Article de méthode

Stratégies de criblage de petites molécules, de l’identification des prospects à la validation

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DOI :

10.3791/64811

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20 janvier 2023

1Department of Cancer Biology, Chemical Biology Program, Dana-Farber Cancer Institute

Dans cet article

Résumé

ARTICLES DISCUTÉS :

Festa, F., Labaer, J. Criblage d’inhibiteurs de kinase dans des microréseaux de protéines humaines auto-assemblés. Journal des expériences visualisées. 152, e59886 (2019).

Stockman, B. J. et al. Dosages d’activité basés sur la RMN pour déterminer l’inhibition des composés, les valeurs IC50, l’activité artificielle et l’activité des cellules entières des ribohydrolases nucléosidiques. Journal des expériences visualisées. 148, e59928 (2019).

Gao, S. et al. Un test à haut débit pour la prédiction de la toxicité chimique par profilage phénotypique automatisé de Caenorhabditis elegans. Journal des expériences visualisées. 145, e59082 (2019).

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Utilisation de l’imagerie à haut contenu pour quantifier l’engagement de la cible dans les cellules adhérentes. Journal des expériences visualisées. 141, e58670 (2018).

Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Un test de luciférase à haut débit pour évaluer la protéolyse de la protéase à renouvellement unique PCSK9. Journal des expériences visualisées. 138, e58265 (2018).

Sullivan, C. et al. Utilisation de modèles de poissons-zèbres d’infections par le virus de la grippe A humaine pour dépister les médicaments antiviraux et caractériser les réponses des cellules immunitaires de l’hôte. Journal des expériences visualisées. 119, e55235 (2017).

Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Évaluation de la résistance aux inhibiteurs de la tyrosine kinase par une interrogation des voies de transduction du signal par des réseaux d’anticorps. Journal des expériences visualisées. 139, e57779 (2018).

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. Une adaptation à semi-haut débit du test ATPase couplé au NADH pour le criblage d’inhibiteurs de petites molécules. Journal des expériences visualisées. 150, e60017 (2019).

Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Développement d’inhibiteurs des interactions protéine-protéine par REPLACE : Application à la conception et au développement d’inhibiteurs de CDK compétitifs non ATP. Journal des expériences visualisées. 104, E52441 (2015).

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification des médiateurs de la signalisation des récepteurs des lymphocytes T via le criblage de banques d’inhibiteurs chimiques. Journal des expériences visualisées. 143, e58946 (2019).

Takakusagi, Y. Stratégie de biopanning et d’analyse bioinformatique à haut débit basée sur des biocapteurs pour la validation globale des interactions médicament-protéine. Journal des expériences visualisées. 166, e61873 (2020).

Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. Profilage cellulaire à haut débit de composés de dégradation protéique ciblés à l’aide de lignées cellulaires HiBiT CRISPR. Journal des expériences visualisées. 165, e61787 (2020).

Éditorial

La révolution de la génomique a permis d’acquérir une vaste quantité de connaissances sur l’association entre les perturbations génétiques et les différents phénotypes de maladies1. Cela a conduit à l’annotation de nombreuses protéines comme cibles médicamenteuses potentielles et a suscité l’intérêt pour la découverte et le développement de composés qui inhibent ces cibles2. Dans ce contexte, différentes stratégies de criblage sont apparues comme des approches importantes pour la découverte de composés à succès, la validation des cibles, la mesure des affinités de liaison, la sélectivité, la toxicité et l’engagement de la cible dans les cellules, ainsi que la réactivité, la stabilité et les propriétés pharmacocinétiques des composés. Cette collection capture certaines des avancées méthodologiques dans ce domaine dans le but de présenter une multitude de stratégies qui peuvent être utilisées pour cribler et évaluer l’activité biochimique et/ou biologique de petites molécules.

Les protéines kinases représentent une grande famille d’enzymes avec plus de 500 membres. Ces enzymes sont des régulateurs clés de tous les processus cellulaires, et leur dysfonctionnement a été lié à de nombreuses maladies3. Par conséquent, ils ont fait l’objet d’un intérêt intense pour la découverte de médicaments et, par extension, le développement de méthodologies. Ainsi, quatre articles de cette collection rendent compte des avancées dans ce domaine. Festa et al. décrivent une plateforme de criblage pour la découverte d’inhibiteurs de kinases qui utilise des réseaux de protéines programmables d’acides nucléiques (NAPPA) auto-assemblés4. Ces réseaux affichent des kinases humaines sur toute la longueur et permettent un criblage multiplexé de composés dans une grande collection de kinases, permettant ainsi non seulement d’identifier les hits, mais aussi de profiler la sélectivité. Tieman et al. décrivent une méthode basée sur des microréseaux de phosphoanticorps développée pour dépister les changements à l’échelle cellulaire de l’état de phosphorylation en tant que lecture de l’activité inhibitrice de la kinase5. Cela peut conduire à des informations sur la nature des voies qui sont devenues résistantes à l’inhibition, ce qui est un paramètre important pertinent pour comprendre la réponse et l’efficacité des médicaments. Chen et al. décrivent un test de cytométrie en flux pour le criblage de collections d’inhibiteurs de kinases afin d’identifier les composés qui affectent la signalisation du récepteur des lymphocytes T (TCR)6. Cette stratégie a conduit à l’identification rapide des kinases impliquées dans la signalisation TCR, indiquant leur potentiel en tant que cibles pour le développement de médicaments immunothérapeutiques. Enfin, l’activité de nombreuses kinases est régulée par des interactions protéine-protéine (IPP), ce qui suggère que les composés qui ciblent ces IPP pourraient être intéressants. Nandha Premnath et al. décrivent une méthode appelée REPLACE (remplacement par des alternatives de ligands partiels à l’aide de l’enrichissement informatique) qui peut être utilisée pour développer des IPP de kinases compétitives non ATP en convertissant les caractéristiques des liants peptidiques en petites molécules qui engagent la même surface de liaison7.

En plus des kinases, de nombreuses autres enzymes jouent un rôle dans la maladie et ont été étudiées dans la découverte de médicaments. Par conséquent, les méthodes optimisées pour les enzymes autres que les kinases sont également intéressantes. Par exemple, Stockman et al. décrivent des tests d’activité basés sur la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) pour découvrir et évaluer les inhibiteurs des ribohydrolases nucléosidiques du parasite Trichomonas vaginalis8. Ces dosages peuvent également être utilisés pour la détermination des valeurs IC50 . Pour dépister les inhibiteurs de l’ATPase, Radnai et al. ont mis au point une méthode de criblage à semi-haut débit qui utilise un format de dosage enzymatique couplé impliquant deux enzymes (pyruvate kinase et lactate déshydrogénase) qui traduit finalement l’activité de l’ATPase en fluorescence intrinsèque du nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) sous forme de lecture9. Contrairement à toutes les enzymes décrites jusqu’à présent qui sont processives et catalysent plusieurs étapes, la proprotéine convertase subtilisine/kexine de type 9 (PCSK9) est une protéase à renouvellement unique qui est auto-inhibée par son substrat. Cela rend difficile le dépistage des inhibiteurs de PCSK9, et Chorba et al. décrivent une méthode à haut débit basée sur les cellules qui relie l’activité de clivage de la PCSK9 à l’activité de la luciférase sécrétée en tant que lecture, permettant ainsi le dépistage des inhibiteurs10.

En plus de trouver des composés qui inhibent l’activité de diverses cibles, les tests qui confirment que le composé engage sa cible prévue dans les cellules sont également d’un grand intérêt. Axelsson et al. décrivent une stratégie de validation de l’engagement de la cible dans les cellules adhérentes basée sur la combinaison d’une imagerie à haut contenu par des anticorps immunofluorescents et d’un test de décalage thermique cellulaire (CETSA)11. Ce test utilise un défi thermique isotherme aux cellules traitées avec une grande collection de composés pour identifier les composés stabilisants. Une méthode permettant d’évaluer l’engagement et l’activité des molécules dégradatrices, développée par Riching et al., utilise la technologie de marquage HiBiT/LgBiT pour produire une protéine luminescente et surveiller les paramètres de dégradation via une diminution de la luminescence12. Enfin, Takakusagi et al. décrivent une méthode de validation des interactions protéine-médicament qui repose sur l’utilisation d’affichages peptidiques basés sur des phages pour dépister la liaison entre les motifs peptidiques de liaison aux médicaments et les petites molécules13. L’écran d’affichage des peptides est combiné à une analyse bioinformatique pour valider la liaison de la cible.

Une autre couche de la validation des petites molécules est la caractérisation de leurs effets dans des modèles animaux. Cette collection comprend deux méthodes de ce type, l’une qui utilise des modèles de poisson-zèbre (Danio rerio) d’infection par le virus de la grippe A humaine pour évaluer l’efficacité des composés ayant une activité antivirale, ainsi que la réponse immunitaire de l’hôte14, et l’autre qui utilise Caenorhabditis elegans comme modèle pour profiler la toxicité des composés15. Ces deux études soulignent la nécessité de méthodes optimisées capables d’évaluer l’efficacité et la toxicité in vivo.

En conclusion, la découverte et le développement de médicaments sont des processus redoutables avec de nombreux goulets d’étranglement, des défis et une forte probabilité d’échec. De plus, le fardeau continu des maladies, que ce soit dans le domaine des maladies infectieuses où le nombre d’agents pathogènes résistants aux médicaments augmente à un rythme alarmant, ou dans les régions où la prévalence des maladies chroniques et des maladies associées au vieillissement de la population augmente, exige notre attention et notre action ciblées. Cette collection met en évidence plusieurs méthodes qui visent à accélérer la découverte, la validation et la caractérisation des médicaments. À l’avenir, nous nous attendons à voir d’autres innovations dans ce domaine, en particulier celles visant à améliorer le débit du criblage, à accroître la diversité des chimiothèques et à développer des modèles in vivo compatibles avec le criblage à haut débit (HTS). De plus, les flux de travail qui fournissent une vue holistique de la puissance, de la sélectivité, de la spécificité, de l’efficacité et de la toxicité à une échelle plus rapide et plus petite pourraient être particulièrement habilitants.

Déclarations de divulgation

M.K. est consultant rémunéré pour Life Science Editors.

Remerciements

M.K. est en partie pris en charge par le NCI T32 CA236754.

Références

  1. Vincent, F., et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nature Reviews Drug Discovery. , (2022).
  2. Ha, J., Park, H., Park, J., Park, S. B. Recent advances in identifying protein targets in drug discovery. Cell Chemical Biology. 28, 394-423 (2021).
  3. Attwood, M. M., et al. Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design. Nature Reviews. Drug Discovery. 20, 839-861 (2021).
  4. Festa, F., Labaer, J. Kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays. Journal of Visualized Experiments. (152), e59886(2019).
  5. Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays. Journal of Visualized Experiments. (139), e57779(2018).
  6. Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of mediators of T-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries. Journal of Visualized Experiments. (143), e58946(2019).
  7. Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of inhibitors of protein-protein interactions through REPLACE: Application to the design and development non-ATP competitive CDK inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (104), e52441(2015).
  8. Stockman, B. J., et al. NMR-Based activity assays for determining compound inhibition, IC50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases. Journal of Visualized Experiments. (148), e59928(2019).
  9. Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A semi-high-throughput adaptation of the NADH-coupled ATPase assay for screening small molecule inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (150), e60017(2019).
  10. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease PCSK9. Journal of Visualized Experiments. (138), e58265(2018).
  11. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (141), e58670(2018).
  12. Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using HiBiT CRISPR cell lines. Journal of Visualized Experiments. (165), e61787(2020).
  13. Takakusagi, Y. Biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions. Journal of Visualized Experiments. (166), e61873(2020).
  14. Sullivan, C., et al. Using zebrafish models of human influenza A virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses. Journal of Visualized Experiments. (119), e55235(2017).
  15. Gao, S., et al. A high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by Automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (145), e59082(2019).

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Mots-clés

Validation StrategiesKinase Inhibitor ScreeningNMR based Activity AssaysChemical Toxicity PredictionAutomated Phenotypic ProfilingHigh Content ImagingLuciferase AssayAntiviral Drug ScreeningProtein protein Interaction InhibitorsChemical Inhibitor LibrariesDrug protein InteractionsT cell Receptor Signaling

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