Ce protocole décrit une expérience de migration in vitro adaptée à l’analyse fonctionnelle des molécules impliquées dans la migration in vivo des cellules de la crête neurale dans la matrice extracellulaire riche en hyaluronane.
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Article de méthode
In vitro Étude des effets de la matrice extracellulaire riche en hyaluronanes sur la migration des cellules de la crête neurale
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules de la crête neurale (CCN) sont des cellules hautement migratrices qui proviennent de la région dorsale du tube neural. L’émigration des NCC du tube neural est un processus essentiel pour la production de NCC et leur migration ultérieure vers les sites cibles. La voie migratoire des NCC, y compris les tissus environnants du tube neural, implique une matrice extracellulaire riche en hyaluronane (HA). Pour modéliser la migration des NCC dans ces tissus environnants riches en HA à partir du tube neural, un test de migration de substrat mixte composé d’HA (poids moléculaire moyen: 1 200-1 400 kDa) et de collagène de type I (Col1) a été établi dans cette étude. Ce test de migration démontre que les cellules de la lignée cellulaire NCC, O9-1, sont hautement migratrices sur le substrat mixte et que le revêtement HA est dégradé au site des adhérences focales au cours de la migration. Ce modèle in vitro peut être utile pour explorer davantage la base mécaniste impliquée dans la migration des CCN. Ce protocole est également applicable à l’évaluation de différents substrats comme échafaudages pour étudier la migration NCC.
Introduction
Les cellules de la crête neurale (CCN) sont une population cellulaire multipotente présente dans les embryons en développement, et elles proviennent de la bordure de la plaque neurale pendant la neurulation. Ils contribuent à la formation d’une variété de tissus, y compris le système nerveux périphérique, le système cardiovasculaire, les tissus craniofaciaux et le squelette1. Après induction et spécification NCC à la frontière de la plaque neurale, les NCC émigrent du neuroépithélium et migrent vers les sites tissulaires dérivés de NCC1.
L’hyaluronane (HA) est un glycosaminoglycane non sulfaté....
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Protocole
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’École supérieure de médecine dentaire de l’Université d’Osaka.
1. Culture de cellules de crête neurale crânienne de souris
REMARQUE : La lignée cellulaire de crête neurale utilisée dans cette étude comprend des cellules O9-1, dérivées à l’origine de Wnt1-Cre; Cellules exprimant R26R-GFP isolées à partir d’embryons de souris E8.512 (voir discussion). La méthode décrite ici pour la culture de cellules O9-1 suit un protocole préalablement établi13.
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Résultats
Un essai de migration a été réalisé sur des substrats mixtes composés de Col1 et de HA de haut poids moléculaire (poids moléculaire moyen : 1 200-1 400 kDa) en utilisant le protocole décrit ici. On a constaté que les cellules O9-1 à la limite de l’écart migraient facilement dans l’espace riche en HA (figure 4). L’immunomarquage d’un marqueur de l’AF, la vinculine14, a confirmé que les cellules O9-1 formaient des adhérences focales (AF) aux sites de dégradation de l’AH.......
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Discussion
Diverses composantes de l’ECM régissent l’émigration et la migration des CCN. Par exemple, HA réglemente positivement la migration NCC 2,15. Fait intéressant, une étude basée sur des modèles génétiques murins de Tmem2, une hyaluronidase de surface cellulaire, a élucidé la nécessité de la dégradation de l’HA dans la migration NCC9. Les collagènes sont également abondants dans l’ECM entourant le tube neural16. Il a ét.......
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Déclarations de divulgation
L’auteur déclare qu’il n’existe pas d’intérêts concurrents.
Remerciements
J’exprime ma grande gratitude à Fumitoshi Irie et Yu Yamaguchi pour leurs encouragements et leurs aimables suggestions dans l’établissement de cette méthode. Ce travail a été soutenu par des subventions pour des programmes de recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science (#19KK0232 à T.I., #20H03896 à T.I.). La méthode originale pour le revêtement de l’AH sur des substrats de verre et les essais de dégradation in situ de l’AH sur les substrats ont été décrits dans Yamamoto et coll. (2017)8, tandis que la méthode de préparation de substrats mixtes HA/Col1 a été décrite dans Irie et coll. (2021)7.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plat de culture cellulaire de 10 cm | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. Non. BSS-1005-B | |
| Inserts de culture à 2 puits | ibidi | Cat. N° 80209 | |
| Chèvre anti-souris IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | anti-souris dérivé de la chèvre |
| Bio-Rad | Cat. Non. TC20 | ||
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Milieu de congélation cellulaire |
| collagène type I | Sigma | Cat. N° 08-115 | |
| Cellule complète ES Medium | Millipore | Cat. Non. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco' s Eagle Medium modifié ; | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Sérum fœtal bovin | Gibco | Cat. 10270106 | |
| microscope à fluorescence | Keyence | Cat. Non. BZ-X700 | |
| Fluoresent marqué HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Plat à fond en verre | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldéhyde | Sigma | Cat. N° G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. Non. CB-40234 | L’anticorps |
| monoclonal anti-vinculine | Sigma | Cat. Non. V9264 | |
| support de montage | Dako | S3023 | |
| Sérum de chèvre normal | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cellules | Millipore | Cat. Non. SCC049 | |
| Paraformaldéhyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triéthoxysilane | Sigma | Cat. N° 390143 | |
| trypsine-EDTA | Millipore | Cat. Non. SM-2003-C |
Références
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326(2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is req....
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Réimpressions et autorisations
