorescent (tel que décrit à l’étape 7.1), tel que la GFP pilotée par le promoteur cardiaque spécifique du gène cmlc2 ou mCherry piloté par le promoteur spécifique du cristallin de l’αcyrstalline, qui sont contenus dans des vecteurs de destination distincts.
  3. Permettre aux embryons positifs pour l’insertion transgénique de se développer pleinement jusqu’aux stades de poisson-zèbre adulte.
  4. Une fois que les poissons transgéniques potentiels atteignent l’âge de reproduction, les dépister individuellement pour la transmission germinale et l’expressivité transgénique en les élevant à des poissons-zèbres de type sauvage.
  5. Les adultes dont les embryons se développent normalement et donnent l’expression transgénique la plus forte et la plus appropriée sont conservés comme des lignées uniques de poissons-zèbres transgéniques pour les travaux et analyses futurs.
    REMARQUE : Comme approche alternative au dépistage de l’insertion génomique de constructions transgéniques, concevoir des amorces de PCR qui amplifient uniquement la construction transgénique et non l’ADN de type sauvage.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour générer les constructions transgéniques, nous avons utilisé le système de transgénèse Tol2. Trois vecteurs d’entrée, dont p5E, qui contient les éléments promoteur/amplificateur de gène, pME, qui contient le gène à exprimer par les éléments promoteurs/amplificateurs, et p3E qui, au minimum, détient la queue polyA, ont été utilisés pour générer la construction transgénique via le clonage LR de passerelle multisite. Le vecteur de destination, pDest, fournit les répétitions Tol2 pour l’insertion génomique de la...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le poisson zèbre est idéal pour étudier l’impact de l’exposition à l’éthanol sur le développement et les états pathologiques 7,8. Le poisson zèbre produit un grand nombre d’embryons translucides, fécondés à l’extérieur et génétiquement traitables, ce qui permet l’imagerie en direct de plusieurs tissus et types de cellules marqués par des transgènes simultanément dans de multiples contextes environnementaux19,20...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La recherche présentée dans cet article a été soutenue par une subvention des National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 à CBL.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Addgene Tol2 toolboxhttps://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
AirFourni directement par l’université
AmpicillineFisher ScientificBP1760
Balance analytiqueVWR10204-962
Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID CapillaireFHC30-30-0
Chlorure de calciumVWR97062-590
ChloramphénicolBioVision2486
EDTAFisher ScientificBP118-500
Microscope fluorescent à dissectionOlympusSZX16
KanamycinFisher ScientificBP906
Microscope confocal à balayage laserOlympusFluoview FV1000
Lawson Lab Donor Plasmid Prephttps://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB AgarFisher ScientificBP9724
LB BrothFisher ScientificBP1426
Faiblement EEO/Polyvalent/Biologie moléculaire AgaroseFisher ScientificBP160-500
LR Clonase II Plus EnzymeFisher Scientific12538200 Sulfate de
magnésium (heptahydraté)Fisher ScientificM63-500
Porte-micropipetteApplied Scientific InstrumentationMIMPH-M-PIP
Tube de microcentrifugation 0,5 mL  ;VWR10025-724
Tube de microcentrifugation 1,5 mL  ;VWR10025-716
MicromanipulateurInstrumentation scientifique appliquéeMM33
Pointes de micropipette 10 &mu ; L  ;Fisher Scientific13611106
Pointes de micropipette 1000 &mu ; L  ;Fisher Scientific13611127
Pointes de micropipette 200 &mu ; L  ;Fisher Scientific13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcriptionFisher ScientificAM1340
Mosimann Lab Tol2 Feuille de calculhttps://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
Spectrophotomètre NanoDrop NanoDropND-1000
NcoINEBR0189S
NotINEBR0189S
Boîtes de Pétri 100 mm  ;Fisher ScientificFB012924
Phénol Sel de sodium rougeSigma AldrichP4758-5G
Pipetman L p1000L MicropipetteGilsonFA10006M
Pipetman L p200L MicropipetteGilsonFA10005M
Pipetman L p2L MicropipetteGilsonFA10001M
Chlorure de potassiumFisher ScientificP217-500
Phosphate de potassium (dibasique)VWRBDH9266-500G
Injecteur de pressionInstrumentation scientifique appliquéeMPPI-3
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Bicarbonate de sodiumVWRBDH9280-500G
Chlorure de sodiumFisher ScientificS271-500
Phosphate de sodium (dibasique)Fisher ScientificS374-500
Stericup .22 & micro ; m système de filtration sous vide  ;MilliporeSCGPU11RE
Tol2 Page Wikihttp://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Chimiquement compétent E. coliFisher ScientificC404010
Extracteur de pipette verticalDavid Kopf Instruments720
Zebrafish moule de micro-injectionOutils de science adaptativei34

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
  2. Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
  3. Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
  4. Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
  5. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).
  6. Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
  7. Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460(2021).
  8. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  9. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26(2021).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).
  13. Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017).
  14. The Tol2Kit. , Available from: http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page (2007).
  15. Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
  16. Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
  17. Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
  18. Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
  19. Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665(2022).
  20. Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813(2021).
  21. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
  22. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
  23. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  24. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  25. Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).

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