Le présent protocole décrit une méthode efficace pour l’acquisition dynamique et en temps réel des courants des canaux potassiques voltage-dépendants (Kv) dans les cardiomyocytes H9c2 en utilisant la technique de patch-clamp à cellules entières.
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Article de méthode
Enregistrement du courant de potassium voltage-dépendant sur les cardiomyocytes H9C2 via la technique de patch-clamp à cellules entières
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Les canaux potassiques sur la membrane cellulaire du myocarde jouent un rôle important dans la régulation des activités électrophysiologiques cellulaires. Étant l’un des principaux canaux ioniques, les canaux potassiques voltage-dépendants (Kv) sont étroitement associés à certaines maladies cardiaques graves, telles que les lésions myocardiques induites par les médicaments et l’infarctus du myocarde. Dans la présente étude, la technique de patch-clamp à cellules entières a été utilisée pour déterminer les effets de 1,5 mM de 4-aminopyridine (4-AP, un inhibiteur des canaux potassiques à large spectre) et d’aconitine (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM et 200 μM) sur le courant du canal Kv (IKv) dans les cardiomyocytes H9c2. Il a été constaté que la 4-AP inhibait le I Kv d’environ 54%, tandis que l’effet inhibiteur de l’AC sur le IKv montrait une tendance dose-dépendante (aucun effet pour 25 μM, taux inhibiteur de 30% pour 50 μM, taux inhibiteur de 46% pour 100 μM et taux inhibiteur de 54% pour 200 μM). En raison des caractéristiques de sensibilité et de précision plus élevées, cette technique favorisera l’exploration de la cardiotoxicité et des effets pharmacologiques de l’ethnomédecine ciblant les canaux ioniques.
Introduction
Les canaux ioniques sont des protéines intégrées spéciales intégrées dans la bicouche lipidique de la membrane cellulaire. En présence d’activateurs, les centres de ces protéines intégrées spéciales forment des pores hydrophiles hautement sélectifs, permettant aux ions d’une taille et d’une charge appropriées de passer à travers de manière passive1. Les canaux ioniques sont à la base de l’excitabilité cellulaire et de la bioélectricité et jouent un rôle clé dans une variété d’activités cellulaires2. Le cœur fournit du sang à d’autres organes par des contractions régulières résultant d’un processus couplé excitation-contr....
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Protocole
Les cardiomyocytes H9c2 de rat obtenus commercialement (voir le tableau des matières) ont été incubés dans du DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2. La technique de patch-clamp à cellules entières a ensuite été utilisée pour détecter les changements dans IKv dans les cellules H9c2 normales et les cellules traitées 4-AP- ou AC (Figure 1 et Figure 2).
1. Préparation de la solution
- Préparer le milieu ....
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Résultats
Ce protocole a permis l’enregistrement du IKv selon les paramètres définis dans la technique du patch-clamp à cellules entières. Le IKv a été déclenché par 150 ms de stimulus d’impulsion dépolarisant de −40 à +60 mV à un potentiel de maintien de −60 mV (Figure 3A). Le IKv des cardiomyocytes H9c2 du rat est d’abord apparu autour de -20 mV, puis l’amplitude a augmenté avec la dépolarisation. La relation moyenne entre le IKv et le potentiel membranair.......
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Discussion
La technique électrophysiologique patch-clamp est principalement utilisée pour enregistrer et refléter l’activité électrique et les caractéristiques fonctionnelles des canaux ioniques sur la membrane cellulaire25. À l’heure actuelle, les principales méthodes d’enregistrement de la technique patch-clamp comprennent l’enregistrement monocanal et l’enregistrement de cellules entières26. Pour le mode cellule entière, la microélectrode de verre et la pression négative sont utili.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous apprécions le soutien financier de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82130113) et du programme clé de R&D et de transformation du Département des sciences et de la technologie de la province du Qinghai (2020-SF-C33).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 4-Aminopyridine | Sigma | MKCJ2184 | |
| Aconitine | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | DSTDW000602 | |
| Amplificateur | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
| Balance Analytique | Sartorius | 124S-CW | |
| ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
| Verre borosilicaté avec filament (D.E. : 1,5 mm, D.I. : 1,10 mm, longueur 10 cm) | Sutter Instrument | 163225-5 | |
| Boîte de culture cellulaire (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Boîte de culture cellulaire (35 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
| Clampex software | Molecular Devices, LLC. | Version 10.5 | |
| Logiciel Clampfit | Molecular Devices, LLC. | Édition 10. 6. 0. 13 | logiciel d’acquisition de données |
| D-(+)-glucose | Rhawn | RH289133 | |
| Appareil photo numérique | Hamamatsu | C11440 | |
| Numériseur | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium (1x) | Gibco | 8121587 | |
| EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
| Sérum fœtal bovin | Gibco | 2166090RP | |
| Extracteur de micropipette flamboyant/brun | Sutter Instrument | Modèle P-1000 | |
| H9c2 cellules | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
| HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
| HCl | Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
| HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd | 20210221 | |
| KCl | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020082501 | |
| KOH | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020112601 | |
| MgCl2 | Tianjin Guangfu Institut de recherche en chimie fine | 20160408 | |
| MgCl2· ; 6H2O | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2021020101 | |
| Micromanipulateur | Sutter Instrument | MP-285A | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Verre de couverture de microscope (20 × ; 20 mm) | Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd | 80340-0630 | |
| Milli-Q | Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd | Milli-Q IQ 7005 | |
| MultiClamp 700B commander | Axon Instrument | MultiClamp commander 2.0 | logiciel d’amplification de signal. |
| Logiciel OriginPro 8 | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Pénicilline-Streptomycine (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| PH ; mètre ; | Mettler Toledo | S201K | |
| Saline tamponnée au phosphate (1x) | Gibco | 8120485 | |
| Trypsine 0,25 % (1x) | HyClone | J210045 |
Références
- Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
- Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. <....
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Réimpressions et autorisations
