Dépistage des spermatozoïdes pour l’isolement rapide des modifications de la lignée germinale chez le poisson zèbre

Résumé

Les technologies CRISPR-Cas ont révolutionné le domaine de l’édition du génome. Cependant, trouver et isoler la modification souhaitée de la lignée germinale reste un goulot d’étranglement majeur. Par conséquent, ce protocole décrit une méthode robuste pour dépister rapidement les spermatozoïdes de poisson-zèbre injectés par F0 CRISPR pour les modifications de la lignée germinale en utilisant des techniques standard de PCR, de digestion de restriction et d’électrophorèse sur gel.

Résumé

L’avènement des technologies de nucléase CRISPR-Cas ciblées a révolutionné la capacité d’effectuer une édition précise du génome dans les systèmes modèles établis et émergents. Les systèmes d’édition du génome CRISPR-Cas utilisent un ARN guide synthétique (sgRNA) pour cibler une endonucléase associée à CRISPR (Cas) sur des loci d’ADN génomique spécifiques, où l’endonucléase Cas génère une cassure double brin. La réparation des cassures double brin par des mécanismes intrinsèques sujets aux erreurs conduit à des insertions et/ou des délétions, perturbant le locus. Alternativement, l’inclusion de donneurs d’ADN double brin ou d’oligonucléotides d’ADN simple brin dans ce processus peut susciter l’inclusion de modifications précises du génome allant des polymorphismes mononucléotidiques aux petites étiquettes immunologiques ou même aux grandes constructions de protéines fluorescentes. Cependant, un goulot d’étranglement majeur dans cette procédure peut être de trouver et d’isoler la modification souhaitée dans la lignée germinale. Ce protocole décrit une méthode robuste pour le dépistage et l’isolement des mutations germinales à des loci spécifiques chez Danio rerio (poisson zèbre); Cependant, ces principes peuvent être adaptables dans n’importe quel modèle où la collecte de sperme in vivo est possible.

Introduction

Le système CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas est un outil puissant pour effectuer une mutagénèse spécifique aux loci et une édition précise du génome dans le système modèle Danio rerio (poisson zèbre) 1,2,3,4. La Cas-ribonucléoprotéine (RNP) est composée de deux composants principaux : une endonucléase Cas (communément Cas9 ou Cas12a) et un ARN guide synthétique spécifique au locus (ARNs)⁵. Ensemble, le Cas-RNP génère une rupture double brin (DSB) dans le locus désiré qui pe....

Protocole

Cette étude a été réalisée conformément aux directives du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Texas à Austin (AUP-2021-00254).

1. Conception de l’ARNg pour la mutagénèse CRISPR

1. Obtenir la séquence d’exons contenant les loci ciblés.
2. Concevoir un ARN guide synthétique (ARNg) avec un site de motif adjacent protospacer (PAM) spécifique à l’endonucléase Cas.
   1. Si vous co-injectez une construction donneuse, concevez l’ARNg de manière à ce qu’un sit....

Résultats

Les approches expérimentales décrites dans ce protocole permettent l’identification plus rapide des modifications du génome ou des allèles délétères putatifs en se concentrant sur l’analyse de milliers de génomes dérivés de la collecte de spermatozoïdes masculins injectés F0. La figure 2 montre comment interpréter les résultats obtenus à l’aide de ce protocole.

Pour générer des mutations dans le locus p2ry12, des embryons de poisson-zèbre au stade unicellulaire on.......

Discussion

Ce protocole décrit une méthode pour caractériser rapidement des modifications présumées du génome ou des mutations ciblées à l’aide de la technologie CRISPR-Cas par analyse ciblée sur les génomes des spermatozoïdes masculins F0. Ce protocole devrait se prêter à d’autres modèles animaux où le sperme est facilement disponible pour l’échantillonnage sans euthanasie. Cette méthode augmentera le débit de criblage pour les modifications souhaitées et est particulièrement utile pour identifier les rares événements de knock-in .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Poudre d’agarose  ;	Fisher BioReagents	BP1356-100
Bassins d’élevage	Carolina Biological  ;
Enzyme de restriction BstNI	NEB	R0168S
Cas9 Endonuclease	IDT	1081060
échelle d’ADN, 100 pb  ;	Thermo Scientific  ;
dnah10 donateur construct  ;   ;	Sigma-Aldrich	en tube ; 0,025 nM, purification par dessalage standard, sec. Liaison phosphorothioate sur le donneur aux trois premières liaisons phosphate aux extrémités 5' et 3' (5'-CCTCTCTCTCTCTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3')
dnah10 amorce directe  ;	Sigma-Aldrich	en tube ; 0,025 nM, purification par dessalage standard, sec (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3')
dnah10 amorce inverse  ;	Sigma-Aldrich	en tube ; 0,025 nM, purification par dessalage standard, sec ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3')  ;
dnah10 sgRNA synthétique  ;	Synthego  ;	ARNsg synthétique, séquence cible : 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'Alimentation
par électrophorèse	Thermo Scientific  ;	105ECA-115
Pince à filtre	Millipore	XX6200006P
Eau de poisson (système)	Générique	n/a
sur gel (y compris cadre de coulée, peigne et chambre d’électrophorèse)  ;	Thermo Scientific  ;	Boîte
;	Azure Biosystems	AZI200-01
Coloration gel, 10000X  ;	Invitrogen	S33102
Bol en verre, 250 mL  ;	Générique	n/a
Réservoirs d’isolement, 0,8 L  ;	Aquaneering	ZT080
Tube capillaire microcap avec bulbe, 20 & micro ; L  ;	Drummond	1-000-0020/CA
Minicentrifugeuse	Bio-Rad	12011919EDU
Micropipettes, diverses avec embouts appropriés	Générique  ;	n/a
Micro-ondes  ;	Générique  ;	n/a
Eau sans nucléases	Promega	P119-C
Essuie-tout	Générique	n/a
Tubes PCR, 0,2 mL	Bioexpress	T-3196-1
Cuillère en plastique, avec trous/fentes percés  ;	Solution générique	n/a
KCl, 0,2 M d’ARNse libre	Sigma-Aldrich	P9333
p2ry12 amorce directe  ;	Sigma-Aldrich	en tube ; 0,025 nM, purification par dessalage standard, à sec (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3')
p2ry12 amorce inverse	Sigma-Aldrich	en tube ; 0,025 nM, purification par dessalage standard, à sec (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3')  ;
p2ry12 ARNsg synthétique  ;	Synthego  ;	ARNsg synthétique, séquence cible : 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'
Enzyme de restriction 10X Tampon	NEB	B6003SVIAL
solution de NaOH, 50 mM  ;	Thermo Scientific  ;	S318 ; Éponge 424330010
, coupe de 1 pouce x 1 pouce avec petit divot ovale	Générique  ;	n/a
Stéréomicroscope	Zeiss	Stemi 508
Taq polymérase master mix, 2X	Promega	M7122
TBE Buffer Concentrate, 10X	VWR	E442
Thermocycleur	Bio-Rad	1861096
Papier de soie	Fisher Scientific	06-666
Solution de tricaïne-méthanesulfonate (Syncaine, MS-222), 0,016 % dans l’eau de poisson (pH 7,0± ; 0.2)  ;	Syndel	200-266
Base Tris, 1M (tamponnée avec HCl à pH 8,0)  ;	Promega	H5131

161937FERSM0241Oligo d’ADN Oligo d’ADN Oligo d’ADN Système d’électrophorèse lumineuse d’imagerie gel B2Oligo d’ADN Oligo d’ADN