Suivi de la dynamique des variantes structurelles dans les populations expérimentalement évoluées

Summary

Nous avons développé une méthode rentable pour suivre la dynamique des allèles de polymorphisme non nucléotidique qui peut facilement être adaptée aux archives congelées de l’évolution expérimentale. Une technique de PCR triplet a été couplée à une électrophorèse capillaire parallèle automatisée pour quantifier la fréquence relative d’un allèle d’insertion au cours de l’évolution expérimentale.

Abstract

On sait maintenant que les variantes structurelles (SV) (c.-à-d. les délétions, les insertions, les duplications et les inversions) jouent un rôle important dans la variation phénotypique et, par conséquent, dans des processus tels que la détermination de la maladie ou l’adaptation à un nouvel environnement. Cependant, les variantes mononucléotidiques reçoivent beaucoup plus d’attention que les SV, probablement parce qu’elles sont plus faciles à détecter et que leurs effets phénotypiques sont plus faciles à prévoir. Le développement de technologies de séquençage profond à lecture courte et longue a fortement amélioré la détection des SV, mais la quantification de leur fréquence à partir des données de séquençage groupé (poolseq) est encore techniquement complexe et coûteuse.

Ici, nous présentons une méthode plutôt simple et peu coûteuse, qui permet aux chercheurs de suivre la dynamique de la fréquence des allèles SV. À titre d’exemple d’application, nous suivons la fréquence d’insertion d’une séquence d’insertion (SI) dans des populations expérimentales d’évolution bactérienne. Cette méthode est basée sur la conception de triplets d’amorces autour des bordures de variantes structurelles, de sorte que les amplicons produits par amplification des allèles de type sauvage (WT) et dérivés diffèrent en taille d’au moins 5%, et que leur efficacité d’amplification est similaire. La quantité de chaque amplicon est ensuite déterminée par électrophorèse capillaire parallèle et normalisée à une courbe d’étalonnage. Cette méthode peut être facilement étendue à la quantification de la fréquence d’autres variantes structurelles (délétions, duplications et inversions) et aux approches pool-seq des populations naturelles, y compris les populations pathogènes intra-hospitalisées.

Introduction

Les variantes structurelles (SV) sont des altérations de la séquence génomique, affectant généralement 50 pb ou plus. Les quatre catégories de SV décrites sont les grandes insertions, les suppressions importantes, les inversions et les duplications. Jusqu’à récemment, on accordait plus d’attention aux variantes mononucléotidiques (SNV) qu’aux variantes structurelles, en termes d’effets phénotypiques et de leur rôle en tant que déterminants génétiques de la maladie, ou de leur contribution à l’adaptation. C’est probablement parce qu’il est plus facile de détecter les SNV et de prédire leurs effets phénotypiques. Cependant, les technologies de séquençage profond à lectu....

Protocol

La mise en place de ce protocole nécessite une connaissance précise du point d’insertion, de suppression, d’inversion ou de duplication au sein de la séquence ancestrale. Cette information est généralement obtenue par séquençage du génome entier (WGS) des échantillons terminaux ou intermédiaires. Dans le protocole suivant, le principe général pour le cas d’une mutation d’insertion est donné pour chaque étape, à côté d’un cas représentatif où la fréquence d’une insertion IS10 dans le gène mutS dans une population expérimentale d’évolution d’E. coli est suivie. Dans cette population, le séquençage pangénomique de la population finale a identifié l’inse....

Results

En utilisant l’ADN extrait d’un clone ancestral et d’un clone hypermutateur isolé de la population S2.11 à la génération 1 000, nous avons établi la courbe d’étalonnage illustrée à la figure 2. Les proportions mutantes réelles provenant de mélanges d’ADN préparés en laboratoire et mesurées par l’instrument d’électrophorèse capillaire parallèle ont été liées par une relation linéaire de pente 1,0706, avec un R² de 0,9705. De plus, il y avait une bonne concordance entre les réplicat.......

Discussion

Ici, nous avons proposé une méthode rentable qui permet de suivre la dynamique des allèles SV adaptatifs émergents dans les populations expérimentales de l’évolution. Cette méthode associe des techniques classiques de PCR et une électrophorèse capillaire parallèle automatisée, ce qui permet de déterminer les quantités relatives de deux allèles. Une fois mis en place, il permet de quantifier les proportions d’allèles dans de nombreux échantillons en parallèle, et est beaucoup moins coûteux que WGS. Cette méthode peut être.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Plaque PCR bien jupe	4titude	4Ti - 0740	PCR
Agarose biologie moléculaire grade	Eurogentec	EP-0010-05	Électrophorèse sur gel d’agarose  ;
Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Guide rapide pour les systèmes d’analyse de fragments	d’instructions PDF	Agilent
Buffer TBE	Panreac appliChem	A4228,5000Pc	Agarose gel electrophorèse  ;
Boucles et aiguilles d’inoculation jetables calibrées	LABELIANS	8175CSR40H	Culture bactérienne
Kit de sang et de tissus Dneasy	Qiagen	69506	Extraction d’ADN
par électrophorèse	Amilabo	ST606T	Électrophorèse sur gel d’agarose  ;
Analyseur de fragments Système CE automatisé	Agilent		Électrophorèse capillaire parallèle
Échelle d’ADN fragmentaire	Agilent	DNF-396, gamme 1-6000bp	Électrophorèse capillaire parallèle
BIORÉACTIF DE SEL DE SULFATE DE GENTAMICINE	Sigma-Aldrich	G1264-1G	Culture bactérienne
Marqueur diluant haute sensibilité	Agilent	DNF-373	Capillaire parallèle électrophorèse
Haute sensibilité Kit d’analyse quantitative NGS	Agilent	DNF-474	Électrophorèse capillaire parallèle
Charge rapide échelle 1 kb plus échelle d’ADN	NEB	N0469S	Électrophorèse sur gel d’agarose  ;
LB Bouillon, VegitoneNutriSelect Plus	Millipore	28713	Culture bactérienne
Master Mix PCR Haute Fidélité Phusion Flash	Thermo Fisher Scientific	F548L
Amorces	Eurogentec		PCR
Logiciel d’analyse de données Prosize v.4	Agilent	V.4	Électrophorèse capillaire parallèle
Qubit dosages	Invitrogen	MAN0010876	quantification de l’ADN
Qubit dsDNA HS Assay Kit	LIFE TECHNOLOGIES SAS	Q32854	Quantification de l’ADN
Thermocycleur	Eppendorf	Ep gradients	PCR
UVbox, eBOX VX5	Vilber Lourmat		Visualisation par électrophorèse sur gel d’agarose
Eau pour préparation injectable	Aguettant	PROAMP	PCR