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Article de méthode

Stratégie basée sur CRISPR en une étape pour le marquage des gènes endogènes chez Drosophila melanogaster

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DOI :

10.3791/64729

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26 janvier 2024

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, 3Michigan Neuroscience Institute Affiliate, University of Michigan

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole simplifié de marquage génétique endogène pour la drosophile, qui utilise une technique basée sur la PCR pour l’identification sans marqueur des modifications génétiques réussies, facilitant le développement de lignées d’inclusion stables.

Résumé

L’étude de la localisation, de la dynamique et de la régulation subcellulaires des protéines dans les cellules vivantes a été profondément transformée par l’avènement de techniques permettant le marquage de gènes endogènes pour produire des protéines de fusion fluorescentes. Ces méthodes permettent aux chercheurs de visualiser le comportement des protéines en temps réel, fournissant des informations précieuses sur leurs fonctions et leurs interactions dans l’environnement cellulaire. De nombreuses études actuelles sur le marquage génétique utilisent un processus en deux étapes où les marqueurs visibles, tels que les changements de couleur des yeux, sont utilisés pour identifier les organismes génétiquement modifiés dans la première étape, et le marqueur visible est excisé dans la deuxième étape. Ici, nous présentons un protocole en une étape pour effectuer un marquage génétique endogène précis et rapide chez Drosophila melanogaster, qui permet de dépister des lignées modifiées sans marqueur oculaire visible, offrant un avantage significatif par rapport aux méthodes précédentes. Pour dépister les événements de marquage génétique réussis, nous utilisons une technique basée sur la PCR pour génotyper des mouches individuelles en analysant un petit segment de leur patte médiane. Les mouches qui répondent aux critères de sélection sont ensuite utilisées pour produire des stocks stables. Ici, nous détaillons la conception et la construction des plasmides d’édition CRISPR et les méthodes de criblage et de confirmation des lignées modifiées. Ensemble, ce protocole améliore considérablement l’efficacité du marquage génétique endogène chez la drosophile et permet d’étudier les processus cellulaires in vivo.

Introduction

Les protéines fluorescentes sont devenues des outils puissants pour visualiser la localisation des protéines, la dynamique et les interactions protéine-protéine dans les cellules des organismes vivants 1,2. Le marquage des gènes endogènes avec des protéines fluorescentes permet d’imager en direct à long terme les processus cellulaires avec une résolution subcellulaire. De plus, ces techniques de marquage de gènes endogènes présentent plusieurs avantages par rapport aux approches de surexpression et d’immunomarquage. Par exemple, la surexpression des protéines peut entraîner un mauvais repliement des protéines, des interactions protéine-protéine non spécifiques et une mauvaise localisation3. À ce jour, les chercheurs ont pu créer de vastes bibliothèques de gènes endogènes fusionnés à des protéines fluorescentes pour quelques organismes modèles, tels que la levure bourgeonnante, qui peuvent subir une recombinaison homologue efficace4. Dans le cas de Drosophila melanogaster, divers outils tels que MiMICs5, les pièges amplificateurs à base de transposons6 et les fosmids7 ont été conçus pour marquer les gènes par fluorescence.

Le développement d’outils basés sur CRISPR-Cas9 a permis d’effectuer efficacement l’édition du génome, y compris le marquage des protéines endogènes, dans un large éventail d’organismes modèles 8,9. Cas9 est une enzyme guidée par l’ARN qui clive l’ADN double brin d’une manière très efficace et spécifique8, qui peut ensuite être réparée par une voie de jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) conduisant à des mutations ponctuelles ou à des délétions ponctuelles. Alternativement, la voie de réparation dirigée par homologie (HDR) permet l’intégration de l’ADN hétérologue dans le chromosome.

Les méthodes antérieures de marquage génique basé sur CRISPR dans l’organisme modèle, Drosophila melanogaster, reposaient sur un processus en deux étapes 10,11,12. Cela implique l’utilisation d’un marqueur de couleur des yeux discernable, Dsred, pour détecter les événements HDR réussis. Ensuite, le marqueur Dsred serait excisé à l’aide du système de recombinaison Cre/loxP. Pour rationaliser et accélérer ce processus, nous vous présentons ici une méthode plus simple et plus efficace. Cette approche contourne le besoin de génotypage létal et permet le dépistage direct des mouches individuelles. Plus précisément, nous utilisons une approche basée sur la PCR pour extraire l’ADN d’un petit segment de la patte médiane de la mouche, ce qui nous permet de génotyper des mouches individuelles. Notamment, cette procédure ne compromet pas la vitalité, le mouvement ou les capacités de reproduction de la mouche échantillonnée. Seuls les individus appropriés, identifiés par cette méthode, sont développés en stocks stables.

Nous présentons ici un protocole détaillé pour générer des mouches marquées par des protéines fluorescentes dans lesquelles les gènes endogènes sont marqués avec des rapporteurs fluorescents. Cette technique utilise l’édition du génome CRISPR-Cas9 pour fusionner n’importe quelle étiquette fluorophore souhaitée à la terminaison N ou C d’un gène endogène. Ci-dessous, nous décrivons la conception et la construction de plasmides d’ARNg et d’un plasmide donneur, la stratégie de criblage en une étape pour sélectionner les mouches positives à CRISPR et les étapes pour établir des lignées stables. Plus précisément, nous décrivons des stratégies pour marquer un gène endogène de la drosophile, point final, avec un fluorophore à l’extrémité C-terminale. Nous décrivons également brièvement les expériences de contrôle qui doivent être effectuées pour confirmer que la protéine marquée est fonctionnelle et les techniques d’imagerie en direct pour visualiser la protéine Period dans les neurones de l’horloge vivante dans les cerveaux intacts de la drosophile 13. Le protocole décrit ici est également largement applicable au criblage des candidats pour les délétions et les insertions de morceaux d’ADN spécifiques par édition du génome CRISPR-Cas9.

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Protocole

1. Conception et construction de réactifs d’édition de gènes

NOTE : Pour effectuer un marquage endogène, il est essentiel d’identifier les différentes isoformes du gène souhaité. Selon les objectifs spécifiques de l’expérience, une étiquette fluorescente peut être incorporée soit en interne, soit aux extrémités N ou C de la ou des isoformes de protéines sélectionnées. Pour une édition optimale médiée par CRISPR, il est crucial de positionner les deux ARNsg à proximité du site d’insertion prévu. Par la suite, pour permettre l’édition par recombinaison homologue, un vecteur donneur englobant des séquences homologues au gène cible, ainsi que l’étiquette fluorescente, doit être préparé. Vous trouverez ci-dessous un guide étape par étape de ces processus (Figure 1).

  1. Concevez l’ARNsg comme décrit ci-dessous.
    1. Concevez des ARNsg pour la drosophile à l’aide de ces sites Web : http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ ou http://www.flyrnai.org/crispr2/.
    2. Pour le site Web flycrispr, entrez la séquence ±100 pb autour de l’emplacement d’insertion souhaité (terminal N, terminal C ou tout locus génomique d’intérêt). Si vous utilisez l’attP2 nos-Cas9 comme arrière-plan d’injection, choisissez l’option génomique Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782). Le système Nos-Cas9 assure l’expression de Cas9 spécifique à la lignée germinale.
    3. Pour améliorer l’efficacité de l’expression de l’ARNsg, sélectionnez les cibles CRISPR avec l’option 5' G , car les ARNsg qui commencent par une guanine amélioreront l’activité d’édition. Ensuite, cliquez sur le bouton Trouver des cibles CRISPR . Une liste des séquences d’ARNsg possibles s’affiche.
    4. Pour chaque séquence, cliquez sur le bouton Évaluer . Cette action vérifie toute cible potentielle pour chaque séquence en fonction du génome précédemment sélectionné. Dans la liste fournie, choisissez 2 ARNsg qui ont 0 hors cible. Assurez-vous qu’un ARNsg est en amont et l’autre en aval par rapport à l’emplacement d’insertion. Idéalement, leurs positions devraient être aussi proches que possible du site de frappe (<200 pb), mais elles ne doivent pas se chevaucher (Figure 2).
      REMARQUE : Il peut parfois être difficile de trouver des ARNsg appropriés pour un gène cible donné. L’écart entre les ARNsg et l’emplacement d’apparition peut être augmenté à ± 200 pb. L’utilisation d’ARNsg ne s’initiant pas avec G pourrait légèrement diminuer le taux positif.
  2. Effectuez la sélection des étiquettes fluorescentes comme décrit ci-dessous.
    1. Les étiquettes fluorescentes offrent une gamme variée de caractéristiques, chacune ayant ses avantages et ses inconvénients uniques 1,2. Lorsque vous déterminez l’étiquette fluorescente idéale pour le marquage d’une protéine spécifique, prenez soin des considérations clés décrites dans les étapes suivantes qui entrent en jeu.
    2. Étant donné que les niveaux d’expression des protéines naturelles sont généralement beaucoup plus faibles que ceux observés dans les expériences de surexpression 1,2, commencez par les marqueurs qui sont brillants et photostables et qui correspondent au dispositif expérimental. Certaines étiquettes fluorescentes, en particulier certains appels d’offres comme tdTomato et DsRed, ont tendance à former des multimères14 et peuvent conduire à l’agrégation de protéines.
    3. Pour une plus grande polyvalence, reliez les marqueurs d’épitopes (p. ex., FLAG ou V5) au marqueur fluorescent à l’aide d’un agent de liaison flexible, qui permet des analyses biochimiques telles que Western Blot ou Co-immunoprécipitation.
  3. Pour la conception de l’éditeur de liens, suivez les étapes décrites ci-dessous.
    1. Pour une fonctionnalité optimale, assurez-vous que la protéine endogène d’intérêt et l’étiquette fluorescente se replient séparément dans leurs formes fonctionnelles respectives. Pour y parvenir, utilisez un peptide de liaison allant de 2 à 20 acides aminés de longueur. Par exemple, placez deux résidus de glycine entre le dernier acide aminé de la protéine Period et le premier acide aminé de la protéine fluorescente mNeonGreen.
    2. Assurez-vous que ces séquences peptidiques de liaison comprennent des acides aminés comme la glycine et la sérine, qui confèrent une flexibilité à la structure15. Cela garantit que le comportement naturel et l’emplacement de la protéine endogène restent inchangés.
  4. Concevez le vecteur donneur comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE : Le vecteur donneur introduit l’étiquette fluorescente à l’emplacement endogène souhaité par le processus de réparation dirigée par homologie, qui est initié par clivage CRISPR. Ainsi, en plus de l’étiquette fluorescente, le vecteur donneur doit posséder des séquences homologues des deux côtés de l’étiquette.
    1. Commencez la conception du vecteur donneur en organisant la séquence d’ADN du peptide de liaison et de l’étiquette fluorescente et assurez-vous qu’il y a des séquences homologues flanquant les deux extrémités (bras d’homologie). Pour des résultats optimaux, assurez-vous que les bras d’homologie englobent au moins 800 nucléotides de chaque côté du site d’insertion prévu (Figure 2).
      NOTE : Des rapports récents suggèrent que les bras d’homologie peuvent être plus courts (100-200 pb)16.
    2. Assurez-vous que toutes les séquences PAM dans le plasmide donneur sont modifiées de manière à ce que la séquence d’acides aminés de la protéine résultante reste inchangée. Si la séquence PAM se trouve dans l’UTR, retirez-la entièrement.
    3. Le positionnement des codons START et STOP dépend de l’emplacement de l’étiquette. Pour le marquage interne, assurez-vous que l’étiquette fluorescente est dans le cadre de la séquence codante du gène cible. Pour le marquage N-terminal, placez l’étiquette fluorescente avant le codon de départ endogène. Pour le marquage C-terminal, placez l’étiquette fluorescente avant le codon stop naturel et assurez-vous de ne conserver qu’un seul codon de départ pour éviter d’éventuels problèmes de traduction.
  5. Synthétiser l’ARNsg et les plasmides donneurs comme décrit ci-dessous.
    1. Pour la création de plasmides d’ARNsg, suivez les directives de clonage de l’ARNg U6, qui peuvent être consultées à flycrispr.org/protocols/grna/. Utiliser l’approche alternative de clonage basée sur les enzymes de restriction (appelée stratégie C dans la ressource fournie) pour insérer une séquence d’ARNg dans le plasmide pU6-BbsI-chiRNA (Addgene, #45946).
    2. Transformez en DH5a E. coli (NEB, C2987H) suivant les protocoles de transformation standard fournis par le fabricant. Pour vérification, effectuez un séquençage de Sanger sur les clones résultants à l’aide d’amorces de séquençage standard T3 ou T7.
    3. Pour la création d’un plasmide donneur, acquérir de l’ADN double brin avec la séquence donneuse souhaitée auprès de fournisseurs commerciaux (p. ex., IDT). Intégrez-le dans le site de clonage multiple pBlueScriptII SK(-). Séquencez le plasmide du donneur pour vous assurer que les séquences d’ARNsg ou de PAM sont correctement modifiées et qu’il n’y a pas de SNP présents dans le plasmide.
      REMARQUE : Une alternative à l’intégration à l’aide de pBlueScriptII consiste à PCR séparément les bras d’homologie et les segments de marqueurs fluorescents et à les consolider dans le squelette en utilisant des techniques telles que Golden Gate Assembly ou Gibson Assembly.
  6. Utilisez le schéma d’injection et de croisement suivant.
    1. Pour acquérir des mouches modifiées par la lignée germinale, co-injectez des plasmides d’ARNg et le plasmide donneur dans le fond Cas9 approprié (par exemple, nos-Cas9 III, BDSC 78782). Si vous utilisez des services d’injection commerciaux, suivez les instructions du fournisseur pour effectuer la préparation des plasmides.
      REMARQUE : En règle générale, la concentration plasmidique de l’ARNg doit dépasser 0,5 μg/μL, et la concentration plasmidique du donneur doit être supérieure à 1,0 μg/μL. Un délai commun entre l’envoi d’échantillons de plasmides et la réception d’embryons injectés est d’environ 2 semaines. Une stratégie de dépistage des événements d’édition de gènes sur le chromosome X à l’aide de la souche d’équilibrage FM7/L est présentée ici. Pour les gènes du deuxième ou du troisième chromosome, utilisez les souches d’équilibrage appropriées.
    2. Pour la collecte des mouches injectées (G0), anesthésier avec du dioxyde de carbone et séparer les mouches mâles et les femelles vierges. Établir des croisements de mouches en appariant chaque mâle G0 avec au moins deux femelles vierges FM7/L dans des flacons alimentaires individuels étroits de CT. Placer les flacons croisés dans un incubateur ventilé maintenu à 25 °C et à ~60 % d’humidité jusqu’à ce que F1 se rapproche (FM7/L est l’équilibreur du chromosome X le plus couramment utilisé). De même, associez chaque femelle G0 avec des mouches mâles FM7/Y.
    3. Anesthésier et recueillir au moins 10 descendants femelles vierges (F1) issus de croisements mâles et femelles G0. À partir de croisements femelles G0, recueillir au moins 10 mouches F1 mâles (figure 3A). Assurez-vous que chaque mouche F1 est étiquetée avec les détails de sa filiation et stockée séparément. Passez à l’étape de sélection.
  7. Utilisez le protocole PCR à une jambe suivant.
    1. Création d’amorces : Concevez une paire d’amorces englobant le site d’édition du gène cible. Idéalement, les températures de fusion des amorces devraient être similaires, autour de 55°C.
    2. Préparation du tampon de lyse : Préparez 10 μL de tampon de lyse pour chaque échantillon de mouche. Le tampon se compose de 10 mM de Tris (pH 8,2), 1 mM d’EDTA (pH 8,0), 25 mM de NaCl et 400 μg/mL de protéinase K. Préparez le tampon de lyse comme un mélange maître, puis distribuez 10 μL dans chaque puits d’une plaque de PCR à 96 puits. Assurez-vous que le tampon reste froid tout au long du processus de dissection de la jambe (Figure 3B).
    3. Installation des tubes : Préparez des tubes capillaires en verre, en remplissant une extrémité de nourriture saccharose-agar (2 % d’agar et 4 % de saccharose), et placez-les dans une plaque à 96 puits profonds, appelée l’hôtel à mouches (figure 3C).
    4. Dissection de la jambe : Placez le tampon d’anesthésie au dioxyde de carbone sous un stéréomicroscope, anesthésiez une mouche candidate et sectionnez l’une des pattes centrales. Placez la jambe dans le tampon de lyse, en assurant une immersion complète. Il n’est pas nécessaire de faire macérer la cuisse, passez directement à l’étape du protocole de lyse (Figure 3B). Tenez l’aile de la mouche avec une paire de pinces métalliques fines, déplacez la mouche vers l’hôtel à mouches et scellez immédiatement le tube avec du fil.
    5. Échantillons de contrôle : Deux mouches de type sauvage peuvent être utilisées comme témoins négatifs après la même procédure de dissection des pattes. Un plasmide de donneur dilué sert de témoin positif.
    6. Soins post-dissection : Hébergez l’hôtel des mouches dans un incubateur ventilé maintenu à 25 °C et ~60% d’humidité. Bien que les mouches puissent survivre pendant la nuit, il est recommandé d’effectuer les étapes suivantes et l’accouplement dans la même journée.
    7. Protocole de lyse : Placer les jambes coupées dans la solution tampon de lyse dans un thermocycleur réglé à 37 °C pendant 90 min, puis à 95 °C pendant 5 min, enfin maintenu à 4 °C. Cela permettra d’extraire suffisamment d’ADN de la patte unique de chaque mouche (figure 3B).
    8. Réaction PCR : Organiser la réaction PCR selon les instructions du fabricant, en utilisant 1,5 μL de lysat de la patte de mouche comme source d’ADN.
    9. Électrophorèse sur gel : Soumettre les produits PCR à l’électrophorèse sur gel d’agarose. Interprétez les résultats du gel en fonction de la taille de la bande. En règle générale, les mouches témoins négatives présentent une bande inférieure et les témoins plasmidiques positifs présentent une bande plus élevée. Assurez-vous que les tailles de bande spécifiques sont cohérentes avec la conception originale du plasmide du donneur. Les mouches positives femelles présenteront deux bandes car elles sont hétérozygotes, et les mâles positifs présenteront une seule bande (figure 3B).
      REMARQUE : Habituellement, le dépistage de 70 mouches est réalisable en une seule journée. Assurez-vous d’identifier un minimum de 10 mouches F1 positives sur 4 à 5 croisements G0 distincts, car certaines F1 peuvent être stériles en raison de mutations hors cible.
  8. Effectuez la configuration croisée post-PCR suivante.
    1. Sur la base des résultats du gel, sélectionnez les mouches positives de l’hôtel des mouches et croisez-les individuellement avec des mouches équilibrées (FM7/L pour le marquage des gènes du chromosome X) pour produire la génération F2. Une fois que la génération F2 émerge, établir des croisements de frères et sœurs pour créer des souches stables homozygotes (figure 3D).
    2. Utilisez des stocks homozygotes pour le séquençage Sanger du site d’édition afin d’assurer la précision. Recroisez des lignes de mouche validées avec des mouches de type sauvage pour éliminer les mutations de fond. Criblez chaque génération à l’aide du protocole PCR à une jambe.

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Résultats

Dans nos expériences, nous avons généralement trouvé un taux de réussite de ~20 % à 30 % dans le dépistage de divers gènes endogènes marqués sur tous les chromosomes (X, II, III). L’efficacité de ce processus peut varier en fonction de plusieurs facteurs, tels que la sélection de l’ARNg, la nature du gène et la qualité de l’injection. Nous illustrons ici les résultats de notre stratégie de marquage du gène de la période endogène avec le fluorophore mNeonGreen13<...

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Discussion

Les résultats démontrent une stratégie simplifiée et simple basée sur CRISPR en une étape pour marquer les gènes endogènes chez la drosophile. Dans le protocole, nous utilisons deux ARNg pour induire plus efficacement la cassure double brin de l’ADN et la recombinaison homologue. Les ARNg et le plasmide donneur sont injectés dans des embryons de mouches des fruits, qui expriment l’enzyme Cas9 dans leur lignée germinale. Ces embryons sont ensuite cultivés dans des conditions standard jusqu’à l’âge adulte, après q...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Nous remercions George Watase et Josie Clowney pour les discussions qui ont eu lieu au cours des premières étapes de l’élaboration du protocole. Le travail a été soutenu par des fonds du NIH (subvention n° R35GM133737 à S.Y.), de la bourse Alfred P. Sloan (à S. Y.) et du McKnight Scholar Award (à S. Y.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5M EDTA pH8.0InvitrogenAM9260G
5-alpha Competent  ;E. coli  ;( Haute efficacité)NEBC2987H
Plaque de puits profonds à 96 puitsMARQUE701354
AgarFisher ScientificBP1423-500
BbsI-HFNEBR3539S
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)Thermo ScientificK1081
D-SucroseFisher ScientificBP220-1
EcoRI-HFNEBR3101S
Acide chlorhydriqueFisher ScientificA142-212
Prolong Glass Antifade Montage MediumInvitrogenP36982
Proteinase KQIAGEN19131
Schneider’s Drosophila MediumGibco21720001
Chlorurede sodiumFisher ScientificS271-500
T4 ADN ligaseNEBM0202S
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
XbaINEBR0145S

Références

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