Ce protocole décrit l’isolement des macrophages interstitiels pulmonaires (IM) et leur transfert adoptif après stimulation IL-33 des alvéoles pulmonaires dans un modèle murin, ce qui peut faciliter l’étude in vivo de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI).
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Article de méthode
Transfert adoptif de macrophages stimulés par l’IL-33 dans des modèles murins induits par la bléomycine pour étudier leur effet sur la fibrose pulmonaire idiopathique in vivo
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Résumé
Résumé
La réponse inflammatoire causée par une lésion pulmonaire précoce est l’une des causes importantes du développement de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI), qui s’accompagne de l’activation de cellules inflammatoires telles que les macrophages et les neutrophiles, ainsi que de la libération de facteurs inflammatoires, notamment le TNF-α, l’IL-1β et l’IL-6. L’inflammation précoce causée par des macrophages interstitiels pulmonaires (IM) activés en réponse à la stimulation de l’IL-33 est connue pour jouer un rôle essentiel dans le processus pathologique de la FPI. Ce protocole décrit le transfert adoptif des IM stimulées par l’IL-33 dans les poumons de souris pour étudier le développement de la FPI. Il implique l’isolement et la culture de MI primaires à partir des poumons de souris hôtes, suivis du transfert adoptif de MI stimulés dans les alvéoles de souris receveuses de FPI induites par la bléomycine (BLM) (qui ont été précédemment appauvries en macrophages alvéolaires par un traitement avec des liposomes clodronates), et l’évaluation pathologique de ces souris. Les résultats représentatifs montrent que le transfert adoptif de macrophages stimulés par l’IL-33 aggrave la fibrose pulmonaire chez la souris, suggérant que la mise en place de l’expérience de transfert adoptif de macrophages est un bon moyen technique d’étudier la pathologie de la FPI.
Introduction
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie inflammatoire pulmonaire diffuse causée par de nombreux facteurs1. Dans le microenvironnement des cytokines de la réponse immunitaire Th1 et Th2, les macrophages peuvent être polarisés en macrophages classiquement activés (M1) et en macrophages activés (M2). Les lipopolysaccharides (LPS) ou la cytokine IFN-γ induisent les macrophages M1 à polariser et à produire des cytokines pro-inflammatoires, notamment iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α et IL-12. En revanche, les cytokines de type II IL-4 et IL-13 entraînent la polarisation des macrophages M2, qui peuvent produire différents facteurs favorisant la croissance des fibroblastes, tels que le TGF-β et le PDGF, qui favorisent la fibrose pulmonaire2. Le processus pathologique de la FPI s’accompagne d’une activation et d’une infiltration des macrophages. La FPI intervient dans la réparation des blessures, l’inflammation et la fibrose par la libération de cytokines3. Comme seules des options thérapeutiques limitées sont disponibles, l’exploration des mécanismes pathologiques moléculaires de la FPI revêt une grande importance pour le développement de nouvelles stratégies de prévention et de traitement de la FPI. Des études antérieures menées par notre groupe et d’autres chercheurs 4,5 ont confirmé la libération accrue d’IL-33 chez les patients atteints de FPI et dans des modèles murins atteints de FPI induite par la bléomycine (BLM). L’IL-33 est libérée par les cellules épithéliales et endothéliales lors de la fibrose et est impliquée dans l’activation des macrophages, entraînant la prolifération anormale des fibroblastes, l’infiltration des leucocytes et la perte éventuelle de la fonction pulmonaire5. Le protocole actuel décrit le transfert adoptif de macrophages interstitiels (IM) stimulés par l’IL-33 dans les alvéoles comme moyen d’étudier le développement de la FPI dans des modèles murins. Ici, les IM ont été isolés du tissu pulmonaire de souris hôtes, cultivés in vitro, stimulés avec de l’IL-33 pendant 24 h, puis transférés adoptivement dans les alvéoles de souris receveuses par injection trachéale. La collecte directe de macrophages de souris stimulés et leur transfert adoptif dans les alvéoles receveuses se sont avérés aggraver le degré de fibrose pulmonaire et peuvent illustrer plus clairement l’influence des facteurs stimulants sur la fibrose par rapport aux études précédentes6. La technique décrite dans cet article peut permettre aux chercheurs d’explorer la fonction des macrophages stimulés par des cytokines potentielles dans le développement de la FPI.
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Protocole
Toutes les expériences ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité d’éthique du bien-être animal expérimental de l’Université de Jiangnan (JN n n ° 20211130m1720615 [501]).
NOTE: Au total, 10 souris mâles C57BL / 6 âgées de 6 à 8 semaines et pesant 20 à 25 g ont été utilisées dans cette étude. Les trois groupes expérimentaux de l’étude comprenaient trois souris receveuses chacun, et une souris hôte a été utilisée pour l’isolement IM.
1. Déplétion des macrophages pulmonaires de souris
- Sortez le flacon de liposomes de clodronate (voir le tableau des matières) du réfrigérateur 30 minutes à l’avance, réchauffez-le à température ambiante et retournez-le plusieurs fois pour assurer un mélange uniforme.
REMARQUE: Les liposomes de clodronate encapsulent les molécules hydrophiles de bisphosphonate de dichlorométhylène. Lorsque ces liposomes sont consommés par les macrophages, le clodronate est progressivement libéré par l’action de la phosphatase lysosome, et son accumulation déclenche par conséquent l’apoptose cellulaire et l’épuisement des macrophages7. - Anesthésier les souris avec 3% d’isoflurane. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant un pied pour vérifier la conscience. Appliquez une pommade vétérinaire sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Aspirer 60 μL de liposomes de clodronate à l’aide d’une pipette munie d’un embout d’aspiration stérile. Administrer le médicament goutte à goutte dans la cavité nasale de la souris anesthésiée, de sorte que lorsque la souris inhale, le médicament est inhalé dans la trachée. Après chaque goutte, assurez-vous que la souris inhale complètement le médicament et respire uniformément. Administrer des liposomes contenant uniquement du PBS comme témoin8 (Figure 2).
- Placez les souris sur une table de température constante de 38 °C pour les réchauffer afin d’accélérer leur récupération. Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles se réveillent. Une fois que les souris se sont bien rétablies et ont atteint la position couchée sternale, transférez-les dans la cage.
- Utilisez des souris avec des macrophages alvéolaires appauvris 2 jours après le traitement avec des liposomes clodronate comme souris receveuses pour l’expérience de transfert.
NOTE: Dans cette étude, la déplétion des macrophages alvéolaires a été confirmée en vérifiant l’expression des marqueurs macrophages comme décrit précédemment 8,9 après l’administration de liposomes clodronate par inhalation (voir Figure supplémentaire 1).
2. Isolement et culture des GI
- Anesthésiez la souris hôte avec une injection intrapéritonéale de kétamine (120 mg / kg) et de xylazine (16 mg / kg). Confirmer la profondeur de l’anesthésie par la perte du réflexe de pincement des orteils. Appliquez une pommade vétérinaire sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Ensuite, désinfectez la peau de la souris anesthésiée avec 75% d’alcool et d’iode. Utilisez des ciseaux pour couper à travers la peau et exposer le tissu cardiopulmonaire
- Aspirer 10 mL de 1x PBS dans une seringue à l’aide d’une aiguille de 20 G et insérer l’extrémité de l’aiguille dans l’oreillette droite de la souris (Figure 3A). Coupez la veine cave inférieure de la souris avec des ciseaux chirurgicaux, puis perfuser manuellement la souris avec du PBS à une vitesse constante (10-20 ml / min) jusqu’à ce que le tissu pulmonaire devienne blanc. Extrayez le tissu pulmonaire et transférez-le dans du PBS glacé dans une boîte de culture (figure 3B).
- Couper le tissu pulmonaire en fragments d’environ 2 mm x 2 mm x 2 mm. Ensuite, ajoutez 15 mL de milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 1 % de collagénase A au tissu pulmonaire pour isoler les macrophages. Incuber à 100 tr/min pendant 30 min sur une table vibrante à 37 °C.
- Aspirer la suspension de tissu pulmonaire à l’aide d’une seringue de 10 ml au moins 20x pour la rendre aussi fine que possible. Filtrer cette suspension à travers une crépine cellulaire de 40 μm. Centrifuger le filtrat à 400 x g pendant 10 min et jeter le surnageant.
- Lyser les globules rouges contenus dans la pastille en ajoutant 3 mL de tampon de lyse des globules rouges (voir le tableau des matières) sur de la glace pendant 2 à 3 minutes.
- Après centrifugation à 150 x g pendant 5 min, remettre en suspension la pastille cellulaire avec 10 mL de DMEM (contenant 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine). Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Ensemencer les cellules dans des boîtes de culture cellulaire adhérentes de 10 cm à 2 x 107 cellules/plat, et incuber pendant 1 h à 37 °C et 5% de CO2. Cela permet aux IM pulmonaires d’adhérer au plat5. Après 1 h, aspirer les cellules surnageantes et flottantes et ajouter 10 mL de milieu de culture complet frais (DMEM contenant 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine). Incuber pendant plus de 8 h ou toute la nuit.
- Déterminer la pureté des IM obtenues en utilisant la cytométrie en flux avec coloration pour les marqueurs F4/80 et CD11c, comme décrit précédemment5 (voir la figure supplémentaire 1).
3. Transfert adoptif des IM dans les alvéoles pulmonaires
- Remplacer le milieu de culture de la plaque contenant les IM pulmonaires isolés (étape 2.7) par un milieu de culture complet contenant 10 ng/mL d’IL-33 pour stimuler les IM. Incuber pendant 24 h à 37 °C et 5% CO2. Utilisez 1x PBS à la place de l’IL-33 comme témoin.
- Dissocier les IM pulmonaires en les traitant avec 1 mL de trypsine à 0,25% pendant 5 min. Ensuite, éteignez la digestion en ajoutant 3 mL de milieu complet de culture fraîche, et récoltez les macrophages pulmonaires en centrifugeant la suspension cellulaire à 150 x g et 4 °C pendant 5 min. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et remettre les cellules en suspension dans le PBS jusqu’à une concentration finale de 5 x 105 cellules/50 μL.
- Anesthésier les souris receveuses avec du gaz isoflurane à 3%. Attendez que la souris devienne inconsciente (comme à l’étape 1.2), puis fixez les membres de la souris anesthésiée sur une plaque verticale avec du ruban médical. Tirez doucement la langue de la souris d’un côté à l’aide d’un coton-tige.
- Allumez la lampe d’intubation et faites-la briller sur la gorge de la souris pour que la trachée puisse être vue. Vérifiez que la trachée est proche de la base de la langue, que l’œsophage est près de l’arrière du cou, mais que l’ouverture de l’œsophage n’est pas visible pendant l’opération.
- Utilisez la lampe d’intubation (22 G) pour aider à intuber la souris. Guidez la canule à aiguille à demeure dans la trachée à l’aide d’un fil guide (0,4 mm de diamètre). Retirez le fil guide et poussez la canule dans la trachée de souris pour terminer l’intubation.
- Une fois que la canule est observée pour entrer dans la trachée, injecter 50 μL de la suspension cellulaire (contenant 5 x 105 IM) dans la souris receveuse à travers la trachée.
- Placez les souris sur un coussin chauffant constant à 38 °C pour le réchauffer afin d’accélérer la récupération. Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles se réveillent. Une fois qu’ils se sont bien rétablis et qu’ils ont atteint la position couchée sternale, transférez-les dans la cage.
- Après 24 heures, administrer de la bléomycine (BLM) par la trachée (en utilisant la procédure décrite aux étapes 3.3-3.5) à une dose de 1,4 U/kg de poids corporel pour induire la FPI. Administrer un volume égal de solution saline au groupe témoin.
- Après 21 jours, déterminer le degré de gravité de la fibrose pulmonaire pour les différents groupes de souris qui ont été transférés adoptivement avec PBS ou la suspension IM stimulée par l’IL-33 en évaluant l’expression des marqueurs de la fibrose et les scores d’Ashcroft10.
- Extraire l’ARN total du tissu pulmonaire à l’aide d’un réactif d’extraction d’ARN (voir le tableau des matériaux).
NOTE: L’analyse quantitative a été effectuée avec un lecteur de microplaques. Si le rapport OD260/OD280 est de 1,8-2,0, la pureté de l’ARN est élevée. Tous les échantillons ont été stockés à -80 ° C. - Effectuer une PCR quantitative en fluorescence pour évaluer l’expression de l’actine α-lisse, de l’actine musculaire lisse (SMA) et de la fibronectine à l’aide d’amorces spécifiques.
NOTA : Les amorces utilisées pour la α-SMA étaient avant 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACG-3' et inversée 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', et les amorces utilisées pour la fibronectine étaient avant 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' et 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3'.
- Extraire l’ARN total du tissu pulmonaire à l’aide d’un réactif d’extraction d’ARN (voir le tableau des matériaux).
- Effectuer l’immunohistochimie comme décrit ci-dessous.
- Déshydratez le poumon gauche, encastrez-le et tranchez-le avec une trancheuse à paraffine jusqu’à une épaisseur de 4 μm.
- Placer les coupes de tissu sur des lames et cuire les lames dans une étuve à 65-70 ° C pendant 30 min à 1 h. Décirer les lames avec un pourcentage décroissant d’alcool (c.-à-d. 100 %, 95 %, 90 %, 80 % et 70 % d’alcool) pendant 5 min.
- Colorer les lames dans une solution de colorant à l’hématoxyline (analytiquement pure) pendant 5 min. Ensuite, lavez les lames à l’eau du robinet. Trempez les lames dans de l’alcool d’acide chlorhydrique à 1% pendant 3 s, lavez la couleur flottante et trempez dans l’eau courante pendant 5 min. Les sections deviendront bleues.
- Tremper dans la solution d’éosine pendant 10 s à 1 min (déterminer le temps de teinture en fonction de la couleur), laver à l’eau du robinet et placer dans 70%, 80%, 95%, 100% et 100% d’alcool, respectivement, pendant 5 min chacun. Placez ensuite les lames dans des solutions de xylène I et de xylène II pendant 3 min. Après séchage, observez et prenez des photos au microscope vertical avec un film d’étanchéité adhésif neutre.
- Effectuer un score d’Ashcroft sur les sections pour indiquer la gravité de la fibrose pulmonaire10. Effectuer une analyse statistique des données à l’aide d’un test t de deux échantillons indépendants.
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Résultats
Le protocole utilisé ici est résumé dans l’organigramme de la figure 1. L’inhalation de liposomes de clodronate par le nez (Figure 2) a été utilisée pour épuiser les macrophages pulmonaires de souris adultes C57BL/6, ce qui a produit un bon modèle de souris receveuse. Les MI pulmonaires ont été isolées chez une autre souris (hôte) non traitée (figure 3A,B) et cultivées in vitro. Les macrophages isolés ont ...
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Discussion
Cette étude fournit une méthode efficace pour épuiser, isoler, cultiver et transférer les macrophages, ce qui peut aider à étudier les mécanismes de la fibrose pulmonaire chez la souris. Il existe de nombreuses méthodes pour la déplétion des macrophages de souris, telles que l’administration trachéale, l’injection de veines de la queue et l’inhalation nasale11. Cette étude a optimisé la méthode d’inhalation nasale, simple à utiliser et capable d’épuiser efficacement les macrophages pulmonaires
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Les auteurs reconnaissent le sujet spécial de la gestion de laboratoire de l’Université de Jiangnan: construction d’une bibliothèque de tranches numériques basée sur des spécimens pathologiques (JDSYS202223) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81800065).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| ; DMEM | Life technologies Biotechnology, États-Unis | 1508012 | |
| Aiguille artérielle à demeure | B Braun Melsingen AG, Allemagne | 21G15G8393 | |
| BD ; Accuri ; C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Incubateur à dioxyde de carbone | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R& D Systems, États-Unis | 1124F | |
| CD11c | R& D Systems, USA | N418 | |
| Boîte de culture cellulaire | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Liposomes de clodronate ; | Liposomes clodronates, Pays-Bas | CI-150-150 | |
| Collagénase A | Sigma-Aldrich, États-Unis | 10103578001 | |
| F4/80 | R& D Systems, États-Unis | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton, Dickinson and Company, États-Unis | 352340 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Life technologies, États-Unis | 1047571 | |
| Hématoxyline Eosin ; | Nanjing Jiancheng Technology, Chine | 06-570 | |
| LightCycler 480 Système de détection PCR | Roche, États-Unis | ||
| Facteur recombinant murin IL-33 | Peprotech, | États-Unis 210-33 | |
| Microscope Nikon | Corporation, Japon | 941185 | |
| Pénicilline, streptomycine | Life technologies, États-Unis | 877113 | |
| Phosphate tampon (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology, Chine | 1535882 | |
| Tampon de lyse RBC | Beyotime Biotechnology Company, Chine | C3702 | |
| Isolateur d’ARN | Vazyme company, Chine | R401-01-AA | Réactif d’extraction d’ARN total |
| RWD Machine d’anesthésie par inhalation | Shenzhen Rayward Life Technology, Chine | R500 | |
| Paraffine semi-automatique trancheuse | Leica, Allemagne | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japon | 410800 | |
| Trypsine 0.25 % | Life Technologies, USA | 1627172 |
Références
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Réimpressions et autorisations
Erratum
Formal Correction: Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
