Explorer la stratégie de combinaison de deux herbes pour traiter les cellules PC12 blessées

Résumé

Ce protocole fournit une stratégie de combinaison de deux herbes pour traiter les cellules PC12 blessées. Le protocole fournit une référence pour optimiser le meilleur mode d’application de la médecine traditionnelle chinoise (MTC).

Résumé

Compte tenu des avantages de la combinaison de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) dans le traitement de l’ischémie cérébrale, nous avons étudié les différences d’efficacité et de mécanisme entre la combinaison de préparation et la combinaison de composants afin d’explorer la stratégie de combinaison à deux herbes pour traiter les cellules PC12 blessées. Le chlorure de cobalt (CoCl₂) combiné à un milieu sans glucose a été utilisé pour induire des dommages oxydatifs des cellules PC12. Ensuite, la combinaison optimale d’Astragalus mongholicus (Ast) et d’Erigeron breviscapus (Eri) injection a été sélectionnée et combinée selon des méthodes de conception uniformes après criblage de leur concentration sûre et efficace sur les cellules PC12. En outre, la combinaison de composants criblés comprend 10 μM d’astragaloside A, 40 μM de scutellarine et 75 μM d’acide chlorogénique dans deux herbes. Ensuite, le MTT, l’annexine V-FITC/PI, l’immunofluorescence et l’analyse par transfert Western ont été utilisés pour évaluer l’efficacité et le mécanisme de la combinaison de préparations et de la combinaison de composants sur les cellules PC12 lésées. Les résultats ont montré que la combinaison de préparation optimale pour la survie cellulaire pro-était l’injection d’Ast et la capsule d’Eri avec une concentration de 6: 1,8 (μM). La combinaison de composants (10 μM d’astragaloside A, 40 μM de scutellarin, et 75 μM d’acide chlorogénique) était plus efficace que la combinaison de préparation. Les deux combinaisons ont remarquablement réduit le taux apoptotique, l’intensité de fluorescence de la caspase-3 et le niveau intracellulaire d’espèces réactives de l’oxygène (ROS); pendant ce temps, ils ont régulé à la hausse les niveaux d’expression de p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax et Nrf2. Ces effets étaient plus évidents dans la combinaison de composants. En conclusion, les deux combinaisons peuvent inhiber la lésion induite par CoCl₂ combiné avec un milieu sans glucose sur les cellules PC12, favorisant ainsi la survie cellulaire. Cependant, l’efficacité de la combinaison de composants par rapport à la combinaison de préparation peut être due à sa régulation plus forte de la voie de signalisation PI3K / Akt / Nrf2 liée au stress oxydatif et à l’apoptose.

Introduction

L’ischémie cérébrale chronique, causée par l’hypoperfusion cérébrale, est une maladie fréquente chez les personnes d’âge moyen et les personnes âgées¹. En tant que maladie d’ischémie occulte à long terme, elle peut entraîner un dysfonctionnement neurologique progressif ou persistant. Les principaux mécanismes pathologiques comprennent l’apoptose cellulaire et les dommages oxydatifs, conduisant à un dysfonctionnement neurologique progressif ou persistant; c’est la base pathologique de la maladie d’Alzheimer, de la démence vasculaire et d’autres maladies, et affecte gravement la qualité de vie des patients. Cependant, il y a encore un manque de m....

Protocole

1. Préparation du réactif

1. Préparer le milieu complet en ajoutant 90 mL de DMEM à teneur élevée en sucre, 10 mL de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 mL de solution de pénicilline-streptomycine dans une fiole de culture stérile de 125 mL. Mélanger le milieu complet et conserver à 4 °C dans des conditions fermées.
2. Préparer la solution de CoCl 2 en ajoutant 0,02 g de poudre de CoCl₂ (pesée avec précision) dans 10 mL de milieu sans sucre DMEM (complètement dissous) pour obtenir une solution mère de 8,4 mM. Filtrer la solution avec un filtre bactérien de 0,22 μm, la sceller et la conserver à 4 °C à l’abri de la lumière.<....

Résultats

Le dépistage de la combinaison optimale d’Ast injection et de capsule Eri est illustré à la figure 1. Le taux de survie cellulaire de l’injection d’Ast et de la capsule Eri sur les cellules PC12 normales est illustré à la figure 1A. La viabilité cellulaire était inférieure à 95 % avec l’injection d’Ast à des concentrations supérieures à 12 μM (figure 1A) et la capsule Eri à des concentrations supérieures à 5 μM (figure 1A), ce qui i.......

Discussion

Il y a encore un manque de médicaments idéaux pour le traitement de l’ischémie cérébrale dans la pratique clinique moderne². Sous la direction de la supplémentation en qi et de l’activation de la méthode de circulation sanguine, Ast, Eri et d’autres préparations ont été utilisés en combinaison dans la pratique clinique de la MTC et ont obtenu de bons avantages complets^13,14,15. Un grand nombre d’études on.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Enceinte de biosécurité de classe II série 1300	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	1374
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromide de	Guangzhou saiguo biotech Company	1334GR001	MTT
ACEA NovoExpress  ; 1.4.0	ACEA Biosciences,	Inc-Akt
	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	10176-2-AP
Cytométrie analytique en flux	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	62-2-1810-1027-0
Annexine V-FITC kit de détection de l’apoptose	Beyotime Biotechnology Company	C1062L
Injection d’astragale	Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company	A03190612144	Ast injection
Astragaloside A	Chongqing Gao Ren Biotechnology Company	84687-43-4
Bax	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	60267-1-Ig
BCA kit de quantification des protéines	Beyotime Biotechnology Company	P0012
Bcl-2	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	26593-1-AP
Incubateurs à dioxyde de carbone	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	0816-2014
Caspase-3	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	19677-1-AP
Acide chlorogénique	Chongqing Gao Ren Biotechnology Company	327-97-9
Chlorure de cobalt hexahydraté	Merck Biotechnology, Inc.	7791-13-1	CoCl2
Dimethyl sulfoxide	Guangzhou saiguo biotech Company	2020112701	DMSO
Disodium hydrogénophosphate dodécahydraté	Chengdu Kolon Chemical Company	2020090101
DMEM high sugar	Thermo scientific Hyclone	2110050
DMEM sans sucre	Entreprise des sciences de la vie Beijing Solarbio
Fluide lumineux ECL	Lianshuo Biological Company	WBKLS0500
Balance électronique	Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, Chine	FA1204
Instrument d’électrophorèse	Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd	1658026
capsule Erigeron breviscapus	Yunnan Biogu Pharmaceutical Company	Z53021671	capsule Eri
Sérum fœtal bovin	Four Seasons Institute of Biological Engineering	20210402	FBS
Microscope fluorescent	Olympms Corporation	IX71-F32PH
Imageur gel	Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd	1708265
Anticorps secondaire anti-souris de chèvre	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	SA00001-1
Anticorps secondaire anti-lapin de chèvre	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	SA00001- 2
IBM SPSS Statistics version 26.0	International Business Machines Corporation, USA-ImageJ
1.8.0	National Institutes of Health, USA-logiciel d’imagerie
Immunol  ; fluorescence  ; kit de coloration	Beyotime Biotechnology Company	P0196
KCl	Chengdu Kolon Chemical Company	2021070901
Marker	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	26616
Lecteur de microplaques	Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.
Microscope inversé Motic	Nanda Scientific Instruments Co.
NaCl	Chengdu Kolon Chemical Company	2014081301
Lait écrémé	Beyotime Biotechnology Company	P0216
Nrf2	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	16396-1-AP
P-Akt	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Cellules PC12	Académie chinoise des sciences
Solution de pénicilline-streptomycine	Thermo scientific Hyclone	SV30010
Mélange d’inhibiteurs de protéase phosphatase	Beyotime Biotechnology Company	P1045
Dihydrogénophosphate de potassium	Chengdu Kolon Chemical Company	2015082901
Kit de dosage des espèces réactives de l’oxygène	Beyotime Biotechnology Company	S0033S
Solution de lyse RI-PA	Beyotime Biotechnology Company	P0013B
Scutellarin	Chongqing Gao Ren Biotechnology Company	27740-01-8
Tampon de chargement d’échantillon SDS-PAGE, 5x	Beyotime Biotechnology Company	P0015L
Embouts filtrants stériles (0.22 µ ; m)	Merck Biotechnology, Inc.
Tris-base	Guangzhou saiguo biotech Company	1115GR500  ;	Tbs
Trypsine	Thermo scientific Hyclone	J190013
Tween-20	Chengdu Kolon Chemical Company	2021051301
Oscillateur vortex	OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, Chine	VXMNAL
&beta ;-actin	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	66009-1-Ig

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