Construction, caractérisation et application régénérative d’agrégats de cellules souches mésenchymateuses humaines auto-assemblés

Summary

Cette étude décrit une méthode de construction d’agrégats basée sur l’auto-assemblage de cellules souches mésenchymateuses humaines et identifie les caractéristiques morphologiques et histologiques pour le traitement régénératif des anomalies osseuses crâniennes.

Abstract

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM), caractérisées par leur capacité d’auto-renouvellement et leur potentiel de différenciation multilignée, peuvent provenir de diverses sources et apparaissent comme des candidates prometteuses pour la médecine régénérative, en particulier pour la régénération de la dent, des os, du cartilage et de la peau. L’approche auto-assemblée de l’agrégation des CSM, qui construit notamment des amas de cellules imitant la condensation mésenchymateuse en développement, permet l’administration de cellules souches à haute densité ainsi que la préservation des interactions cellule-cellule et de la matrice extracellulaire (ECM) comme niche du microenvironnement. Il a été démontré que cette méthode permet une greffe et une survie cellulaires efficaces, favorisant ainsi l’application optimisée des CSM exogènes dans l’ingénierie tissulaire et la préservation de la régénération des organes cliniques. Cet article fournit un protocole détaillé pour la construction et la caractérisation d’agrégats auto-assemblés à base de cellules souches mésenchymateuses de cordon ombilical (UCMSCs), ainsi qu’un exemple d’application régénérative de l’os crânien. La mise en œuvre de cette procédure contribuera à guider l’établissement d’une stratégie efficace de transplantation de CSM pour l’ingénierie tissulaire et la médecine régénérative.

Introduction

La condensation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) est une étape essentielle pour assurer la croissance et le développement normaux du corps au début de l’organogenèse ^1,2, en particulier dans la formation des os, du cartilage, des dents et de la peau ^1,3,4. Au cours des dernières décennies, les thérapies d’ingénierie tissulaire utilisant des CSM postnatales cultivées combinées à des échafaudages biodégradables ont permis des avancées importantes dans la régénération ostéogénique⁵ et la régénération cartilagineuse⁶. Cependant, l’utilisation d’échafaudages peut présenter certains inconvénients, tels qu’un rejet immunitaire, ainsi qu’une faible affinité cellulaire et une faible plasticité⁷. À cet égard, nous avons étudié la faisabilité d’appliquer une méthode de culture de cellules sphéroïdes pour fournir des agrégats auto-assemblés sans échafaudage imitant le phénomène de condensation en développement, qui ne contiennent que des CSM et la matrice extracellulaire (ECM) ^déposée8. La formation d’agrégats augmente la plasticité applicative pour s’adapter à la forme du défaut et évite l’implantation d’échafaudages et la digestion par des enzymes protéolytiques pour récolter les CSM pour la transplantation⁹.

Les agrégats MSC ont été largement utilisés pour la régénération des os, de la pulpe dentaire, du parodonte et de la peau¹⁰, entre autres tissus et organes. De nombreux types de CSM peuvent être sélectionnés comme candidats pour les cellules de semence, y compris, mais sans s’y limiter, les CSM de moelle osseuse (BMMSC), les CSM de cordon ombilical (UCMSC), les cellules stromales dérivées du tissu adipeux (ADSC) et les CSM dentaires (par exemple, les cellules souches mésenchymateuses de la pulpe dentaire [DPSC], les cellules souches mésenchymateuses des dents de lait [SHED]¹¹ et les cellules souches mésenchymateuses parodontales [PDLSC]⁾¹². De nombreuses technologies pour les grappes de cellules tridimensionnelles ont été développées au cours de la dernière décennie, y compris l’agrégation assistée et auto-assemblée. Cependant, les approches d’agrégation assistée sont souvent faibles pour produire des ECM et former des agrégats homogènes et serrés, et ne conviennent donc pas pour imiter les conditions physiologiques 13,14,15. De plus, certaines méthodes d’agrégation assistée nécessitent des interactions cellule-matériau pour former des structures stables 16,17,18,19, alors que cette méthode d’agrégation auto-assemblée est généralement disponible pour un large éventail de CSM. Notamment, dans nos récents essais cliniques, les agrégats de CSM ont été utilisés avec succès pour régénérer le complexe pulpe-dentine et le parodonte après implantation dans des incisives humaines blessées, qui ont réalisé une régénération tissulaire de novo avec une structure et une fonction physiologiques^20,21.

Cet article fournit une procédure approfondie pour la construction et la caractérisation des agrégats MSC, ainsi que pour la transplantation in vivo . Cette approche attirera l’attention des chercheurs lorsqu’ils viseront à réparer des défauts dans les tissus, tels que les dents, les os, le cartilage et la peau, en fonction des applications de cellules souches. Cette méthode est simple, pratique et entièrement composée de cellules et d’ECM sans échafaudages supplémentaires, qui peuvent être cultivés pendant une longue période pour obtenir des agrégats denses et stables²². Pendant ce temps, les agrégats cultivés de cette manière sont riches en ECM, qui imite la niche en développement de ces cellules à haute densité et favorise ainsi la régénération des tissus²³. Le processus de construction peut être divisé en deux étapes : la préparation et la culture des cellules, et la formation et la récolte des agrégats cellulaires auto-assemblés. La caractérisation des agrégats comprend l’identification morphologique par microscope optique inversé et microscope électronique à balayage (MEB), l’analyse histologique par hématoxyline et éosine (HE) et la coloration de Masson. Il a été démontré que les agrégats formés étaient implantés de manière régénérative pour réparer le défaut osseux crânien. La mise en œuvre de cette procédure contribuera à guider l’établissement d’une stratégie efficace de transplantation de CSM pour l’ingénierie tissulaire et la médecine régénérative.

Protocol

REMARQUE : Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de la quatrième Université de médecine militaire et effectuées conformément au Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des UCMSCs humains cryoconservés obtenus d’une source commerciale ont été utilisés pour la présente étude (voir la table des matériaux). L’utilisation de cellules humaines a été approuvée par le Comité d’éthique de la Quatrième Université de médecine militaire. Les UCMSCs ont été pris en exemple pour décrire la procédure. L’anomalie crânienne a été prise comme exemple pour montrer la nécessité d’une réparation pour décrire la procédure d’implantation. Toutes les expériences ont été répétées trois fois.

1. Construction des granulats UCMSC

1. Préparation et culture des UCMSCs
   1. Ajouter 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préchauffée dans un nouveau tube centrifuge de 15 ml dans une enceinte de biosécurité stérile.
   2. Retirez le tube de congélation contenant les UCMSCs congelés de l’azote liquide et placez-le rapidement dans un bain-marie à 37 °C. Agitez doucement le tube pour faciliter une décongélation rapide et complète des cellules.
      ATTENTION : L’ensemble de la procédure doit être terminé dans un délai de 1 minute, car le diméthylsulfoxyde (DMSO) dans la solution de congélation peut provoquer une cytotoxicité.
   3. Suspendez légèrement les cellules dans le tube de congélation et transférez tout le contenu dans le tube à centrifuger contenant 10 ml de PBS (étape 1.1.1). Centrifuger l’échantillon à 100 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant et lavez les cellules avec 10 mL de PBS.
   4. Centrifuger l’échantillon à 100 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant et remettez doucement les cellules en suspension avec un milieu essentiel alpha-minimum complet (α-MEM) contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline-streptomycine et 584 mg/L de glutamine.
   5. Ensemencez les cellules remises en suspension dans des boîtes de culture de 10 cm (souvent une à deux boîtes pour un tube, en fonction de la quantité totale de cellules après centrifugation, à une densité de 5 × 10⁶ cellules par boîte). Ajouter le milieu α-MEM complet dans les plats jusqu’à un volume total de 10 ml.
   6. Secouez doucement les plats pour répartir les cellules. Incuber les plats à 37 °C avec 5 % de CO₂ dans une chambre humidifiée. Après une nuit d’incubation, jeter le milieu surnageant et ajouter 5 ml de PBS 1-2x pour éliminer les cellules non adhérentes. Ajouter 10 ml de milieu α-MEM complet frais. Changez le milieu de culture tous les 2 jours.
   7. Pour le passage cellulaire, lorsque les cellules atteignent 80 % à 90 % de confluence, jetez le surnageant et lavez les cellules avec 5 ml de PBS pour éliminer complètement le milieu. Incuber les cellules dans 2 mL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 % de trypsine-1 mM à 37 °C pendant 2 min.
   8. Lorsque les cellules deviennent rondes avec des jonctions intercellulaires brisées au microscope, séparez les cellules des boîtes sans trop perturber la structure cellulaire. Neutralisez la trypsine en ajoutant 4 ml de milieu complet α-MEM.
   9. Prélever les cellules des boîtes à plusieurs reprises et en douceur par pipetage dans un tube à centrifuger frais de 15 ml. Centrifuger l’échantillon à 100 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant, remettez les cellules en suspension avec un milieu α-MEM complet et ensemencez-les dans des boîtes de culture fraîches ou des plaques de puits. Changez le milieu de culture tous les 2 jours.
      REMARQUE : Selon la taille de la zone du défaut, un défaut de 25 mm³ nécessite l’utilisation d’un puits de cellules sur plaque à 6 puits cultivées pour former des agrégats.
2. Formation et récolte des granulats
   1. Préparez un milieu inducteur d’agrégats cellulaires en ajoutant 50 μg/mL de vitamine C dans du α-MEM avec 10 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine et 584 mg/L de glutamine.
      ATTENTION : L’exposition directe à la lumière doit être évitée lors de l’utilisation de la vitamine C, car la vitamine C s’oxyde lorsqu’elle est exposée à la lumière et devient inefficace.
   2. Lorsque les cellules de l’étape 1.1.12 atteignent une confluence de 95 % (figure supplémentaire S1), remplacer le milieu par un milieu inducteur d’agrégats cellulaires ; Changer les milieux inducteurs d’agrégats de cellules fraîches tous les 2 jours.
   3. Après 7 à 10 jours d’induction (la durée de l’induction dépend des types de cellules souches et est souvent de ~7 jours pour le bord des UCMSCs), recherchez des agrégats façonnés au microscope, avec des bords épais séparés du fond de la boîte.
   4. Jetez le milieu de culture et lavez délicatement les cellules 2 fois avec du PBS. Poussez doucement les agrégats du bord vers le milieu à l’aide de petites pinces stériles, en pliant les agrégats.
   5. À certaines occasions, les UCMS peuvent s’enrouler spontanément vers le centre pour former une condensation solide. Cette structure est équivalente à l’agrégat obtenu à l’étape 1.2.4.

2. Identification morphologique des granulats

1. Observation générale et microscopique
   1. Observez que les agrégats sont denses et intégrés et ne sont pas facilement endommagés par les forces mécaniques, telles que la traction lors du détachement et de la transplantation.
   2. Au microscope, recherchez une structure semblable à une membrane d’une certaine épaisseur avec un motif tissé.
2. Coloration des cellules vivantes/mortes
   1. Ensemencez les cellules dans une plaque de 6 puits à une densité de 1 × 10⁶ cellules par puits.
   2. Préparez une solution de travail de 2 μM de calcéine AM et de 4 μM d’EthD-1 en utilisant du PBS.
   3. Ajoutez 0,3 % de triton dans les cellules pendant 5 min, lavez trois fois avec du PBS pour induire les cellules à la mort, comme contrôle de la coloration.
   4. Lavez deux fois les cellules, les agrégats et les cellules inductrices de mort avec du PBS.
   5. Ajouter 100 μL de PBS et 100 μL de solution de coloration préparée à l’étape 2.2.2 dans chaque puits.
   6. Incuber l’échantillon pendant 30 minutes à RT. Lavez l’échantillon avec du PBS deux fois.
   7. Ajoutez 200 μL de 10 μg/mL de Hoechst dans chaque puits et incubez l’échantillon pendant 5 min à RT. Wah l’échantillon avec du PBS deux fois.
   8. Observez au microscope à fluorescence.
3. Observation MEB
   1. Ensemencer et induire les agrégats obtenus à l’étape 1.2.4 ou 1.2.5. Lavez les cellules avec du PBS après la formation des agrégats à l’étape 1.2.4. ou 1.2.5.
   2. Fixez les cellules à l’aide de glutaraldéhyde pendant au moins 4 h.
   3. Lavez les échantillons avec du PBS, puis déshydratez-les à travers une concentration dégradée d’éthanol de 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 % à 100 %, chacun pendant 5 min. Traiter 2x avec de l’éthanol anhydre.
   4. Immerger les agrégats dans 3 mL d’hexaméthyldisilazane pendant 30 min. Aspirez tout le liquide et séchez naturellement les échantillons en profondeur.
      ATTENTION : L’ensemble du processus doit être effectué dans une hotte car l’hexaméthyldisilazane est volatil et hautement toxique.
   5. Collez les échantillons séchés sur la table d’échantillonnage avec du ruban carbone double face et enduisez la surface de métal. Conservez l’échantillon à température ambiante (RT) pendant plusieurs jours.
   6. Observez sous un MEB.
      1. Replacez l’échantillon à l’intérieur de la machine. Réglez la tension de la machine à 5 k et la distance focale à ~12 mm. Ajustez la barre de mise au point jusqu’à ce qu’une image claire apparaisse.
      2. Capturez les images à faible grossissement. Ajustez l’agrandissement et refaites la mise au point pour obtenir une image à fort grossissement.
         ATTENTION : La surface des agrégats ne peut pas être touchée avant l’observation pour éviter la destruction de la morphologie de surface.

3. Analyse histologique des agrégats

1. Fixation et sectionnement d’échantillons
   1. Fixer les agrégats obtenus à l’étape 1.2.4 ou 1.2.5 avec 4 % de paraformaldéhyde à 4 °C pendant au moins 24 h. Après la fixation, laver avec du PBS et placer l’échantillon dans des cassettes d’enrobage pendant la nuit pour le rincer à l’eau courante.
   2. Déshydratez les échantillons à l’aide de machines de déshydratation automatiques à l’éthanol gradient, au xylène et à la paraffine, en suivant les instructions du fabricant. L’ensemble du processus est le suivant : 85 % d’éthanol pendant 2 h à RT, 95 % d’éthanol pendant 2 h à RT, 95 % d’éthanol pendant 2 h à RT, 100 % d’éthanol pendant 2 h à RT, 100 % d’éthanol pendant 1,5 h à RT, xylène pendant 45 min à RT, xylène pendant 45 min à RT, paraffine pendant 30 min à RT, paraffine pendant 1,5 h à RT, et enfin paraffine pendant 2 h à 60 °C.
   3. Intégrez les échantillons avec de la paraffine. Préparez des sections d’environ 5 μm d’épaisseur, collez-les sur des lames cationiques et séchez les lames pendant 2 h à 45 °C.
   4. Déparaffiner séquentiellement à travers du xylène pendant 15 min, deux fois, et 100 %, 90 %, 80 % et 70 % d’éthanol (chacun pendant 5 min).
   5. Rincez lentement les lames 3 fois à l’eau courante pendant 5 min.
2. Coloration HE
   1. Teintez avec de l’hématoxyline pendant 3 à 5 minutes, rincez à l’eau et retirez soigneusement l’excès de liquide autour du tissu.
   2. Fractionnez avec de l’éthanol contenant 1 % d’acide chlorhydrique pendant 3 à 5 s et rincez à l’eau courante, au cours de laquelle la couleur devient un peu plus claire et bleue. Retirez l’excès d’eau autour du tissu.
   3. Teintez avec de l’éosine pendant 1 min, rincez à l’eau courante et retirez l’excès de liquide autour du tissu.
   4. Déshydrater avec 70 %, 80 %, 90 % et 100 % d’éthanol pendant 10 s chacun, du xylène pendant 15 minutes, deux fois, et sécher naturellement dans la hotte avant de sceller la feuille.
   5. Ajoutez des gouttes de résine neutre et scellez les lames avec des lamelles. Observez au microscope optique.
3. Coloration trichrome de Masson
   1. Teindre avec de l’hématoxyline de fer de Weigert pendant 5 min, rincer à l’eau et essuyer.
   2. Fractionnez avec de l’éthanol contenant 1 % d’acide chlorhydrique pendant 3 à 5 s et rincez à l’eau courante, au cours de laquelle la couleur devient un peu plus claire et bleue. Essuyez la surface.
   3. Colorer avec une solution de magenta acide rouge Lixin pendant 5 à 10 minutes et rincer rapidement à l’eau distillée.
   4. Traiter avec une solution aqueuse d’acide phosphomolybdique pendant 3 à 5 min.
   5. Colorez à nouveau directement avec une solution de bleu d’aniline pendant 5 min sans laver à l’eau.
   6. Traiter avec de l’acide acétique glacial à 1 % pendant 1 min.
   7. Déshydrater avec 70 %, 80 %, 90 % et 100 % d’éthanol pendant 10 s chacun, du xylène pendant 15 minutes, deux fois, et sécher naturellement dans la hotte avant de sceller la feuille.
   8. Ajoutez des gouttes de résine neutre et scellez les lames avec des lamelles. Observez au microscope optique.

4. L’implantation

1. Anesthésier la souris nue par une injection intrapéritonéale de 50 mg/kg de pentobarbital sodique.
   REMARQUE : Confirmez que les souris sont correctement anesthésiées en fonction de l’absence de réflexe cornéen et de réaction des membres lorsque le coussinet plantaire est pincé. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse.
2. Découpez une incision transversale (~3-4 cm) dans la peau derrière les oreilles de la souris nue avec de petits ciseaux stériles après désinfection à l’iodophore.
3. Tirez la peau vers l’avant pour exposer le crâne. Dessinez légèrement les bords de la zone de défaut prévue avec une lame 11 # et retirez le fragment d’os. La zone du défaut est une zone circulaire d’environ 4 mm de diamètre. Utilisez une solution saline pour rincer la plaie et fournir une hémostase adéquate.
4. Tremper les agrégats obtenus à l’étape 1.2.5 ou 1.2.6 avec de la gaze stérile pour absorber l’humidité de surface avant l’implantation. Placez les agrégats dans la zone et pressurisez légèrement pour combler le défaut.
5. Replacez la peau après avoir tiré pour vous assurer que l’implant est fixé. Fermez l’incision avec 1/2, 4 × 10 points de suture inclinés et 4-0 sutures.
6. Après l’opération, placez les animaux sur la couverture chauffante jusqu’à ce qu’ils soient actifs, puis remettez-les dans la cage.
   REMARQUE : Les animaux ne doivent pas être laissés sans surveillance jusqu’à ce qu’ils retrouvent une conscience suffisante pour maintenir la déposition sternale. Les animaux qui ont subi une intervention chirurgicale ne sont pas rendus à la compagnie d’autres animaux avant d’être complètement rétablis.

Results

Les agrégats peuvent être construits avec succès à partir d’UCMSCs selon le flux de travail expérimental (Figure 1). La qualité des granulats doit être évaluée avant utilisation, via l’observation morphologique et l’analyse histologique. La structure lamellaire formée doit être complète et dense, les cellules s’entrelaçant pour former un motif tissé par observation microscopique (Figure 2A). L’enroulement des bords peut être découvert lors de l’agrégati...

Discussion

Avec les progrès de la biotechnologie de l’ingénierie tissulaire, les stratégies visant à construire une structure implantable à haute plasticité et contenant des cellules survivantes à long terme capables d’obtenir une régénération optimale ont été au centre de l’attention de nombreux scientifiques. Il existe actuellement une variété de méthodes d’implantation de CSM, telles que les méthodes à cellules seules, les échafaudages complétés par des cytokines ^6,2...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % Trypsine-EDTA (1x)	Sigma	T4049	Passage cellulaire
de déshydratation automatique	LEICA	ASP200s	d’agrégats déshydratés
	Eppendorf	5418R	Centrifugation Tube de centrifugation
	Thermo Nunc	339650
Centrifugeuse Plat de culture	Thermo	150466	Culture d’UCMSCs
Éthanol	SCR	10009218	Granulat déshydraté
Sérum bovin mortel	Sijiqing	11011-8611	Culture d’UCMSCs
Forcep	JZ	JD1080	Granulat de récolte
Glutaraldéhyde	Proandy	10217-1	Fixation de l’agrégat
Hématoxyline et Eosin Kit de coloration	beyotime	C0105S	HE
Hexaméthyldisilazane	SCR	80068416	Surface d’agrégat sec
Hoechst33342	Sigma	14533	Coloration des noyaux cellulaires
L-glutamine	Sigma	G5792	Culture d’UCMSCs
Vivant/mort Kit de viabilité/cytotoxicité  ;	Invitrogen	L3224	Coloration à cellules vivantes/mortes
de coloration de Masson	ZHC	CD069	Coloration de Masson
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)	Gibco	C12571500BT	Culture d’UCMSCs
Paraffine	Leica	39601006	Enrobage tissulaire
Paraformaldéhyde	Saint-Bio	D16013	Fixation de granulats
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	Remettre en suspension et purifier UCMSCs
Pénicilline/Streptomycine	Procell Life Science	PB180120	Culture d’UCMSCs
Pentobarbital sodique	Sigma	P3761	Anesthésie animale
Polysporin	Pfizer		Prevent eye dry
Microscope électronique à balayage	Hitachi	s-4800	Observation MEB
Ciseaux	JZ	Y00030	Incision chirurgicale animale
Plaque à six puits Thermo		140675	Culture des UCMSCs
Stitch	Jinhuan	F603	Fermer les plaies
Suture	Xy	4-0	Fermer les plaies
Équipement thermostatique	Grant	v-0001-0005	Bain
UCMSCs	Bai’ao& nbsp ;	UKK220201	Commercialement UCMSCs
Vitamine C	Diyibio	DY40138-25g	Agrégat induisant le
xylène	SCR	10023418	Agrégat déshydraté