Application d’AlDeSense pour stratifier les cellules cancéreuses de l’ovaire en fonction de l’activité de l’aldéhyde déshydrogénase 1A1

Résumé

Les méthodes de mesure de l’activité de l’ALDH1A1 dans les cellules vivantes sont essentielles dans la recherche sur le cancer en raison de son statut de biomarqueur de la souches. Dans cette étude, nous avons utilisé une sonde fluorogénique sélective isoforme pour déterminer les niveaux relatifs d’activité ALDH1A1 dans un panel de cinq lignées cellulaires de cancer de l’ovaire.

Résumé

La rechute après un traitement anticancéreux est souvent attribuée à la persistance d’une sous-population de cellules tumorales appelées cellules souches cancéreuses (CSC), qui se caractérisent par leur remarquable capacité d’initiation tumorale et d’auto-renouvellement. Selon l’origine de la tumeur (par exemple, les ovaires), le profil de biomarqueur de surface du CSC peut varier considérablement, ce qui rend l’identification de ces cellules par coloration immunohistochimique une entreprise difficile. Au contraire, l’aldéhyde déshydrogénase 1A1 (ALDH1A1) est apparue comme un excellent marqueur pour identifier les CSC, en raison de son profil d’expression conservé dans presque toutes les cellules progénitrices, y compris les CSC. L’isoforme ALDH1A1 appartient à une superfamille de 19 enzymes responsables de l’oxydation de divers aldéhydes endogènes et xénobiotiques en produits d’acide carboxylique correspondants. Chan et al. ont récemment développé AlDeSense, une sonde isoforme-sélective pour la détection de l’activité ALDH1A1, ainsi qu’un réactif de contrôle d’appariement non réactif (Ctrl-AlDeSense) pour tenir compte de la coloration hors cible. Cet outil sélectif des isoformes s’est déjà avéré être un outil chimique polyvalent grâce à la détection de l’activité de l’ALDH1A1 dans les cellules leucémiques myéloïdes K562, les mammosphères et les xénogreffes CSC dérivées du mélanome. Dans cet article, l’utilité de la sonde a été démontrée par des expériences supplémentaires de fluorimétrie, de microscopie confocale et de cytométrie en flux où l’activité relative de l’ALDH1A1 a été déterminée dans un panel de cinq lignées cellulaires de cancer de l’ovaire.

Introduction

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont une sous-population de cellules tumorales qui présentent des propriétés semblables à celles des cellules souches¹. À l’instar de leurs homologues non cancéreux, les CSC possèdent une capacité extraordinaire de se renouveler et de proliférer. Avec d’autres mécanismes intégrés, tels que la régulation positive des transporteurs de cassettes liant l’ATP, les CSC sont souvent épargnés par les efforts initiaux de réduction tumorale chirurgicale, ainsi que par le traitement adjuvant ultérieur². En raison de leur rôle essentiel dans la résistance au traitement³,....

Protocole

1. Mesurer l’activité totale de l’ALDH1A1 dans les homogénats de cellules cancéreuses de l’ovaire par fluorimétrie

1. Décongeler 1 × 10⁶ cellules dans une fiole de culture cellulaire T25 dans 5 mL des milieux de culture cellulaire suivants :
   1. IGROV-1 et PEO4: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S).
   2. BG-1 et Caov-3 : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) avec 10% FBS et 1% P/S.
   3. OVCAR-3 : RPMI 1640 avec 20 % de FBS, 1 % P/S et 0,01 mg/mL d’insuline.
2. Maintenir les cellules dans un inc....

Résultats

Activité totale de l’ALDH1A1 des homogénats de cellules cancéreuses de l’ovaire
Les activations moyennes de pli pour chaque lignée cellulaire obtenue à partir de ce test sont les suivantes: BG-1 (1,12 ± 0,01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1,72 ± 0,06); PEO4 (2,51 ± 0,29); et OVCAR-3 (10,25 ± 1,46) (figure 2).

Discussion

La pansélectivité est une limitation majeure de nombreuses sondes ALDH ; Cependant, plusieurs exemples sélectifs d’isoformes ont récemment été rapportés 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. La .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
; 0,25 % de trypsine, 0,1 % d’EDTA dans le HBSS sans calcium, magnésium et bicarbonate de sodium	Corning	.   ; 25-050-CI
1x Tampon phosphate salin	Corning	21-040-CMX12
AccuSpin Micro 17R	Fisher Scientific	13-100-675
AlDeSense			synthétisé en interne
BG-1			Un cadeau offert par le Prof. Paul Hergenrother Lab, Université de l’Illinois Urbana-Champaign
BioLite 25cm2 Gourde	Thermo Fisher Scientific  ;
Enceinte de biosécurité 1300 série A2	Thermo Fisher Scientific  ;
Caov-3			Un don offert par le Prof. Erik Nelson Lab, Université de l’Illinois Urbana-Champaign
Homogénéisateur de cellules	Fisher
Scientific Centrifuge 5180R	Eppendorf	22627040
Contrl-AlDeSense			synthétisé en interne
, 10 % FBS, 1 % P/S			Préparé par la cellule UIUC
Falcon Tubes à essai en polystyrène à fond rond avec filtre à cellules, 5 ml	Corning	352003
FCS Express 6			Fourni par UIUC CMtO
FL microscope	EVOS
Fluoromètre	Photon Technology International
Forma Series II Enveloppe d’eau CO2  ; Incubateur	Fisher Scientific	3110
IGROV-1			Un don offert par le Prof. Erik Nelson Lab, Université de l’Illinois Urbana-Champaign
ImageJ	NIH
Innova 42R Incubated Shaker
LSM 700	Zeiss
LSR II	BD
Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Système de Couvre-Vitrage Borosicilate	Thermo Fisher Scientific  ;
OVCAR-3	ATCC	HTB-161
PEO4			Un cadeau offert par le Prof. Erik Nelson Lab, Université de l’Illinois Urbana-Champaign
Pierce Inhibiteur de protéase	Comprimés Thermo Scientific	A32963
Poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
Rocker	VWR
RPMI, 10 % FBS, 1 % P/S	Préparé par l’installation de milieux cellulaires
RPMI, 20 % FBS, 1 % P/S, 0,01 mg/mL Insuline			Préparé par l’installation de milieux cellulaires de l’UIUC

130189 DMEM 155383 de l’UIUC