Suivi de la dynamique des variantes structurelles dans les populations expérimentalement évoluées

Summary

Nous avons développé une méthode rentable pour suivre la dynamique des allèles de polymorphisme non nucléotidique qui peut facilement être adaptée aux archives congelées de l’évolution expérimentale. Une technique de PCR triplet a été couplée à une électrophorèse capillaire parallèle automatisée pour quantifier la fréquence relative d’un allèle d’insertion au cours de l’évolution expérimentale.

Abstract

On sait maintenant que les variantes structurelles (SV) (c.-à-d. les délétions, les insertions, les duplications et les inversions) jouent un rôle important dans la variation phénotypique et, par conséquent, dans des processus tels que la détermination de la maladie ou l’adaptation à un nouvel environnement. Cependant, les variantes mononucléotidiques reçoivent beaucoup plus d’attention que les SV, probablement parce qu’elles sont plus faciles à détecter et que leurs effets phénotypiques sont plus faciles à prévoir. Le développement de technologies de séquençage profond à lecture courte et longue a fortement amélioré la détection des SV, mais la quantification de leur fréquence à partir des données de séquençage groupé (poolseq) est encore techniquement complexe et coûteuse.

Ici, nous présentons une méthode plutôt simple et peu coûteuse, qui permet aux chercheurs de suivre la dynamique de la fréquence des allèles SV. À titre d’exemple d’application, nous suivons la fréquence d’insertion d’une séquence d’insertion (SI) dans des populations expérimentales d’évolution bactérienne. Cette méthode est basée sur la conception de triplets d’amorces autour des bordures de variantes structurelles, de sorte que les amplicons produits par amplification des allèles de type sauvage (WT) et dérivés diffèrent en taille d’au moins 5%, et que leur efficacité d’amplification est similaire. La quantité de chaque amplicon est ensuite déterminée par électrophorèse capillaire parallèle et normalisée à une courbe d’étalonnage. Cette méthode peut être facilement étendue à la quantification de la fréquence d’autres variantes structurelles (délétions, duplications et inversions) et aux approches pool-seq des populations naturelles, y compris les populations pathogènes intra-hospitalisées.

Introduction

Les variantes structurelles (SV) sont des altérations de la séquence génomique, affectant généralement 50 pb ou plus. Les quatre catégories de SV décrites sont les grandes insertions, les suppressions importantes, les inversions et les duplications. Jusqu’à récemment, on accordait plus d’attention aux variantes mononucléotidiques (SNV) qu’aux variantes structurelles, en termes d’effets phénotypiques et de leur rôle en tant que déterminants génétiques de la maladie, ou de leur contribution à l’adaptation. C’est probablement parce qu’il est plus facile de détecter les SNV et de prédire leurs effets phénotypiques. Cependant, les technologies de séquençage profond à lecture courte et longue ont fortement amélioré la détection des SV, au moins dans les génomes individuels ou clonaux¹. En parallèle, leurs effets phénotypiques ont été mieux caractérisés, et de nombreux exemples de leur implication en tant que déterminants génétiques de la maladie humaine ^2,3 ou de l’adaptation à un nouvel environnement⁴ ont été documentés.

Les délétions et les insertions, souvent dues à des insertions d’éléments génétiques mobiles (MGE), sont beaucoup plus perturbatrices que les polymorphismes mononucléotidiques (SNP) et entraînent des mutations par décalage de trame et des modifications de la structure des protéines. Les délétions et les insertions de MGE dans les gènes entraînent presque toujours l’inactivation des gènes, et les insertions dans des régions non codantes peuvent entraîner une répression ou une expression constitutive de gènes adjacents lorsque les séquences d’insertion (SI) contiennent des séquences promotrices ou de terminaison⁵. Alors que l’élimination des gènes essentiels entraîne des effets néfastes évidents sur la condition physique bactérienne, la perte de gènes non essentiels est bénéfique dans certains cas. Malgré leurs coûts inhérents, les duplications peuvent également être avantageuses et participer à l’adaptation car elles entraînent un changement de dosage des gènes; Une augmentation de l’activité d’une protéine spécifique peut être avantageuse selon les conditions⁶.

Les populations d’évolution expérimentale microbienne sont généralement commencées avec des clones. Cette absence initiale de diversité génétique, combinée à la caractéristique « environnement fermé » des éprouvettes, conduit à un potentiel très limité d’évolution par gain de gènes par transfert horizontal de gènes et recombinaison de gènes. Dans ces conditions spécifiques, la contribution à l’adaptation des délétions, des duplications et de l’insertion intragénomique de MGE est particulièrement importante; Les bactéries s’adaptent souvent par des mutations de perte de fonction (principalement dues à des délétions ou à des insertions de MGE), affectant des gènes qui ne sont pas utiles dans des environnements artificiels de monoculture stables, souvent riches en nutriments⁷. Dans l’expérience d’évolution d’E. coli la plus longue, les insertions d’IS150 sont particulièrement fréquentes parmi les populations ayant évolué après 50 000 générations, les éléments IS représentant 35% des mutations qui atteignent une fréquence élevée dans les populations qui conservent leur taux de mutation ponctuelle ancestral⁸.

Les études d’évolution et de reséquence associent les technologies d’évolution expérimentale et de séquençage de nouvelle génération (NGS) pour étudier comment les bactéries s’adaptent, aux niveaux phénotypique et génomique, à différentes conditions et contraintes environnementales, telles que différentes sources de carbone et d’énergie, les antibiotiques et le stress osmotique 9,10,11 . Ces études obtiennent généralement des informations génomiques sur les populations évoluées ou les clones uniquement au point final expérimental et, dans certains cas, à un certain nombre de points temporels intermédiaires^12,13,14. Ces données donnent un aperçu des gènes et des voies impliqués dans l’adaptation à un environnement donné, mais permettent rarement aux chercheurs de suivre la dynamique des allèles émergents et balayants de novo au fil du temps.

Une approche pour suivre ces dynamiques consiste à choisir un nombre limité d’allèles ségrégateurs d’intérêt (en raison de la fonction des gènes qu’ils affectent, parce qu’ils balayent en parallèle dans des populations indépendantes, etc.) et à utiliser le séquençage d’amplicon pour quantifier la proportion d’allèles, en regroupant de nombreux points temporels dans le même séquençage¹⁵. Cette méthode a été utilisée avec succès pour suivre la dynamique de variantes de petite taille (SNP ou indels de 1 pb) dans des populations expérimentales^{de microbes 16} et^{naturelles 17} . Cependant, dans le cas d’insertions plus grandes ou d’insertions MGE, la différence de taille des amplicons induit des différences d’efficacité de PCR, ce qui fausse la relation entre les proportions de lecture et d’allèle. Dans certains cas, la différence de taille entre les deux allèles est supérieure à la longueur classique de l’amplicon. Ici, nous avons couplé une technique de PCR triplet avec une électrophorèse capillaire parallèle automatisée pour quantifier la fréquence relative d’un allèle d’insertion basé sur la discrimination de taille. Cette approche permet d’exploiter des points temporels expérimentaux sous-utilisés pour déterminer la dynamique d’un allèle mutant émergent et suivre sa fréquence de fixation ou de perte, de manière rentable. Nous avons appliqué cette méthode pour suivre les allèles mutS^- émergents, mutés par insertion IS10, fournissant au génotype muté un phénotype hypermutateur.

Cette méthode nécessite deux allèles cibles avec une différence de taille de ≥5%. Tout d’abord, les triplets d’amorce sont conçus pour produire des fragments de taille similaire, qui partagent une amorce commune. Deuxièmement, les conditions de PCR sont optimisées et une courbe d’étalonnage est produite à l’aide de mélanges d’ADNg de type sauvage (WT) et mutant. Enfin, les échantillons sont amplifiés par PCR, et la fréquence relative de chaque allèle est quantifiée par électrophorèse capillaire quantitative parallèle.

Protocol

La mise en place de ce protocole nécessite une connaissance précise du point d’insertion, de suppression, d’inversion ou de duplication au sein de la séquence ancestrale. Cette information est généralement obtenue par séquençage du génome entier (WGS) des échantillons terminaux ou intermédiaires. Dans le protocole suivant, le principe général pour le cas d’une mutation d’insertion est donné pour chaque étape, à côté d’un cas représentatif où la fréquence d’une insertion IS10 dans le gène mutS dans une population expérimentale d’évolution d’E. coli est suivie. Dans cette population, le séquençage pangénomique de la population finale a identifié l’insertion d’un IS10 de 1 329 pb entre les positions 2 463 et 2 471, ce qui a entraîné la duplication de ce site d’insertion. Cette méthode est applicable aux trois autres types de SV, et les spécificités de chaque cas sont données dans la discussion.

1. Conception d’amorces triplets

1. Utiliser des pratiques classiques de conception d’amorces (18-24 pb, 40 % à 60 % de teneur en GC, début/fin avec paires G/C si possible, différence T_m < 5 °C) pour produire les amorces FW1 et RV1. Concevoir des amorces pour amplifier un amplicon court sur l’allèle WT autour du site d’insertion de l’allèle mutant (Figure 1).
   REMARQUE: La taille de l’amplicon peut aller de 100 pb à 3 000 pb, conformément à l’échelle de taille de l’ADN utilisée dans l’électrophorèse capillaire. Dans cet exemple, un amplicon de 155 pb a été amplifié. La petite taille de fragment choisie ici empêche l’amplification hors cible de l’ensemble de la séquence d’insertion IS10 (voir section 2).
2. Concevoir une deuxième amorce FW2 avant dans la séquence d’insertion, pour produire une deuxième amplicône qui est environ 5% plus grande ou plus petite que l’amplicône WT (Figure 1). Cette différence de taille de 5% est la différence de taille minimale que le dispositif d’électrophorèse capillaire parallèle pourrait distinguer de manière fiable. Par conséquent, concevez les amorces de manière à ce que les deux amplicons aient une différence de taille, qui est supérieure mais aussi proche que possible du seuil relatif.
   NOTE: Assurez-vous de minimiser la différence T_m et la formation de dimères d’amorce. Dans cet exemple, une deuxième amorce avant a été conçue pour produire un amplicon de 226 pb, 71 pb plus grand que l’amplicon WT. Dans cet exemple représentatif, les séquences d’amorces sont les suivantes :
   FW1:AAAGCATTTCGCCGAACGCC
   RV1: GCGATAAATCCACTCCAGCGCC
   FW2: AGTTCGCTTAGGCATGGAAG

Figure 1 : Schéma de conception de l’amorce triplet sur le gène mutS WT et l’insertion mutante mutS IS10. Le triangle noir représente le site d’insertion IS10 dans le gène mutS. Le gène WT est en bleu et l’IS10 en orange. Les amorces FW1 et RV1 marquent le site d’insertion de l’IS10 et produisent un amplicon WT de 155 pb. L’amorce RV1 et l’amorce intra-IS10 FW2 produisent une deuxième amplicon de 226 pb. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Optimisation des conditions de PCR

1. Cultivez une culture nocturne de clones WT fixes et allèles mutants.
2. Extraire l’ADN à l’aide de n’importe quel kit.
3. Quantifier l’ADN.
4. Préparer l’échantillon d’ADN en diluant l’extraction de WT et d’ADN mutant à 5 ng / μL. Mélanger les deux échantillons d’ADN dans un rapport 50/50.
5. Amplifier 10 ng des trois échantillons d’ADN (WT, mutant, mélange 50/50) à l’aide d’un mélange maître PCR 2x prêt à l’emploi, d’un apprêt FW1 0,5 μM, d’un apprêt RV1 1 μM et d’un apprêt FW2 0,5 μM dans un volume de réaction de 20 μL. Utilisez un gel d’agarose à 2% pour migrer le produit PCR par électrophorèse classique et déterminez les conditions optimales de PCR.
   REMARQUE: Les temps d’allongement doivent être minimisés pour empêcher la formation de l’amplicon FW1 et RV1 sur l’allèle mutant. La température de recuit doit être ajustée pour minimiser l’amplification biaisée des allèles et l’amplification non spécifique.
   1. Pour suivre le programme dans cet exemple, utilisez les paramètres suivants : 98 °C pendant 10 s, suivi de 25 cycles de 98 °C pendant 1 s, 58 °C pendant 15 s, 72 °C pendant 8 s et un dernier pas d’allongement à 72 °C pendant 1 min.
      NOTE: Le temps d’allongement a été réduit à 8 s pour empêcher l’amplification du produit de > 1 000 pb de l’amorce avant et de l’amorce RV1 sur l’allèle mutant (mutS avec insertion IS10).

3. Courbe d’étalonnage

1. Mélanger les deux échantillons d’ADN, WT et mutant, dans des rapports 10/90, 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25 et 90/10.
   REMARQUE : Les réplications biologiques sont préparées à partir de cultures bactériennes indépendantes pendant la nuit.
2. Amplifier à l’aide de conditions de PCR optimisées (voir rubrique 2).
3. Quantifier le produit amplicon.
4. Diluer les produits de PCR à 0,1 ng/μL.
5. Préparez l’instrument d’électrophorèse capillaire parallèle.
   1. Mélanger le gel frais et le colorant (trousse d’analyse quantitative NGS (22, 33 ou 55); Fragment HS NGS 1-6,000 bp pour cet exemple).
      REMARQUE: Voir le guide des fragments NGS HS pour l’électrophorèse capillaire parallèle pour obtenir des instructions détaillées (voir le tableau des matériaux).
6. Remplacez la solution de stockage capillaire et le tampon d’entrée, et placez la plaque tampon de rinçage dans les emplacements corrects du tiroir de l’instrument d’électrophorèse capillaire parallèle.
7. Ajouter 2 μL de marqueur de diluant HS à 22 μL de chaque échantillon dilué dans une plaque de 96 puits.
8. Ajoutez une échelle de taille (échelle de taille d’ADN; plage de 1 à 6 000 pb) d’un kit d’analyse quantitative HS NGS à un puits de la plaque de 96 puits.
9. Placez la plaque à 96 puits dans le tiroir approprié de l’instrument d’électrophorèse capillaire parallèle et sélectionnez Exécuter sur le logiciel de l’instrument d’électrophorèse capillaire parallèle.
10. Analysez les résultats à l’aide du logiciel d’analyse de données, qui détecte et identifie chaque pic de l’échelle de taille, en attribuant chaque pic des échantillons à leur taille réelle connue.
    1. Lorsque vous utilisez un kit quantitatif, utilisez le logiciel pour déterminer la quantité d’ADN de chaque fragment en intégrant la zone sous le pic, comme dans l’analyse des données chromatographiques. Encore une fois, comparez les échantillons avec les quantités connues dans les étalons pour quantifier chaque pic d’un échantillon et calculez les rapports entre les différents pics détectés dans les échantillons.
    2. Construire une courbe d’étalonnage (Figure 2), reliant la proportion connue de l’allèle mutant (mélange d’ADN) à celle mesurée à l’aide de l’instrument d’électrophorèse capillaire parallèle. Cette courbe d’étalonnage permet d’évaluer la fiabilité de la méthode et de corriger un biais d’amplification mineur.

4. Préparation des échantillons

1. Cultivez des échantillons ponctuels pendant la nuit dans des conditions standard.
2. Extraire l’ADN.
3. Quantifier l’ADN.
4. Amplifier les échantillons en utilisant des conditions de PCR optimisées (voir rubrique 2).
5. Exécutez les échantillons dans l’instrument d’électrophorèse capillaire parallèle (voir étapes 3.5-3.10).

5. Quantification des allèles

1. Extrayez les quantités d’allèles mutants des données de l’instrument d’électrophorèse capillaire parallèle avec le logiciel et calculez les proportions réelles en traçant ces valeurs sur la courbe d’étalonnage.

Results

En utilisant l’ADN extrait d’un clone ancestral et d’un clone hypermutateur isolé de la population S2.11 à la génération 1 000, nous avons établi la courbe d’étalonnage illustrée à la figure 2. Les proportions mutantes réelles provenant de mélanges d’ADN préparés en laboratoire et mesurées par l’instrument d’électrophorèse capillaire parallèle ont été liées par une relation linéaire de pente 1,0706, avec un R² de 0,9705. De plus, il y avait une bonne concordance entre les réplicat...

Discussion

Ici, nous avons proposé une méthode rentable qui permet de suivre la dynamique des allèles SV adaptatifs émergents dans les populations expérimentales de l’évolution. Cette méthode associe des techniques classiques de PCR et une électrophorèse capillaire parallèle automatisée, ce qui permet de déterminer les quantités relatives de deux allèles. Une fois mis en place, il permet de quantifier les proportions d’allèles dans de nombreux échantillons en parallèle, et est beaucoup moins coûteux que WGS. Cette méthode peut être...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Plaque PCR bien jupe	4titude	4Ti - 0740	PCR
Agarose biologie moléculaire grade	Eurogentec	EP-0010-05	Électrophorèse sur gel d’agarose  ;
Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Guide rapide pour les systèmes d’analyse de fragments	d’instructions PDF	Agilent
Buffer TBE	Panreac appliChem	A4228,5000Pc	Agarose gel electrophorèse  ;
Boucles et aiguilles d’inoculation jetables calibrées	LABELIANS	8175CSR40H	Culture bactérienne
Kit de sang et de tissus Dneasy	Qiagen	69506	Extraction d’ADN
par électrophorèse	Amilabo	ST606T	Électrophorèse sur gel d’agarose  ;
Analyseur de fragments Système CE automatisé	Agilent		Électrophorèse capillaire parallèle
Échelle d’ADN fragmentaire	Agilent	DNF-396, gamme 1-6000bp	Électrophorèse capillaire parallèle
BIORÉACTIF DE SEL DE SULFATE DE GENTAMICINE	Sigma-Aldrich	G1264-1G	Culture bactérienne
Marqueur diluant haute sensibilité	Agilent	DNF-373	Capillaire parallèle électrophorèse
Haute sensibilité Kit d’analyse quantitative NGS	Agilent	DNF-474	Électrophorèse capillaire parallèle
Charge rapide échelle 1 kb plus échelle d’ADN	NEB	N0469S	Électrophorèse sur gel d’agarose  ;
LB Bouillon, VegitoneNutriSelect Plus	Millipore	28713	Culture bactérienne
Master Mix PCR Haute Fidélité Phusion Flash	Thermo Fisher Scientific	F548L
Amorces	Eurogentec		PCR
Logiciel d’analyse de données Prosize v.4	Agilent	V.4	Électrophorèse capillaire parallèle
Qubit dosages	Invitrogen	MAN0010876	quantification de l’ADN
Qubit dsDNA HS Assay Kit	LIFE TECHNOLOGIES SAS	Q32854	Quantification de l’ADN
Thermocycleur	Eppendorf	Ep gradients	PCR
UVbox, eBOX VX5	Vilber Lourmat		Visualisation par électrophorèse sur gel d’agarose
Eau pour préparation injectable	Aguettant	PROAMP	PCR